全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 253~262 253
收稿 2014-01-01　　修定 2014-01-24
资助 国家自然科学基金(31170290)和中科院青促会项目。
* 共同通讯作者(E-mail: ffl@sicau.edu.cn, Tel: 028-86290916;
E-mail: yuanqin2005@gmail.com, Tel: 021-54924312)。
拟南芥温度诱导脂质运载蛋白TIL1参与雌配子体发育
常小艳1,2, 赵丽华2, 付凤玲1,*, 秦源2,*
1四川农业大学玉米研究所, 成都611130; 2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海200032
摘要: 雌配子体的正常发育是种子形成的前提条件之一, 拟南芥温度诱导的脂质运载蛋白编码基因TIL1突变使胚珠败育,
结实率下降明显。基因表达分析表明T-DNA插入使得TIL1基因敲除, 突变体TIL1基因功能缺失; 互交实验、Alexander染
色、花粉离体培养和胚珠透明实验结果表明til1-1突变体雄配子体发育正常、雌配子体胚囊发育有缺陷; 通过遗传互补实
验证明外源克隆的TIL1基因能恢复突变体的败育表型, 并确定了TIL1基因主要在胚珠的胚囊中表达。实验结果表明TIL1
基因参与了植物雌配子体发育这一重要的生理过程。
关键词: 拟南芥; TIL1; 结实率; 雌配子体发育
Temperature-Induced Lipocalin TIL1 Is Required for Female Gametophyte
Development in Arabidopsis
CHANG Xiao-Yan1,2, ZHAO Li-Hua2, FU Feng-Lin1,*, Qin Yuan2,*
1Maize Research Institute of Sichuan Agriculture University, Chengdu 611130, China; 2Institute of Plant Physiology and Ecology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: Mature female gametophyte formation is one of the prerequisites for seed formation. Mutation in a
gene called TIL1 which encodes a temperature-induced lipocalin causes ovule abortion and subsequent low
seed set in Arabidopsis thaliana. Gene expression analysis indicates T-DNA insertion is localized in TIL1 gene
and results in loss of function of TIL1. Reciprocal cross, Alexander staining, pollen growth in vitro, and whole-
mount ovule clearing results showed that the development of male gametophyte was normal but the female
gametophyte development was defective in til1-1 mutant. Genetic complementation experiments with
ProTIL1:TIL1-GFP demonstrated that til1-1 mutation phenotype was resulted from lossing function of TIL1,
which was expressed in the embryo sac of ovule. Taken together, we conclude that the gene TIL1 plays an
important role in the female gametophyte development.
Key words: Arabidopsis thaliana; TIL1; seed set; female gametophyte development
脂质运载蛋白是一种细胞外小蛋白, 分布在
质膜的周围并广泛存在于细菌、原生生物、节肢
动物、脊索动物和植物中, 超过40种脂质蛋白现
已被鉴定出来(Flower 1996; Charron等2005; Sanchez
等2006)。植物中的脂质运载蛋白包括叶绿体脂质
运载蛋白(chloroplastic lipocalins, CHLs)和温度诱
导的脂质运载蛋白(temperature-induced lipocalin,
TILs)。在单子叶植物如小麦中TILs基因有2个拷
贝TIL1和TIL2, TIL1参与温度胁迫调控机制, TIL2
则与温度胁迫调控没有关联。拟南芥中的脂质蛋
白只有一种, 并且与小麦中的TIL1蛋白的氨基酸
序列具有很高的相似性, 因此拟南芥中的温度诱
导的脂质运载蛋白称为TIL1 (Charron等2005)。
拟南芥TIL1基因参与的逆境胁迫调控不仅包
括对温度胁迫的调控, 还包括对光照、高盐和氧
化物等胁迫的调控。环境温度过高或过低时, 拟
南芥TIL1基因表达量上调, 调控温度响应机制使植
物适应高温或低温环境。TIL1基因突变, 拟南芥对
温度变化敏感, TIL1基因过量表达拟南芥的耐热性
则没有加强(Charron等2002; Kawamura和Uemura
2003; Chi等2009); 黑暗处理的突变体幼苗则表现
出对光的敏感性和下胚轴变短的表型(Charron等
2008); 盐胁迫下, 突变体的生长和生物学产量都受
到影响, TIL1蛋白能够易位至叶绿体中通过调节
离子平衡而保护叶绿体不受损伤(Brinker等2010;
Abo-Ogiala等2013)。
植物生理学报254
目前关于TIL1基因参与植物的各种逆境胁迫
的机制尚不清楚, TIL1在拟南芥雌配子体发育的研
究则几乎没有文献报道, 本次实验通过对拟南芥
TIL1基因突变体进行结实表型观察发现, TIL1基
因的功能缺失导致til1-1突变体种子败育, 结实率
下降。
配子体的正常发育是被子植物进行有性生殖
的基础, 雄配子体和雌配子体分别在花药和胚珠
中发育形成, 通过双受精过程, 雌雄配子体结合形
成合子, 合子再经过细胞分裂和细胞分化最后形
成成熟的胚胎或种子。拟南芥雌配子体发育包括
大孢子发生和雌配子体发生两个阶段(Russell 1993):
二倍体大孢子母细胞进行一次减数分裂, 形成4个
单倍体大孢子细胞, 近珠孔端的3个大孢子细胞凋
亡, 仅合点端的大孢子存活, 发育为功能大孢子并
参与雌配子体发生; 功能大孢子形成后连续进行3
次胞质不分裂的有丝分裂, 胚囊细胞的细胞核移
位和细胞分化, 最终形成七细胞八核的成熟胚囊
结构(Schneitz等1995; Yadegari和Drews 2004)。
实验通过遗传学、分子生物学和细胞生物学
等方法证明了拟南芥编码温度诱导的脂质运载蛋
白TIL1参与拟南芥的雌配子体发育的过程, 而不
影响雄配子体的发育, 并对TIL1基因参与雌配子体
发育的机理做了合理的分析和探讨。
材料与方法
1 实验材料与试剂
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为
Columbia-0生态型, 拟南芥TIL1基因T-DNA插入的
突变体种子Salk_136775c购于拟南芥生物资源中
心(Arabidopsis Biological Resource Center)。拟南
芥培养条件: 温度22 ℃, 相对湿度70%, 光周期16 h
光照/8 h黑暗, 光强125 µmol·m-2·s-1。
高保真酶Prime STAR购于TaKaKa公司; pENTR
TOPO载体 , 载体构建BP、LR反应试剂盒购于
Invitrogen公司; pGWB651载体由Tsuyoshi Nakagawa
(杨贞标课题组)提供; 卡那霉素(kanamycin)和盐酸
大观霉素(spectinomycin hydrochloride)抗生素购于
Sigma公司; DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购
自Axygen公司; RNA提取试剂盒购于OMEGA公
司; RNA一步法反转录试剂盒购于TransGen公
司。实验中的引物用Primer Premier 5.0软件设计,
在Invitrogen公司合成, 相关序列测序在华大基因
公司完成。
2 实验方法
2.1 纯合突变体的鉴定和表型观察
突变体Salk_136775c的T-DNA插入结构示意
图如下, 纯合突变体的鉴定用“三引物法”, 引物序
列LBb1.3、LP和RP由拟南芥网站(http://signal.
salk.edu/tdnaprimers.2.html)提供, TIL1纯合突变体
命名为til1-1。观察til1-1表型, 取来源于不同植株
的til1-1突变体成熟角果20个, 在解剖镜下进行解
剖观察, 记录角果内种子数目, 统计结实率。
2.2 til1-1突变体的TIL1基因表达分析
取拟南芥WT和til1-1花序分别进行RNA的提
取并进行反转录合成cDNA, 半定量RT-PCR和荧光
实时定量Q-PCR分析均以第一链cDNA为模板。
半定量RT-PCR用引物TIL1-F (5-ATGACAG-
AGAAGAAAGAGATGGAA-3)和TIL1-R (5-
TCATTTGCCGAAGAGAGATTTGAA-3)进行扩
增, AtActin7为内参基因, 对应引物为Actin7-F (5-
TGTTCCCAAGTATTGTTGGTCGTC-3 )和
Actin7-R (5-TGCTGAGGGATGCAAGGATTGATC-
3), 扩增目的片段产物为561 bp。RT-PCR反应程
序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s,
共35个循环; 72 ℃ 10 min; 16 ℃ 10 min。荧光实
时定量Q-PCR 用引物TIL1-F (5-GCAACGGG-
A A G A G G G G T T T TAT- 3 )和T I L 1 - R ( 5 -
GATTGGGAGGAAAGGAGGGACA-3) 进行扩
增, AtActin7为内参基因, 对应引物Actin7-F (5-
GTATTGTGCTCGATTCTGGTGA-3)和Actin7-R
(5-TTCCCGTTCTGCGGTAGTGG-3), 扩增目的
片段产物为107 bp。Q-PCR反应程序: 95 ℃ 30 s;
图1 T-DNA插入TIL1基因的结构示意图
Fig.1 The schematic structure of T-DNA insertion in TIL1
genomic DNA
常小艳等: 拟南芥温度诱导脂质运载蛋白TIL1参与雌配子体发育 255
95 ℃ 5 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 25 s, 共40个循环; 70 ℃
5 s; 92 ℃ 5 s。
2.3 til1-1突变体的互交实验
实验分3组分别进行人工授粉杂交: 第1组, 以
去除雄蕊的til1-1突变体的雌蕊为母本、野生型拟
南芥的雄蕊为父本, 编号为A, ♀til1-1×♂WT; 第2
组, 以纯合的ms-1 (Wilson等2001)雌蕊为母本、
til1-1突变体的雄蕊为父本, 编号为B, ♀ms-1×♂
til1-1; 第3组, 作为第1组和第2组的对照实验, 以纯
合的ms-1雌蕊为母本、野生型拟南芥的雄蕊为父
本, 编号为CK, ♀ms-1×♂WT。
每组实验15个重复, 授粉1周后, 在解剖镜下
观察授粉杂交的角果, 统计其结实并记录。
2.4 til1-1突变体花粉的Alexander染色和离体培养
分别选取拟南芥WT和til1-1正处于12期的花
蕾(Smyth等1990), 去其花萼、花瓣和柱头, 留下花
药。卡诺固定液室温固定2 h, 再用染色液65 ℃水
浴20 min进行染色并制片, 放置于LEICA DM6000B
显微镜下进行观察并拍照。染色方法参考Peterson
等(2010)文献。
从拟南芥WT和til1-1植株上, 选择正在盛开的
花, 将其花药分别均匀涂布于花粉培养基(Fan等
2001)表面, 28 ℃培养箱培养5~6 h, Olympus IX81
显微镜下观察, 并分别记录拟南芥WT和突变体
til1-1各2 000粒花粉的萌发情况。
2.5 til1-1突变体胚珠的整体透明观察
分别选取来源于不同植株的拟南芥花序, 拟
南芥WT和til1-1植株花序各5个, FAA固定液室温
固定24 h, 解剖镜下透明液处理15 min再小心压片,
使胚珠从雌蕊中分散开, 用LEICA DM6000B显微
镜进行相差干涉显微观察, 记录胚珠发育的时期
并拍照保存。
2.6 til1-1突变体TIL1基因遗传互补实验
TIL1基因克隆引物为: TIL1-F (5-CACCAA-
GGTCTCACTAGGGAAAACG-3)和TIL1-R (5-
TTTGCCGAAGAGAGATTTG-3), 克隆片段长
2 660 bp, 包含TIL1基因的基因组序列1 149 bp和其
上游的启动子序列1 511 bp。载体构建用gateway
系统, 包括BP反应和LR反应, 方法参考Invitrogen
公司的Gateway® Technology with Clonase™ II手
册。入门载体用pENTR TOPO, 目的载体pGWB651
在细菌中是盐酸大观霉素抗性, 在植物中为Basta
抗性。
重组质粒ProTIL1:TIL1-GFP测序确认后, 进
行农杆菌GV3101感受态细胞转化并扩大培养, 花
序浸染法进行til1-1突变体的转化。用0.1% Basta
液体喷湿进行转基因阳性初步筛选, 再提取阳性
苗幼叶的DNA进行进一步的GFP标签分子鉴定。
观察T2代幼苗和胚珠的GFP荧光信号、角果结实
表型和统计种子的结实率。
实验结果
1 til1-1突变体的育性降低
til1-1突变体的结实观察发现其角果有明显败
育表型(图2-A), 结实率t-test检验表明, til1-1的结实
率81.43%, 与WT结实率98.15%差异极其显著(图
2-B)。通过观察败育的胚珠, 发现角果中没有发育
成种子的胚珠为白色小点, 推测败育的胚珠可能
是由于雌、雄配子体发育有缺陷, 不能成功进行
双受精作用而导致, 或者雌、雄配子体发育正常,
但雌、雄配子体结合形成合子的早期发育有缺陷
而不能正常发育导致。
2 til1-1突变体TIL1基因敲除
为了进一步研究TIL1基因可能参与拟南芥种
子形成的功能, 首先分析了til1-1突变体TIL1基因
的表达情况, 以确定是否由于T-DNA的插入降低
了该基因的表达或者造成了该基因的敲除。
til1-1突变体花序总RNA半定量RT-PCR结果
显示: TIL1在野生型拟南芥WT中正常表达, 而在
til1-1突变体中的表达量几乎检测不到(图3-A); 定
量Q-PCR也未检测到TIL1基因在突变体中的表达
(图3-B)。因此T-DNA插入TIL1基因, 使TIL1基因
敲除, TIL1基因功能完全丧失, 最终出现突变体结
实率下降表型。
3 互交实验表明til1-1育性缺陷可能来源于雌配子体
互交角果结实率分别为: A组(♀til1-1×♂WT)
77.40%, B组(♀ms-1×♂til1-1) 91.18%, CK组(♀ms-
1×♂WT) 93.26% (图4)。
通过互交结实率结果, 可以判断败育的胚珠
不是来源于合子早期发育的缺陷, 而是来源于突
变体的雌配子或者雄配子体的发育缺陷, 否则3组
互交角果的结实率数值应该一致。
植物生理学报256
结实率t-test检验表明: A组结实率74.04%与突
变体自交结实率81.17%无显著性差异、与CK组
结实率93.26%有极显著差异, 推测突变体雄配子
体发育正常, 突变体育性缺陷不是来源于雄配子
体; B组结实率91.18%与突变体自交结实率81.17%
有极显著差异、与CK组结实率93.26%无显著差
异, 推测突变体雌配子体发育有缺陷, 突变体育性
缺陷来源于雌配子体。由于人工授粉会对雌蕊柱
头造成损伤等实验误差 , 因此试验A组结实率
77.40%稍低于突变体自交结实率81.17%, CK组结
实率93.26%低于理论值100%。
4 til1-1雄配子体发育正常
花粉活力检测可作为判断雄配子体是否正常
图2 til1-1突变体角果表型(A)和结实率(B)
Fig.2 Silique phenotype of til1-1 mutant (A) and its seed setting rate (B)
白色箭头表示败育的胚珠。til1-1结实率与WT相比有极显著性差异(P<0.01)。
图3 野生型和突变体拟南芥中TIL1基因的表达分析
Fig.3 Expression profile of TIL1 gene in wild type and til1-1 mutant
A: RT-PCR; B: Q-PCR。til1-1的TIL1表达与WT相比有极显著性差异(P<0.01)。
图4 til1-1突变体互交角果结实率
Fig.4 Seed setting rate of til1-1 mutant’s reciprocal cross
突变体自交结实率与♀til1-1×♂WT相比无显著性差异, ♀ms-
1×♂til1-1和♀ms-1×♂WT的结实率与♀til1-1×♂WT结实率相比均
有极显著性差异(P<0.01)。
常小艳等: 拟南芥温度诱导脂质运载蛋白TIL1参与雌配子体发育 257
发育的标准之一, 通过Alexander染色实验, 活力正
常的花粉会呈现品红色, 活力异常的花粉会呈现
蓝绿色(Peterson 2010)。til1-1的花药通过染色, 跟
拟南芥WT的花药一样, 几乎所有的花粉粒细胞被
染成品红色(图5)。花粉的萌发能力则是检测花粉
生活力的指标之一, til1-1和WT的花药离体培养结
果显示, til1-1的花粉能正常萌发、花粉管能正常
伸长(图6); 并且花药的萌发率与野生型花粉的萌
发率无显著性差异(图7)。
Alexander染色和花药离体培养实验进一步证
明了til1-1突变体雄配子体发育正常, 突变体育性
缺陷不是来源于雄配子体。
5 TIL1雌配子体发育有缺陷
胚珠透明观察发现, til1-1突变体胚珠功能大
孢子能正常的形成, 说明til1-1突变体大孢子发生
正常。FG1~FG6 (Christensen等1997)时期的胚珠
发育正常, 说明功能大孢子能正常进行3次有丝分
裂, 但是观察发现突变体的FG7时期的胚珠与WT
比较有异常。
实验统计表明, 野生型拟南芥WT中的230个
胚珠全部处于成熟期FG7 (图8-A)时期, 而突变体
til1-1中, 只有182个胚珠处于正常的FG7时期, 另外
有44个胚珠有异常表型(表1): 胚囊靠株孔端膨大,
合点端胚囊呈现系带(图8-B); 或胚囊则株孔端胚
囊突出靠近了株孔处(图8-C); 另外有少数胚珠则
发现胚囊缩小, 胚囊近乎消失, 胚囊中的卵细胞和
中央细胞则几乎观察不到(图8-D)。胚囊中无细胞
核, 就不能提供中央细胞和卵细胞, 达不到完成双
受精的基本条件; 胚囊畸形, 则不能提供正常的双
图5 野生型和突变体拟南芥花粉Alexander染色
Fig.5 Pollen Alexander stain of wild type and til1-1 mutant
图6 野生型和突变体花粉离体培养
Fig.6 Pollen cultivate in vitro of wild type and til1-1 mutant
图7 野生型和突变体花粉离体培养萌发率
Fig.7 Pollen germination of pollen cultivate in vitro of wild
type and til1-1 mutant
til1-1的花粉萌发率与WT相比无显著性差异。
植物生理学报258
受精的环境, 不能正常完成双受精。突变体中的
正常胚珠数占胚珠总数的80.53%, 与突变体til1-1
自己的结实率81.73%相近, 因此, 可认为异常的胚
珠不能正常完成双受精作用, 从而导致种子败育,
最终造成结实率下降。
6 外源克隆的TIL1基因能互补til1-1突变体败育表型
为进一步验证til1-1突变体中观察到的胚珠败
育表型是否是由于T-DNA插入到TIL1基因中造成
的, 通过构建ProTIL1:TIL1-GFP载体做了TIL1基因
的遗传互补。选择GFP报告基因则为检测其启动
子的活性和更进一步了解TIL1基因的表达模式。
通过Basta筛选和PCR分子鉴定, 在T1代转基
因植物中, 最后得到了17株阳性苗, 其中结实表型
有恢复的植株有3株, 统计T2代转基因植物结实率
表1 til1-1胚珠整体透明观察统计
Table1 Statistics of mutant ovule whole cleaning
基因型 角果数 胚珠总数 FG7时期胚珠数 异常胚珠(胚囊畸形)数
WT 5 230 230 0
til1-1 5 226 182 44
图8 til1-1突变体胚珠整体透明观察
Fig.8 Whole clearing observation of mutant ovule
A: FG7; B~D: 异常胚囊。黑色箭头标示异常, bar=100 µm。
为91.58%, 与til1-1突变体自交的结实率81.17%差
异极其显著(图9), 说明外源克隆TIL1基因能够互
补 t i l1-1的败育表型。基因表达模式分析显示 ,
TIL1在成熟雌配子中富集表达, 在幼苗茎的维管组
织和根中也检测到GFP信号(图10)。
讨　　论
温度诱导的脂质运载蛋白TIL1, 主要参与温
度对拟南芥的调控。室温培养条件下, til1-1突变
体植物的生长发育跟野生型拟南芥WT相比没有
明显区别, TIL1基因互补和过量表达的转基因植株
跟野生型拟南芥比较则均有明显的晚花现象和持
绿期增长的表型(Charron等2008)。本次实验通过
结实表型观察发现: til1-1突变体角果中有胚珠败
常小艳等: 拟南芥温度诱导脂质运载蛋白TIL1参与雌配子体发育 259
图9 TIL1基因互补转基因植株角果表型(A)和结实率(B)
Fig.9 The siliques phenotype of complementation of gene TIL1 (A) and its seed setting rate (B)
转TIL1植株结实率与til1-1突变体自交相比有极显著性差异(P<0.01)。
图10 TIL1基因的表达模式
Fig.10 The expression mode of TIL1 gene
A、B: 胚珠; C、D: 茎; E、F: 根。
植物生理学报260
育, 未发育为种子的胚珠呈白色小点(图2-A), 结实
率则下降约20% (图2-B), 由此可知TIL1参与了拟
南芥种子的形成过程。
基因表达分析表明T-DNA插入导致TIL1基因
敲除, til1-1突变体的TIL1基因功能丧失。互交实
验表明 , 胚珠败育来源可能是雌配子体发育缺
陷。Alexander染色和花粉离体培养实验结果显示
til1-1突变体花粉的活力、萌发和花粉管的生长、
伸长均正常, 进一步证明til1-1突变体的雄配子发
育没有缺陷。胚珠整体透明结果显示til1-1突变体
胚珠的胚囊发育有缺陷: 胚囊近株孔端膨大, 或近
株孔端突出靠近株孔, 或皱缩甚至无法辨别胚囊
中卵细胞和中央细胞的细胞核, 胚囊异常, 不能提
供双受精坏境和条件, 影响双受精作用造成突变
体胚珠败育, 种子结实率下降, 因此, 推测突变体
败育来源于雌配子体。
TIL1基因定位在细胞质膜, 并在拟南芥的各
个组织(根、茎、叶、花和角果)和整个生活周期
(种子萌发、营养生长、生殖生长和成熟角果中)
均有表达并且表达量一致(Charron等2008)。遗传
互补实验中, 外源克隆的TIL1基因转入til1-1突变
体则可以明显回复败育表型, 通过构建ProTIL1:
TIL1-GFP载体, 利用GFP荧光信号检测到了GFP在
根、茎、叶和花中的表达, 在T2代转基因植株的胚
珠中, 观察到荧光蛋白在成熟的雌配子体中富集
表达, 说明TIL1基因主要在胚囊中表达。这一结果
也与TIL1基因功能丧失的til1-1突变体中胚珠胚囊
发育缺陷相呼应。
TIL1基因敲除的拟南芥突变体对温度变化和
百草枯(Bishop等1987)较敏感, 黑暗生长的突变体
幼苗见光后会迅速的死掉。在突变体内过氧化氢
和一些活性氧类(reactive oxygen species, ROS)过
多的积累, 从而引起氧化胁迫, 因此突变体的下胚
轴较野生型短, 并且对光敏感。低温环境下, TIL1
基因突变的拟南芥突变体叶片出现了严重的损伤
和坏死, 相同条件下野生型拟南芥的叶片的损伤
程度则较轻(Charron等2008), 低温诱导的叶片损伤
可能是由于低温环境中植物会产生有害的活性氧
类(Chatterjee和Gagnon 2001)。
ROS广泛存在动植物中, 是生物有氧代谢过
程中的副产物之一, 包括氧离子、过氧化物和含
氧自由基等(Apel和Hirt 2004)。植物体中, ROS过
多会对生物体有害, 另一方面ROS作为一种信号分
子参与了一系列重要的发育过程, 对植物体的生
长发育具有重要作用: 对外界各种生物的和非生
物的胁迫(如强光、干旱、高温等)产生相应的响
应机制(Prasad等1994; Tsugane等1999); 参与激素
信号传导、细胞生长伸长、顶端优势、细胞的程
序性衰老和死亡等(Foreman等2003; Van Breuse-
gem和Dat 2006; Gapper和Dolan 2006; Carol和
Dolan 2006)。此外, 研究发现ROS还参与了植物的
有性生殖发育过程(Dennery 2007)。拟南芥雌配子
体“八核七细胞”结构形成时, 除参与双受精的卵细
胞和中央细胞, 反足细胞和助细胞都会进行细胞
程序性死亡。在拟南芥oiwa突变体中, 雌配子体发
育停在FG3或FG4时期, 与此同时还检测到高浓度
的ROS含量, 推测ROS可能影响了胚囊中微管组织
的功能, 从而障碍了大形配子形成过程中的有丝
分裂(Martin等2013)。另外, ROS还能调节细胞的
周期进行、细胞内的钙离子浓度和周期蛋白依赖
性激酶等(Livanos等2012)。通常, 植物体内ROS的
产生和多余ROS的净化清除需要保持良好的平衡,
才能维持植物体正常的生长和发育(Bailey-Serres
和Mittler 2006)。
此外, 脂质运载蛋白是一种小型配合基结合
蛋白, 能结合视黄酸(retinoic acid, RA) (Flower 1994)。
视黄酸是视黄醇(又名维生素A)的衍生物, 类维生
素是跟维生素A结构相关的化合物, 越来越多的实
验证明, 类维生素A在动物胚胎发育的细胞生长和
细胞分化中作为分子信号参与(Gudas 1994)。
Thompson等(1969)通过用缺少维生素A但含有维
甲酸的食物饲养母鸡发现, 母鸡能很好的生长, 但
是母鸡下的鸡蛋不能孵化成小鸡, 可能由于鸡蛋
中缺少视黄酸; Heine等(1985)通过用鹌鹑做实验
材料对这一结果做出了解释: 由于胚胎中类维生
素A的缺乏, 因此心脏和血管系统的发育受到了阻
常小艳等: 拟南芥温度诱导脂质运载蛋白TIL1参与雌配子体发育 261
碍, 最终胚胎不能正常的发育。
人们对TIL1基因的研究, 主要是集中在植物
的各种逆境胁迫, 本次试验则首次发现TIL1基因参
与拟南芥雌配子体发生, 增加了人们对TIL1功能的
认识。拟南芥雌配子体的发育是个复杂而又精细
的过程, 有许多基因共同参与和调控。til1-1突变
体, 胚囊的形态发育异常, 雌配子体双受精的进行
受到阻碍。TIL1基因缺失使得突变体til1-1失去了
TIL1基因参与的各种生长发育以及生理调控机能,
但是突变体中ROS的积累是否对til1-1突变体胚囊
的发育有影响? TIL1是否与ROS一起参与了胚囊
的发育? til1-1突变体中是否还有其他的生物化学
物质一起参胚囊的发育? TIL1基因参与雌配子体
的发育过程的分子机制跟脂质运载蛋白在影响动
物胚胎发育的机制是否类似? TIL1基因具体是如
何通过下游的机制介导调控雌配子体的发育?
TIL1作为温度响应的蛋白, 它在调控雌配子体发育
过程中是否也是温度依赖的? 这一系列的问题则
有待更深入的实验研究和验证。
参考文献
Abo-Ogiala A, Carsjens C, Diekmann H, Fayyaz P, Herrfurth C,
Feussner I, Polle A (2013). Temperature-induced lipocalin (TIL)
is translocated under salt stress and protects chloroplasts from
ion toxicity. J Plant Physiol, 171: 250~259
Apel K, Hirt H (2004). Reactive oxygen species: metabolism,
oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol,
55: 373~399
Bailey-Serres J, Mittler R (2006). The roles of reactive oxygen species
in plant cells. Plant Physiol, 141 (2): 311
Bishop T, Powles SB, Cornic G (1987). Mechanism of paraquat
resistance in Hordeum glaucum. II. Paraquat uptake and
translocation. Aust J Plant Physiol, 14: 539~547
Brinker M, Brosché M, Vinocur B, Abo-Ogiala A, Fayyaz P, Janz
D, Ottow EA, Cullmann AD, Saborowski J, Kangasjärvi J et
al (2010). Linking the salt transcriptome with physiological
responses of a salt-resistant Populus species as a strategy to
identify genes important for stress acclimation. Plant Physiol,
154: 1697~1709
Carol RJ, Dolan L (2006). The role of reactive oxygen species in cell
growth: lessons from root hairs. J Exp Bot, 57: 1829~1834
Charron JBF, Breton G, Badawi M, Sarhan F (2002). Molecular
and structural analyses of a novel temperature stress-induced
lipocalin from wheat and Arabidopsis. FEBS Lett, 517: 129~132
Charron JBF, Ouellet F, Houde M, Sarhan F (2008). The plant
apolipoprotein D ortholog protects Arabidopsis against oxidative
stress. BMC Plant Biol, 8: 86
Charron JBF, Ouellet F, Pelletier M, Danyluk J, Chauve C, Sarhan F
(2005). Identification, expression, and evolutionary analyses of
plant lipocalins. Plant Physiol, 139: 2017~2028
Chatterjee S, Gagnon C (2001). Production of reactive oxygen species
by spermatozoa undergoing cooling, freezing and thawing. Mol
Reprod Dev, 59: 451~458
Chi WT, Fung RWM, Liu HC, Hsu CC, Charng YY (2009).
Temperature-induced lipocalin is required for basal and acquired
thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell Environ, 32: 917~927
Christensen CA, King EJ, Jordan JR, Drews GN (1997).
Megagametogenesis in Arabidopsis wild type and Gf mutant.
Sex Plant Reprod, 10: 49~64
Dennery PA (2007). Effects of oxidative stress on embryonic
development. Birth Defects Res C Embryo Today, 81: 155~162
Fan LM, Wang YF, Wang H, Wu WH (2001). In vitro Arabidopsis
pollen germination and characterization of the inward potassium
currents in Arabidopsis pollen grain protoplasts. J Exp Bot, 52:
1603~1614
Flower DR (1994). The lipocalin protein family: a role in cell
regulation. FEBS Lett, 354: 7~11
Flower DR (1996). The lipocalin protein family: structure and
function. Biochem J, 318: 1~14
Foreman J, Demidchik V, Bothwell JH, Mylona P, Miedema H, Torres
MA, Linstead P, Costa S, Brownlee C, Jones JD et al (2003).
Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate
plant cell growth. Nature, 422: 442~446
Gapper C, Dolan L (2006). Control of plant development by reactive
oxygen species. Plant Physiol, 141: 341~345
Gudas LJ (1994). Retinoids and vertebrate development. J Biol Chem,
269: 15399~15402
Heine UI, Roberts AB, Munoz EF, Roche NS, Sporn MB (1985).
Effects of retinoid deficiency on the development of the heart
and vascular system of the quail embryo. Virchows Arch Cell
Pathol, 50: 135~152
Kawamura Y, Uemura M (2003). Mass spectrometric approach for
identifying putative plasma membrane proteins of Arabidopsis
leaves associated with cold acclimation. Plant J, 36: 141~154
Livanos P, Apostolakos P, Galatis B (2012). Plant cell division: ROS
homeostasis is required. Plant Signal Behav, 7: 771~778
Martin MV, Fiol DF, Sundaresan V, Zabaleta EJ, Pagnussat GC (2013).
oiwa, A female gametophytic mutant impaired in a mitochondrial
manganese-superoxide dismutase, reveals crucial roles for
reactive oxygen species during embryo sac development and
fertilization in Arabidopsis. Plant Cell, 25: 1573~1591
Peterson R, Slovin JP, Chen C (2010). A simplified method for
differential staining of aborted and non-aborted pollen grains.
Inter J Plant Biol, 1: 66~69
植物生理学报262
Prasad TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR (1994). Evidence
for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a
regulatory role for hydrogen peroxide. Plant Cell, 6: 65~74
Russell SD (1993). The egg cell: development and role in fertilization
and early embryogenesis. Plant Cell, 5: 1349~1359
Sanchez D, Ganfornina MD, Gutierrez G, Jauneau ACG, Risler JL,
Salier JP (2006). Lipocalins genes and their evolutionary history.
In: Åkerström B, Borregaard N, Flower DR, Salier JP (eds).
Lipocalins. Georgetown: Landes Bioscience, 5~16
Schneitz K, Hülskamp M, Pruitt RE (1995). Wide-type ovule
development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study
of cleared whole-mount tissue. Plant J, 7: 731~749
Smyth DR, Bowman JL, Meyerowitz EM (1990). Early flower
development in Arabidopsis. Plant Cell, 2: 755~767
Thompson JN, Howell JM, Pitt GAJ, McLaughlin CI (1969). The
biological activity of retinoic acid in the domestic fowl and the
effects of vitamin A deficiency on the chick embryo. Br J Nutr,
23: 471~490
Tsugane K, Kobayashi K, Niwa Y, OhbaY, Wada K, Kobayashi
H (1999). A recessive Arabidopsis mutant that grows
photoautotrophically under salt stress enhanced active oxygen
detoxification. Plant Cell, 11: 1195~1206
Van Breusegem F, Dat JF (2006). Reactive oxygen species in plant
cell death. Plant Physiol, 141: 384~390
Wilson ZA, Morroll SM, Dawson J, Swarup R, Tighe PJ (2001).
The Arabidopsis MALE STERILITY1 (MS1) gene is a transcri-
ptional regulator of male gametogenesis, with homology to the
PHD-finger family of transcription factors. Plant J, 28: 27~39
Yadegari R, Drews GN (2004). Female gametophyte development.
Plant Cell, 16: S133~S141