全 文 ：植物生理学通讯 第46卷 第12期, 2010年12月 1225
收稿 2010-09-02 修定 　2010-09-26
资助 北京市自然科学基金(5102015)。
* 通讯作者(E-mail: sunqp@bac.edu.cn; Tel: 010-86075292)。
LeWRKY1 基因的克隆及分析
于涌鲲 1, 王丽芳 1,2, 杜希华 2, 赵福宽 1, 孙清鹏 1,*
1北京农学院生物技术学院, 北京102206; 2山东师范大学生命科学学院, 济南250014
提要: 采用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆了番茄 LeWRKY1 cDNA (Genbank 登录号为 FJ654265)全长, 用生物信息学的方法对
其进行分析, 预测其编码的蛋白的定位和功能。同时利用 Northern 杂交技术分析了 JA (jasmonic acid)或 SA (salicylic acid)
刺激时LeWRKY1在野生型番茄和番茄JA不敏感突变体jai1 (JASMONATE-INSENSITIVE1)及番茄JA生物合成突变体spr2
(prosystemin-mediated responses2)中的表达情况。LeWRKY1 cDNA 序列全长 1 740 bp, 阅读框 1 083 bp。生物信息学分析表
明 LeWRKY1 含有 1 个 WRKY 结构域和 1 个 C2H2 型锌指结构。LeWRKY1 可能是一种定位于细胞核的 DNA 结合蛋白, 并
可能具有转录调控、信号传导功能。表达分析推测LeWRKY1 的表达是JA 依赖而非SA 依赖性的, 且LeWRKY1的表达不依
赖于生物体内 JA 的从头合成。
关键词: 番茄; LeWRKY1; 茉莉酸; 水杨酸
Isolation and Analysis of LeWRKY1
YU Yong-Kun1, WANG Li-Fang1,2, DU Xi-Hua2, ZHAO Fu-Kuan1, SUN Qing-Peng1,*
1College of Biotechnology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2College of Life Science, Shandong Normal
University, Jinan 250014, China
Abstract: The full length of LeWRKY1 cDNA (GenBank no. FJ654265) was cloned by RT-PCR and RACE
approaches, and its cellular localization and function was deduced by bioinformatics methods. Using Northern
blotting, LeWRKY1 expression in wild type tomato, JA insensitive tomato mutation jai1, and JA biosynthesis
mutation spr2 were analyzed. The cloned LeWRKY1 cDNA was 1 740 bp with a 1 083-bp ORF. Bioinformatics
analysis showed that LeWRKY1 might be a DNA binding protein located in the nucleus contained a WRKY
domain and a C2H2 zinc finger motif, which might have the function of transcription, transcriptional regulation
and signal transduction. Expression analysis indicated LeWRKY1 in tomato was JA dependent but SA independent,
and LeWRKY1 was induced by JA, but it is independent on the de novo synthesis of JA.
Key words: tomato; LeWRKY1; jasmonic acid; salicylic acid
植物遭受病原侵袭时, 会引起一系列基因的激
活或抑制。这些基因的产物通常是调节蛋白, 其可
以参与后续细胞反应的调节。通过受体和配体的
相互作用激活相关早期快速防御基因的表达。不
同的病原可激活不同的防御基因, 以抑制真菌或细
菌的生长与传播。
植物能够有效地整合复杂的环境信号并对特
定的环境刺激作出正确的反应。尽管其作用的机
理目前尚不清楚, 但越来越多的证据表明, 遭受逆
境胁迫时, 植物可以迅速有效地启动网络中多种转
录因子的转录, 从而使其获得对多种环境因素的适
应性(Pandey和 Somssich 2009)。WRKY转录因子
就是其中重要的成员之一(Eulgem 和 Somssich
2007)。这类转录因子由于含有高度保守的 WRKY
基序, 因而命名为 WRKY 转录因子。
WRKY 结构域由约 60 个氨基酸残基组成, 其
N端有保守的 WRKYGQK 核心序列, C 端是一个 C-
C-H-C/H样的锌指结构(Eulgem等 2000)。目前已
研究过的 W R K Y 蛋白均定位于细胞核中, 如
WRKY48 (Xing 等 2008)、WRKY38 和 WRKY62
(Kim 等 2008)等。对某些 WRKY 蛋白氨基酸序列
的分析, 在 WRKY 结构域外存在细胞核定位信号
(郝林和徐昕 2004)。
WRKY 是在植物界广泛存在的一类转录因子,
尽管其可参与植物的衰老、形态建成、冷胁迫、
干旱胁迫和盐胁迫等多种胁迫反应(Rushton 等
1996; Eulgem等1999; Huang和Duman 2002; Seki
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等 2002)。WRKY 转录因子家族形成了一个相互
关联的复杂的调节网络, 并受多水平调节(Eulgem
和 S o m s s i c h 2 0 0 7 )。W R K Y 蛋白在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)分别含
有74个和109个家族成员(Pandey和Somssich 2009;
Eulgem和 Somssich 2007; Ross等 2007)。WRKY
的表达具有快速、瞬时和时空特异性等特点。在
已经发现的WRKY 家族成员中, 大多数 WRKY 基因
的表达具有时空性。如烟草叶片遭受机械创伤10
min 后, 受伤的及上层未受伤的叶片中就有WRKY
转录本(wound-induced leucine zipper zinc finger,
WIZZ)积累, 30 min后达到最大值, 然后开始下降
(Hara等 2000)。大部分WRKY家族成员受生物胁
迫(如病原物及其诱发子) (Hofmann等2008)、非
生物胁迫(冷、干旱、盐胁迫)或激素(ABA、IAA、
GA3、MeJA、SA)的调节(Ramamoorthy 等 2008)。
越来越多的研究者认为 WRKY 在植物的防御反应
中起重要的调控作用。因此, 分析 LeWRKY1 在植
物防御反应中的功能, 对阐明植物防御反应的机理
具有重要的理论和应用价值。
植物能够及时有效的识别和整合复杂的环境
刺激并作出特定的反应, 很大程度上依赖于其分泌
或产生的化学信号分子之间的协同作用(Mur 等
2006)。JA 和 SA 是目前研究较多的和植物系统获
得性防御反应有关的两种逆境植物激素。JA介导
的植物防御反应一般被坏死营养型病原、伤害和
昆虫取食(insect herbivory)激活; SA介导的防御反
应一般被活体营养型病原激活(Mur等2006; 贾翠玲
和侯和胜2010)。JA和 SA介导的防御反应经常相
互拮抗(Vidal等1997; Norman-Setterblad等2000),
有时JA和SA之间可能也会产生协同作用, 二者之
间的相互作用方式取决于二者在细胞中的相对浓度
(Mur等 2006) 。植物遭受逆境胁迫时, 其可以通
过快速有效的重组多种转录因子的转录谱而使植物
获得对多种环境因素的适应性(贾翠玲和侯和胜
2010)。WRKY 转录因子是参与植物逆境应答反应
的重要成员之一(Vidal等1997; Eulgem和Somssich
2007; Pandey和Somssich 2009)。当遭受细菌病
原体(Pseudomonas syringae)侵染或经SA处理时, 拟
南芥中72 个 AtWRKY 转录因子中的49 个 AtWRKY
基因的表达谱会发生变化(Dong等 2003)。WRKY70
可以作为JA信号通路和SA信号通路的开关并可整
合JA和 SA信号通路的相关信号, 从而激活SA介
导的防御反应信号通路, 抑制JA介导的防御反应信
号通路(Li等2004)。但Ren等(2008)的研究认为尽
管 WRKY70 对 JA 和 SA 信号通路具有重要调节作
用, 但其对 JA 和 SA 信号的传递并非必需的。
目前已经在拟南芥、水稻、番茄等植物中克
隆了上百种 WR K Y 转录因子家族成员, 但多数
WRKY基因的功能及其参与植物逆境胁迫应答反应
的机理尚不清楚。因此, 探究 JA 与 WRKY 转录因
子间的关系对于阐明植物防御反应的机理具有重要
意 义 。
材料与方法
番茄(Lycopersicon esculentum)种子播于育苗
盘, 生长至2片子叶完全展开。
UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒
(SK1321)、UNIQ-10 柱式质粒小量抽提试剂盒、
UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒、琼脂糖购自上
海生物工程公司; pMD19-T 载体、dNTP、LA DNA
Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司; 大肠杆菌
(Escherichia coli) DH5a感受态细胞购自北京全式
金生物有限公司; JA、SA购自Sigma公司; 其他
为进口分装或国产分析纯试剂。
取2片子叶的番茄幼苗, 用100 mmol·L-1的JA
处理6 h, 用液氮研磨后, 采用UNIQ-10柱式Trizol
总RNA抽提试剂盒提取其总RNA。以First Strand
cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)合成cDNA第
一条链。
根据拟南芥 W R K Y 蛋白保守序列, 利用
Omiga2.0软件分析设计引物。上下游引物及序列
分别为 P1: 5 TGGMGIAARTAYGGNCARA 3 和
P2: 5 TGRBYRTGYTTICCYTCRTAIGTDGF 3 (其
中M: A 或 C; R: A或G; Y: C或T; B: T、C或G; D:
A、T 或 G; N: A、T、C或 G; I: 次黄嘌呤)。
采用50 mL 反应体系: 1 mL cDNA 模板(100
ng·mL-1), 1 mL P1 (10 mmol·L-1), 1 mL P2 (10 mmol·L-1),
5 mL 10×PCR Buffer, 5 mL dNTP (2 mmol·L-1), 1 mL
Taq DNA酶, 5 mL MgCl2 (25 mmol·L-1), 31 mL
d d H 2O。
反应程序为95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性1
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min, 48 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min, 35个循环;
72 ℃延伸 10 min。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电
泳和UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒纯化后克隆
至pMD19-T 载体, 转化 DH5a感受态细胞。UNIQ-
1 0 柱式质粒小量抽提试剂盒提取阳性克隆质粒
DNA, 酶切鉴定后送上海生物工程有限公司进行测
序分析。
根据本课题组克隆出的番茄 WRKY 特异片段
(Genbank登录号为EU755369.1)分别设计3-RACE
特异引物(P3: 5 TCTTGACAGGGCAACCAGG 3)
和 5-RACE 特异引物(P4: 5 TGGAGGAAGTAT
GGGCAGAA 3)。然后用Takara 3-Full RACE Core
Set Ver.2.0 (D314)和5-Full RACE Kit (D315)分别进
行5-RACE和 3-RACE扩增, 克隆3和5 cDNA。
对扩增片段进行序列拼接后, 设计特异引物P5: 5
GAGGGTGAGGCAGTGATTCGAGC 3 和 P6: 5
AGCCAACTCAGAGCAAGTCCATT 3, 扩增 cDNA
全 长 。
按Sun等(2006)的方法, 培养14 d的整株番茄
幼苗从培养土中取出, 用无菌水洗净, 于1×MS液
体培养基中培养过夜后, 分别用100 mmol·L-1 JA和
1 mmol·L-1 SA 处理 0、1、3、6、12、24、48、
72和 96 h时取样, 提取其总RNA。培养14 d的番
茄突变体幼苗(jai1和spr2)用100 mmol·L-1 JA处理
12 h, 提取总 RNA。分别以 LeWKRY1 特异 cDNA
片段(EU755369.1)、JA 反应基因片段 VSP 或 SA
反应基因PR-1为探针检测JA或 SA刺激对番茄幼
苗 VSP2、PR-1 和 LeWKRY1 基因表达的影响。以
rRNA 作为上样量的对照。
结果与讨论
1 番茄 WRKY 基因的克隆
以2片子叶的番茄幼苗经100 mmol·L-1的JA处
理6 h后提取的总RNA为模板进行反转录, 产生的
cDNA进行 RT-PCR检测, 简并引物(P1和 P2)设计
根据拟南芥 WRKY 基因的 WRKY 保守结构域。结
果获得2条PCR产物分别约为150 bp和650 bp的
条带(图 1-A)。测序分析结果表明其长度分别为
158 bp (EU755368.1)和657 bp (EU755369.1), 分别
编码52 个和 69 个氨基酸, 且都含有WRKYGQK 氨
基酸序列。
利用3-RACE技术, 扩增出一条约1 000 bp的
明亮条带(图1-B)。测序分析表明其长度为1 028
bp。利用5-RACE技术, 扩增出一条约820 bp的
明亮的条带(图1-C)。测序分析表明其长度为823
bp。对扩增出的约1 000 bp和2 000 bp的条带也
进行了回收并进行了测序鉴定和序列比对(Blastn),
但结果表明其不是 WRKY 同源基因片段。
对5-RACE 序列、特异基因片段序列和 3-
RACE 序列进行拼接得到一个 1 740 bp 的序列。
GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)分
析结果表明该拼接序列的226~228位含有起始密码
ATG, 1 306~1 308位含有终止密码TAA, 1 729~1
734为poly A信号(图2)。进一步分析发现, 该拼
接序列预测编码区起始密码ATG 的 -3 位为 A, +4
位为G (起始密码子AUG中的A为+1) (图 2), 符
合真核生物mRNA 5帽子结构碱基组成的Kozak规
律(Kozak 1991)。因此, 该拼接序列符合有效翻译
的 c D N A 的结构特征。
根据上述拼接序列设计引物(P5 和 P6)扩增
cDNA全长并进行测序分析, 结果表明所得的cDNA
全长1 472 bp (图1-D)。该序列碱基组成与上述
拼接序列完全一致。
2 番茄 WRKY cDNA 序列分析
LeWRKY1 cDNA全长 1 740 bp, 阅读框1 083
bp, 编码 360 个氨基酸。其编码的LeWRKY1 与辣
椒(Capsicum annuum) CaWRKY1 (AAX20040.1)的
一致性为85%, 与烟草(Nicotiana tabacum) WIZZ
(BAA87058.1)的一致性为79% (Hara等2000), 与
欧芹 WRKY4 (AAG35658.1)的一致性为 51%。
图1 番茄WRKY基因的克隆
Fig.1 Cloning of tomato WRKY
M: DNA 分子量标记, 条带由大到小分别为2 000、1 000、
750、500、250 和 100 bp; A: WRKY 基因特异片段; B: WRKY
基因 3-RACE 扩增; C: WRKY 基因 5-RACE 扩增; D: WRKY 基因
c D N A 全长。
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图2 核苷酸序列及预测氨基酸序列
Fig.2 The nucleotide and predicted amino acid sequence of tomato WRKY
黑体和方框表示 WR KY 氨基酸保守区域 WRK Y G Q K , 黑体和下划线表示锌指结构 C 2H 2。
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LeWRKY1 编码 360 个氨基酸, 具有由色氨酸
(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y) 4 个
氨基酸(174~177)组成的 WRKY 家族蛋白特有的
WRKY 结构域和 C2H2 锌指结构的序列(194~226)
(图 2)。根据 WRKY 结构域的数量及锌指结构的组
成, 可将WRKY蛋白分为三类。第I类通常包含2个
WRKY结构域, 锌指结构为C2H2 型(C-X4-5-C-X22-23-
H-X1-H)。第 II、III 类只含有1个 WRKY结构域,
二者的区别为锌指结构不同, 第II类的锌指结构与
第I类相同为C2H2型, 第III类的锌指结构则为C2HC
型(C-X7-C-X23-H-X1-C) (Eulgem等2000; 吴华玲等
2008)。LeWR KY1 属于第 II 类 WRKY 蛋白。
利用LOCtree (http://cubic.bioc.columbia.edu/
cgi/var/nair/loctree/query)软件分析表明, LeWRKY编
码的蛋白定位于细胞核, 是一种 DNA 结合蛋白。
利用ProtFun 2.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
ProtFun/)的预测结果显示, LeWRKY具有转录、转
录调控、信号传导功能的可能性分别为0.09、0.133
和 0.082。
3 LeWRKY1 的表达分析
未经 J A 处理的番茄幼苗中有痕量的基态
LeWRKY1 表达(图 3-A, 泳道 1), 番茄幼苗经100
mmol·L-1 JA处理时, JA可诱导番茄中LeWRKY1的
表达。经 JA 处理 3 h 的番茄幼苗中 LeWRKY1 的
表达量与未经处理的对照无明显差别(图3-A, 泳道
1和 2); 经 JA处理 6 h的番茄幼苗中LeWRKY1的
表达量较对照显著升高(图3-A, 泳道1和3), JA处
理12 h时, LeWRKY1的表达量达到最大(图3-A, 泳
道4), 随后LeWRKY1的表达量逐渐降低(图3-A, 泳
道 5、6 和 7 )。
VSP2为茉莉酸反应基因之一(Spoel等 2003;
Koornneef等2008), 其表达可被JA诱导(图3-B, 泳
道 2、4、6、8、10、12、14 和 16)。JA 处
理 1~12 h时, 番茄 VSP2的表达量随JA处理时间
的延长而升高(图3-B, 泳道2、4、6和8); JA处
理24 h的番茄幼苗VSP2的表达达到最大值且保持
恒定(图 3-B, 泳道 10、12、14和 16)。综合分析
图3的结果可知, JA 既可诱导LeWRKY1 的表达又
可诱导VSP2 的表达, 但 JA处理 12 h 时 LeWRKY1
的表达量达到最大(图3-A, 泳道4), 而JA处理24 h
时 VSP2的表达量达到最大(图 3-B, 泳道 10)。据
此可以推测 JA 可能首先诱导 LeWRKY1 的表达。
当用1 mmol·L-1 SA处理番茄幼苗时, 经不同
时间处理的番茄幼苗中LeWRKY1 的表达量无明显
差异(图 4-A)。即 SA对 LeWRKY1 的表达没有显著
影响。SA 反应基因PR-1 的表达随SA 处理时间的
延长呈现先升高后降低的趋势(图4-B), 说明所用实
验材料中SA信号可以正常进行。综合图4-A和图
4-B 的结果可以推测LeWRKY1 的表达不依赖于SA
的信号传递。
用100 mmol·L-1 JA处理番茄JA不敏感突变体
jai1时, 未检测到LeWRKY1的表达(图5, jai1); 而
用100 mmol·L-1 JA处理番茄JA生物合成突变体spr2
时则可检测到LeWRKY1的表达(图5, spr2)。以上
图3 JA对 LeWRKY1和 VSP2基因表达的影响
Fig.3 Effect of JA on the expression of LeWRKY1 and VSP2
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图4 SA对 LeWRKY1基因表达的影响
Fig.4 Effect of SA on the expression of LeWRKY1
图5 LeWRKY1在jai1和spr2突变体中的表达分析
Fig.5 Analysis of JA-induced LeWRKY1 expression
in jai1 and spr2
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结果说明, L e W R K Y 1 的表达受 JA 诱导, 但
LeWRKY1 的表达不依赖于生物体内 JA 的从头合
成。
WRKY 蛋白是一类及时早熟型(immediate-
early type)的转录因子, 参与信号转导途径中早期基
因调控(郝林和徐昕2004)。参与防御反应的多数
WRKY 基因均受病原体、信号分子(SA 或 JA)或环
境胁迫诱导。但本研究证实, LeWRKY1 不受 SA
诱导(图4-A)。与本研究类似, Yoda等(2002)从烟
草中分离出一能引发细胞超敏反应的 WRKY 蛋白
TIZZ, 其既不受SA诱导, 也不受机械创伤诱导, 其
可能在激活SA非依赖的超敏信号传递通路中起重
要作用(郝林和徐昕2004)。本研究表明, LeWRKY1
的表达是JA依赖性的, 而非SA依赖性的, 且其表
达不依赖于生物体内JA的从头合成。因此, 推测
LeWRKY1 可能参与 SA 非依赖的超敏信号传递通
路的调控。此推测尚需进一步实验验证。
植物生理学通讯 第46卷 第12期, 2010年12月 1231
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