全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (9): 968~972968
收稿 2013-07-11 修定 2013-08-02
资助 湖南省科技厅湘西专项(2012FJ4440)和湘西土家族苗族自
治州科技计划项目(11XI012)。
* 通讯作者(E-mail: chenjifu1965@163.com; Tel: 0743-
8535355)。
无籽罗汉果的组织培养和快速繁殖
陈继富*
湘西民族职业技术学院生物工程系, 湖南吉首416000
摘要: 以无籽罗汉果优良株系的幼嫩茎段为试验材料, 经消毒处理后, 剪成带一个腋芽的茎段, 在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA
0.05 mg·L-1培养基上进行培养, 获得无菌芽苗, 再以无菌芽苗的单芽茎段为外植体, 建立无籽罗汉果的组培快繁体系。结果
表明, 最佳继代增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+GA3 0.03 mg·L
-1, 30 d的增殖系数为16.4; 芽苗伸长的最适
培养基为MS+6-BA 0.05 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L
-1; 芽苗生根的最适培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1; 炼苗后, 移
入蛭石:珍珠岩:熟土=1:1:2 (V/V/V)的基质中, 成活率达98.1%。该体系的建立为无籽罗汉果规模化生产提供了技术平台。
关键词: 罗汉果; 组织培养; 快速繁殖
Tissue Culture and Rapid Propagation of Seedless Siraitia grosvenorii
CHEN Ji-Fu*
Bioengineering Department, Xiangxi National Vocation Technical College, Jishou, Hunan 416000, China
Abstract: In order to study the tissue culture and rapid propagation technique of triploid seedless system of
Siraitia grosvenorii, young stem was used as test materials. After disinfection, the stem segments with one bud
were cultured in MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1 medium, to obtain the aseptic seedling. Then stems
with axillary buds were taken as explants to established the in vitro propagation system of seedless S.
grosvenorii. The results show that, the best medium for multiplication was MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.2
mg·L-1 + GA3 0.03 mg·L
-1, the multiplication coefficient was 16.4 after 30 d; the optimum medium for shoot
elongation was MS+6-BA 0.05 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L
-1; the optimal medium for rooting was
1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1. After hardening, it was moved into the matrix which volume ratio as vermiculite:
perlite:mellow soil=1:1:2, the survival rate was 98.1% after 30 d. These results could provide the technical basis
for scale production of seedless plantlets of S. grosvenorii.
Key words: S. grosvenorii; tissue culture; rapid propagation
罗汉果(Momordica grosvenorii Swingle)是葫
芦科罗汉果属植物, 以果实入药, 是我国著名的中
药材, 有清肺止咳、润肠通便、降血糖、保肝、
活血化瘀、抗氧化等功效(黄志江等1998)。通过
对罗汉果提取物有效成分的分析(齐一萍和唐明仪
2001), 发现罗汉果甜苷为主要有效成分, 其甜度是
蔗糖的300倍, 且热量极低, 是糖尿病、高血压、
高血脂和肥胖症患者的首选天然甜味剂(张桂玲和
温四民2006), 因而在国际甜味剂市场备受重视。
随着罗汉果甜苷市场需求量的增大, 以罗汉果提
取物为主导的加工业迅速崛起, 并带动了罗汉果
种植业的空前发展。由于罗汉果甜苷主要存在于
果皮和果肉中, 而占果实重量45%左右的种子不含
甜苷, 加上种子的存在增大了甜苷提取工艺的难
度, 因此, 利用生物技术培育甜苷含量高的无籽罗
汉果优良株系对提高罗汉果的加工品质具有十分
重要的意义。蒋水元等(2009)就无籽罗汉果的选
育做了多方面的探索, 并成功培育出果实无籽或
极少籽、甜苷V (mogroside V)含量比其母本提高
36.28%的三倍体无籽罗汉果株系, 但未对三倍体
无籽罗汉果的繁殖方法进行相关研究。
在实际生产中, 罗汉果种苗主要采取压蔓、
扦插等营养繁殖的方式, 繁殖系数低, 且易患病毒
病。病毒在植物体内世代累积, 导致品种退化, 质
量下降, 产量锐减。为此, 前人曾就罗汉果的组织
培养进行了多方面的探索, 在利用组织培养方法
生产脱毒罗汉果种苗方面取得了重要进展(付长亮
陈继富: 无籽罗汉果的组织培养和快速繁殖 969
等2005), 不少科研或生产单位每年培育大量罗汉
果组培苗应用于生产。截至目前, 有关三倍体无
籽罗汉果的组织培养和快速繁殖研究尚未见报
道。本实验在传统罗汉果组培快繁技术的基础上,
以无籽罗汉果无菌芽苗的茎段为外植体在MS或
1/2MS基础培养基上添加不同种类、浓度的植物
生长物质, 研究了无籽罗汉果茎段的继代增殖、
芽苗伸长与生根直至得到无籽罗汉果幼苗的整个
过程, 对无籽罗汉果组培快繁技术进行了系统研
究与优化。建立了一种稳定而高效的无籽罗汉果
组织培养与快繁技术体系, 从而为无籽罗汉果规
模化生产提供技术支撑。
材料与方法
1 材料及处理
无籽罗汉果(Momordica grosvenorii Swingle)的
幼嫩茎段采自长沙市坪山镇罗汉果种植园内的优
良单株, 经鉴定为三倍体无籽罗汉果。将幼嫩茎段
的叶片除掉, 用饱和洗衣粉水刷洗5 min, 经自来水
冲洗60 min, 剪成带一个腋芽的茎段, 茎段长1.0~1.5
cm, 放置于三角瓶中, 用自来水冲洗30 min左右。
2 培养基
生根培养基是以1/2MS加蔗糖15 g·L-1、琼脂7
g·L-1, pH 5.8为基本培养基, 其余培养基均以MS加
蔗糖30 g·L-1、琼脂7 g·L-1, pH 5.8为基本培养基, 培
养基配制后经121 ℃高压灭菌20 min后待用。
3 培养条件
材料接种后, 在温度(27±1) ℃、光照强度40
μmol·m-2·s-1、每天12 h光照条件下培养。
4 培养过程及方法
4.1 无菌芽苗的诱导与培养
将冲洗干净的材料在超净工作台上再用75%
乙醇消毒30 s, 无菌水清洗2~3遍, 然后用0.1%
HgCl2溶液消毒6~8 min, 再用无菌水洗涤4~6遍, 接
种在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的培养
基上(图1-A)。25 d左右可获得无籽罗汉果无菌芽
苗(图1-B)。
4.2 继代增殖培养
将无菌芽苗的幼嫩茎段切成单芽茎段作为外
植体, 接种在含不同浓度6-BA、IBA和GA3的MS
培养基上, 配方见表1。每一处理接种30个外植体,
每瓶接种6个, 重复3次。接种30 d后, 观察丛芽的
生长情况, 统计外植体的增殖系数, 并筛选出适宜
无籽罗汉果继代增殖的培养基。
4.3 芽苗伸长培养
以MS为基本培养基, 生长物质采用6-BA、
IBA和GA3组合, 配方见表2。从继代增殖诱导的丛
芽中, 切取叶色嫩绿、大小基本一致的单个芽苗,
放入各培养基中, 每一处理均接种60个芽苗, 每瓶
接种5个。接种后观察芽苗的伸长情况。
4.4 生根培养
分别采用含0、0.1、0.3和0.5 mg·L-1 IBA及
图1 无籽罗汉果的组织培养与快速繁殖
Fig.1 Tissue culture and rapid propagation of seedless S. grosvenorii
A: 腋芽诱导培养; B: 初代培养无菌芽苗; C: 茎段外植体产生的丛芽; D: 芽苗伸长培养; E、F: 芽苗接种至生根培养基; G、H: 生长在
蛭石:珍珠岩:熟土=1:1:2 (V/V/V)基质上的组培苗。
植物生理学报970
0、0.1、0.3和0.5 mg·L-1 NAA的1/2MS培养基作为
诱导生根的培养基。选取生长健壮且长势一致、
高4~5 cm的无根幼苗接入生根培养基进行生根诱
导。各培养基均接种30株幼苗, 每瓶接种3株。接
种30 d后观察幼苗的生长和生根状况。
5 炼苗与移栽
生根培养30 d后, 将已生根且根系发达具3~5
片叶、株高6~7 cm的试管苗移到与培养温度相同
的温室中炼苗, 打开瓶口, 使嫩苗逐渐与外界接触,
提高适应能力, 保持较高的空气湿度。炼苗5~6 d
后用镊子把苗从培养瓶中取出, 用流水将根部的
培养基冲洗干净 , 然后移入蛭石 :珍珠岩 :熟土
= 1 : 1 : 2 ( V / V / V )的基质中 , 置于相对湿度
80%~90%、温度20~25 ℃的环境中遮荫培养, 30 d
后统计成活率。
实验结果
1 不同植物生长物质浓度配比对无籽罗汉果继代
增殖诱导的影响
表1显示, 增殖系数随着6-BA、IBA和GA3三
种植物生长物质配比浓度递增呈先上升后下降的
趋势。低浓度6-BA、IBA和GA3组合, 诱导形成的
愈伤组织体积较小, 多为单芽, 叶片翠绿, 随着
6-BA、IBA和GA3三种植物生长物质配比浓度递
增愈伤组织体积逐渐增大, 丛芽数增多, 叶色加
深。但浓度过高, 丛芽多, 愈伤组织体积大, 叶片
颜色变浅, 甚至发黄(处理4)。综合来看, 处理2为
最佳增殖继代培养基(图1-C), 增殖系数为16.4。
2 不同植物生长物质浓度配比对无籽罗汉果芽苗
伸长的影响
由表2可以看出, 将继代增殖诱导的丛芽苗分
割成单芽苗转至添加不同浓度6-BA、IBA和GA3
的培养基中, 以MS+6-BA 0.05 mg·L-1 +IBA 0.1
mg·L-1 +GA3 0.1 mg·L
-1 (处理7)最适合无籽罗汉果
芽苗的伸长, 芽苗生长健壮, 叶片大呈嫩绿色(图
1-D)。
3 不同植物生长物质浓度配比对无籽罗汉果芽苗
根系生长及移栽成活率的影响
将无根壮苗转入生根培养基中进行生根诱
导。统计不同浓度的IBA和NAA处理对试管苗生
表1 不同植物生长物质浓度配比对无籽罗汉果丛芽生长的影响
Table 1 Effects of different concentration of plant growth substances on shoot growth of seedless S. grosvenorii
处理
生长物质浓度/mg·L-1
增殖系数 丛芽生长情况
6-BA IBA GA3
1 0.3 0.1 0.01 11.2c 丛芽少, 多为单芽, 叶片翠绿, 愈伤组织小
2 0.5 0.2 0.03 16.4ab 丛芽多, 叶色嫩绿, 愈伤组织小
3 1.0 0.3 0.05 17.1a 丛芽多, 叶色淡绿, 愈伤组织大
4 1.5 0.5 0.10 15.6b 丛芽多, 叶色黄绿, 部分顶芽褐死, 愈伤组织大
同列数字旁不同小写字母表示在0.05水平上差异显著, 下表同。
表2 不同植物生长物质浓度配比对无籽罗汉果芽苗伸长的影响
Table 2 Effect of different concentration of plant growth substances on shoot elongation of seedless S. grosvenorii
处理
生长物质浓度/mg·L-1
茎粗/mm 苗高/cm 茎节数 芽苗生长情况
6-BA IBA GA3
5 0.05 0.05 0.1 0.96b 4.7b 3.20a 芽苗伸长较明显, 叶片大小不一, 叶色嫩绿
6 0.05 0.05 0.2 1.07ab 5.5a 3.28a 芽苗明显伸长, 部分植株节间过长, 叶片大呈绿色
7 0.05 0.1 0.1 1.24a 5.2ab 3.21a 芽苗明显伸长, 生长健壮, 叶片大且呈嫩绿色
8 0.05 0.1 0.2 0.87bc 5.4a 3.04ab 芽苗明显伸长, 茎蔓较细, 叶片大呈绿色
9 0.05 0.1 0 0.85c 3.6c 2.71b 芽苗伸长不明显, 细弱, 叶片小且呈现淡绿色
10 0.05 0 0.1 0.82c 3.8bc 2.56b 芽苗伸长不明显, 细弱, 叶片小, 部分叶片呈现淡黄色
11 0 0.1 0.1 0.79c 3.2c 2.54b 芽苗伸长不明显, 细弱, 叶片小, 叶片翠绿色
陈继富: 无籽罗汉果的组织培养和快速繁殖 971
根的影响。从表3可以看出, 不同浓度的IBA或
NAA诱导生根率都在90%以上, 但移栽成活率有
一定差异, 不同浓度IBA处理的移栽后平均成活率
为96.8%, 而不同浓度NAA处理的只有89.9%。综
合来看, 以1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1 (处理14)为最适
生根培养基, 平均每株无根苗所产生的根数目为
4.3条(表3, 图1-E、F), 生根率和移栽成活率都达最
大值, 分别为96.7%和98.1% (表3, 图1-G、H)。
讨 论
本研究直接从无籽罗汉果优良母株上取材,
并诱导腋芽生成植株, 这样产生的种苗可保持母
株的优良经济性状, 克服了采用诱导愈伤组织成
苗容易产生变异的缺点(苏明坤等2002), 具有更加
实际的应用意义。
在植物组织培养中, 内源激素与外源激素起
着重要的调控作用, 植物生长物质的种类、水平
以及相互组合的选择对组织的产生与分化十分重
要。相关报道指出, 不同植物生长物质相互作用
比单一某种生长物质更能促进丛生芽或不定芽的
形成与增殖。林荣等(1985)配合使用6-BA 0.5~2
mg·L-1和 IBA 0.1 mg·L-1, 发现对罗汉果茎段形成芽
具有增效作用。黄燕芬和范成五(2005)将6~8 cm
高、带多个腋芽的罗汉果芽苗切割成长0.5 cm、
带一个腋芽的小段, 转移至MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IAA
0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+琼脂0.6%+蔗糖3%的增
殖培养基培养, 平均增殖倍数最大, 达8.5。且在此
水平上连续培养多代 , 其分化增殖能力比较恒
定。用单因子6-BA诱导蒲公英外植体试验中, 不
表3 不同浓度IBA和NAA对无籽罗汉果芽苗根系生长及移栽成活率的影响
Table 3 Effect of different concentration of IBA and NAA on root growth and survival rate of seedless S. grosvenorii
处理
生长物质浓度/mg·L-1 接种
生根株数/株 生根率/% 根数/条·株-1 根生长状况 移栽成活率/%
IBA NAA 数/株
12 0.1 0 30 28 93.3 2.6bc 主根发达, 根部几乎没有愈伤组织, 植株健壮 95.5
13 0.3 0 30 29 96.7 3.2b 主根发达, 根部愈伤组织小, 植株健壮 96.7
14 0.5 0 30 29 96.7 4.3a 主根发达, 愈伤组织小, 植株健壮 98.1
15 0 0.1 30 27 90.0 1.7cd 主根细弱, 愈伤组织小, 植株细弱 90.6
16 0 0.3 30 28 93.3 1.5d 主根细弱, 须根较多, 愈伤组织大, 植株细弱 89.3
17 0 0.5 30 28 93.3 2.4bc 主根细弱, 须根较多, 愈伤组织大, 植株细弱 89.8
定芽的诱导率小于20%, 植株容易枯萎, 配合一定
浓度NAA后诱导率达90%以上, 长势良好(孙怀娟
和魏小弟2008)。我们在预实验中曾使用单因子
6-BA或6-BA+IBA直接诱导丛生芽时, 发现芽长势
偏细弱, 叶片容易黄化。因此, 无籽罗汉果继代增
殖培养中设计了6-BA、IBA和GA3组合配方, 结果
表明, 无籽罗汉果的增殖系数随组合配方浓度的
升高而有所增高 , 但浓度过高不利于芽苗的生
长。因此, 以采用达到增殖系数高、丛芽多、叶
色嫩绿、愈伤组织小的最低配合浓度为宜。在芽
苗伸长阶段, 6-BA、IBA和GA3组合配方中缺少任
何一种生长物质, 均表现芽苗伸长不明显, 茎细叶
小(处理9~11)。说明3种不同植物生长物质相互作
用比某两种生长物质更能促进无籽罗汉果的伸长
与加粗。导致这一结果的原因是否与无籽罗汉果
染色体组数呈奇数倍有关, 还有待进一步研究。
植物组织培养生根阶段, 减少培养基中营养
成分和糖含量可刺激生根, 原因可能是在培养基
中营养元素浓度较高, 试管苗产生依赖性而不易
生根。本试验采用养分减半的1/2MS作为基本培
养基生根率均达90%以上。在选择IBA和NAA两
种植物生长物质分别进行生根试验中, 结果表明,
两者对组培苗生根均有一定的促进作用, 使用IBA
移栽后的成活率相对较高。其原因可能是NAA诱
导生根容易产生大量的愈伤组织, 影响了芽苗诱
导生根, 导致主根少, 须根较多, 在移栽前清洗根
部培养基时, 容易损伤甚至弄断根系所致。
本研究以无籽罗汉果无菌芽苗茎段作为外植
体, 获得了较高的增殖系数、生根率和移栽成活
植物生理学报972
率, 筛选出了无籽罗汉果组培苗快繁过程中各个
阶段所需的最佳培养基, 建立了一种稳定而高效
的无籽罗汉果组织培养与快繁技术体系, 从而为
无籽罗汉果工厂化快速育苗提供了技术支持。
参考文献
付长亮, 马小军, 白隆华, 赵鑫(2005). 罗汉果组织培养研究进展. 中
国中药杂志, 30 (5): 325~328
黄燕芬, 范成五(2005). 组织培养快速繁殖罗汉果种苗. 种子, 24
(8): 91~92
黄志江, 黄捷, 孙滢, 王霆, 刘国卿(1998). 罗汉果的药用研究. 广西
师范大学学报(自然科学版), 16 (4): 75~79
蒋水元, 蒋向军, 覃吉胜, 黄夕洋, 刘凤英(2009). 无籽罗汉果选育的
初步研究. 广西植物, 29 (4): 506~509
林荣, 王秀琴, 王润珍(1985). 罗汉果茎段离体培养研究. 广西植物,
5 (3): 273~277
齐一萍, 唐明仪(2001). 罗汉果果实的化学成分与应用研究. 福建医
药杂志, 23 (5): 158~159
苏明坤, 林顺权, 陈振光, 郑海柔(2002). 罗汉果的组织培养. 中国南
方果树, 31 (3): 43
孙怀娟, 魏小弟(2008). 蒲公英的组织培养研究. 热带农业科学, 28
(3): 4~7
张桂玲, 温四民(2006). 甜味植物研究进展. 安徽农业科学, 34 (18):
4712~4713