全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 61~67 61
收稿 2013-09-16　　修定 2013-11-08
资助 国家自然科学基金(31270655和30871727)和高等学校博士
学科点专项科研基金(20090014110014)。
* 共同通讯作者(E-mail: ybshen@bjfu.edu.cn, Tel: 010-62336563;
E-mail: cyhj@tsinghua.edu.cn, Tel: 010-62788971)。
蒙古沙冬青对灰斑古毒蛾重复取食响应的代谢组学分析
孙敬茹1,2, 张笑1,2, 沈应柏1,2,*, 杨海军3,*
1北京林业大学生物科学与技术学院, 北京100083; 2北京林业大学林木、花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京100083; 3清
华大学化学系微量分析测试方法与仪器研制北京市重点实验室, 北京100084
摘要: 植物对同种昆虫重复取食做出更有效的响应是植物适应自然界虫害周期性爆发的重要策略。为了研究蒙古沙冬青
对其主要害虫灰斑古毒蛾幼虫重复取食响应的代谢基础, 本实验采用基于核磁共振(NMR)的代谢组学技术, 分析了遭受同
一年不同代灰斑古毒蛾幼虫取食的蒙古沙冬青叶片和对照组幼苗叶片的代谢差异。结果表明, 仅遭受第一代幼虫取食叶
片在第二代幼虫期与对照之间代谢物存在较小差异, 而仅遭受第二代幼虫取食叶片与遭受两代幼虫取食叶片代谢差异显
著, 仅遭受第一代与仅遭受第二代幼虫取食的植株相邻分枝叶片差异显著。另外, 只有仅遭受第二代幼虫取食组幼苗表现
出处理叶片与相邻分枝叶片的显著代谢差异, 并且这种代谢差异为总体代谢的变化, 而并未表现为特定代谢物含量变化。
由此可见, 蒙古沙冬青能在代谢水平以很小的代谢变化来保存昆虫取食信息, 在遭受同种昆虫取食后, 代谢差异被放大, 而
且这种信息保存在遭受取食叶片中表现更明显。
关键词: 蒙古沙冬青; 灰斑古毒蛾; 同种昆虫; 代谢组学
Metabolic Effects of Early-Season Herbivores on the Response to Conspecific
Attack in Later-Season in Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.) Cheng f
SUN Jing-Ru1,2, ZHANG Xiao1,2, SHEN Ying-Bai1,2,*, YANG Hai-Jun3,*
1College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2Key Laboratory of Genetics
and Breeding in Forest Tree and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;
3Beijing Key Laboratory for Microanalytical Methods and Instrumentation, Department of Chemistry, Tsinghua University,
Beijing 100084, China
Abstract: More effective response to attack by subsequent conspecific herbivores in plants may be important
strategies to adapt to periodic outbreaks of some insects, however, the mechanism for plants to respond to this
kind of attack remains unclear. In order to investigate the metabolic basis of Ammopiptanthus mongolicus for
periodic attack of Orgyia ericae, seedlings infested with different generations of O. ericae larvae that lived in
early-season and later-season of a year were analyzed with nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabolic
technology. Results presented in this experiment indicated that leaves attacked by early-season herbivores
showed a minor difference in metabolic profiling at the later season compared with control, whereas leaves
attacked by later-season herbivores showed significant difference compared with leaves infested with both
early-season and later-season herbivores. For leaves on sister branches, only leaves from seedlings infested with
early-season and later-season herbivores showed significant difference. Additionally, significant difference
between local and leaves on sister branches only existed in seedlings attacked by later-season herbivores.
Therefore, A. mongolicus save the information of O. ericae larvae infestation with minor metabolic changes
mainly in local leaves, which would be amplified when attacked by conspecifics.
Key words: Ammopiptanthus mongolicus; Orgyia ericae; conspecifics; metabolomics
植物不同于动物, 不能自主移动, 因而在其栖
息地内会周期性遭受同种植食性昆虫危害。依据
自适应可塑性模型(Karban和Adler 1996), 植物曾
经或正在遭受的环境能够为未来环境提供信息,
因而曾经遭受植食性昆虫取食的植物可能再次遭
受同种昆虫取食时抗性更强。在植物和植食性昆
虫斗争的漫长过程中, 植物进化了复杂而精确的
植物生理学报62
核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)虽
然没有质谱灵敏度高(Kim等2010), 但测定时不必
做衍生化预处理, 测定不受离子化效率影响, 化学
位移漂移小, 从混合物中解析结构能力强(Kim等
2010; Krishnan等2005; Fan 1996)。基于NMR的代
谢组学技术, 样品预处理简单, 测定速度快, 重复
性好, 结构解析能力强, 近10年来已成为研究植物
与昆虫相互关系的常用技术手段并得到了广泛应
用, 如鉴定植物源抗虫性化学物质(Leiss等2013,
2009), 分析植物响应昆虫取食代谢变化和系统性
(Sun等2013; Widarto等2006)等。
蒙古沙冬青为第三纪残遗种, 存活时间长且
虫害严重, 灰斑古毒蛾是沙漠地区灌木林危害最
严重的害虫之一, 一年两代, 对蒙古沙冬青的主要
危害部位为嫩叶和荚果(王雄和刘强2002)。近年
来, 灰斑古毒蛾周期性爆发, 造成蒙古沙冬青繁殖
材料短缺、种群更新慢、现有种群数量减少等危
害(王雄和刘强2002)。本实验以蒙古沙冬青幼苗
为材料, 采用基于NMR的代谢组学技术, 分析了仅
遭受第一代幼虫取食组、仅遭受第二代幼虫取食
组、遭受两代幼虫取食组和对照组沙冬青幼苗叶
片的代谢差异, 旨在揭示昆虫周期性爆发中植物
的代谢响应规律。
材料与方法
1 实验设计
采用基于NMR的代谢组学技术和多元数据分
析研究蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus
(Maxim.) Cheng f]对灰斑古毒蛾(Orgyia ericae
Germar)幼虫重复取食的代谢响应。为了分析遭受
前一代幼虫取食植株对下一代幼虫取食的影响,
将蒙古沙冬青幼苗分为4组: 对照组、仅遭受第一
代幼虫取食组、仅遭受第二代幼虫取食组、遭受
两代幼虫取食组, 取样时间相同。将对照组叶片
与第二代幼虫期仅遭受第一代幼虫取食组叶片进
行对比, 分析第一代幼虫取食诱导代谢差异的残
留; 对照组叶片与仅遭受第二代幼虫取食组叶片
作对比, 用于分析灰斑古毒蛾幼虫取食短期内诱
导的代谢变化; 仅遭受第二代幼虫取食组叶片与
遭受2次幼虫取食组叶片对比, 以分析第一代幼虫
取食对蒙古沙冬青响应第二代同种昆虫取食响应
机制来识别和响应特定昆虫的侵袭。然而, 目前
植物对同种昆虫周期性取食响应的机理并不清
楚。
目前的研究发现, 植物遭受昆虫取食后的同
一季节甚至两年内会影响之后取食昆虫的取食行
为、产卵选择、生长、繁殖等, 并且这种影响对
同种取食昆虫的表现更强烈。Poelman等(2008)以
抗虫和不抗虫的两个白菜品种为实验材料, 研究
发现, 第一次昆虫取食会不同程度影响植株对同
种昆虫再次取食响应中抗性相关基因的表达, 降
低第二次取食昆虫的生长量, 减少取食昆虫的种
群数量。Cornelissen等(2011)的研究结果表明, 当
年整个季节的虫瘿存活率与这个季节早期虫瘿数
成反比。以杆芥为实验材料的实验结果也表明,
取食曾经遭受菜粉蝶幼虫取食杆芥的菜粉蝶幼虫
生长速度与对照相比慢大约30%, 并且取食遭受过
甘蓝叶蚤取食叶片的甘蓝叶蚤死亡率与对照相比
提高84% (Traw和Dawson 2002)。甜菜夜蛾取食后
的番茄植株也表现出对之后甜菜夜蛾幼虫存活
率、生物量、取食量和产卵数的负面影响(Rodriguez-
Saona等2005)。因而, 早期昆虫取食对叶片的影响
可能在较长时期内可以保存, 并且在遭受同种昆
虫取食时能做出更有效的识别和响应。
植物识别和响应昆虫取食首先表现为基因转
录前的早期事件, 如细胞膜超极化、胞质Ca2+含量
变化等, 然后为信号物质转导, 再到转录变化, 最
终表现为代谢物的变化(Maffei等2007)。取食诱导
的代谢变化是早期事件、转录和翻译变化的结果,
与植物生理紧密相关, 反映了植物对取食刺激的
最终反应。遭受昆虫取食的植株中不仅会合成对
取食昆虫具有毒害、威慑以及引起其消化不良的
次生代谢物, 初级代谢产物如氨基酸、有机酸、
糖类等含量也会发生变化(Sun等2013; Liu等2010b;
邓文红等2008)。有研究表明, 遭受昆虫取食叶片
在当年的很长时间内单宁含量增加(Cornelissen等
2011; Liu等2010a), 因而, 植食性昆虫取食诱导代
谢变化的残留可能是植物对之后取食昆虫产生影
响的基础, 而能同时分析植物初级代谢物和次级
代谢物及反映植物整体代谢状态的代谢组学技术,
可能是分析前期昆虫取食对植物响应同种昆虫第
二次取食机理的有效工具。
孙敬茹等: 蒙古沙冬青对灰斑古毒蛾重复取食响应的代谢组学分析 63
的影响; 仅遭受第一代幼虫取食组叶片与仅遭受
第二代幼虫取食组叶片的对比, 用于分析第一代
幼虫取食诱导代谢变化残留的程度。另外, 取相
邻枝条叶片, 用于分析昆虫取食诱导代谢变化的
系统性。
2 植物材料和昆虫材料
于2010年4月, 将一年生蒙古沙冬青幼苗由内
蒙古鄧口运送至北京林业大学苗圃, 培养于自然
光照温室, 每周浇一次水。2012年5月, 选取有2个
分支(每个分支大小相似)且生长有6片健康当年生
叶片的植株用于实验。于内蒙古阿拉善左旗的蒙
古沙冬青植株上采集二龄灰斑古毒蛾幼虫, 在北
京林业大学光照培养箱培养至三龄, 选取大小基
本一致、活泼的三龄幼虫用于实验。
3 昆虫取食处理
以三年生蒙古沙冬青幼苗和灰斑古毒蛾幼虫
为实验材料, 设置4组处理(每个处理组5个重复):
(1)对照组(未遭受取食); (2)仅遭受第一代幼虫取
食组; (3)仅遭受第二代幼虫取食组; (4)遭受两代幼
虫取食组。所有处理幼苗均只有一个分枝遭受取
食。幼虫放入时间为取食处理第一天的17:00 (每
个植株2条幼虫), 移除时间为第二天8:00, 4组处理
的采样时间相同, 均为第二代幼虫取食处理后第
三天的8:00。第一代和第二代幼虫取食处理开始
时间分别为2012年的5月15日和7月18日, 实验均
在晴天进行。采集的样品用铝箔包好, 快速放入
液氮, 以终止其代谢变化, 然后转入超低温冰箱
(–80 ℃)保存。
4 样品提取
采用中极性提取液(D2O:CD3OD=1:1)
(Sun等
2013; Kim等2010), 以同时分析蒙古沙冬青叶片中
初级代谢产物和次级代谢产物。
5 NMR测定和谱图处理
所有NMR谱图采用JEOL 600 M超导脉冲傅
里叶变换核磁谱仪采集, 控温25 ℃。1H NMR谱测
定采用反向探头, 测定参数如下: 扫描次数32次,
采样点数32 K, 谱宽9 kHz, 90°脉冲宽度5.2 μs, 弛
豫时间15 s。预饱和脉冲序列用于抑制残余水分
子信号。2D谱图包括J-分解谱、1H-1H相关谱(1H-1H
COSY)、1H-1H全相关谱(1H-1H TOCSY)、异核单
量子相干光谱(HSQC)和异核多量子相干谱(HMBC),
参考Kim等(2010)的方法设定参数。采用Delta
4.3.6 (JEOL)进行1H NMR谱图处理, 时域信号傅里
叶转换前零填充到64 K, 线宽因子设为0.3, 傅里叶
转换后, 手动调整基线和相位, 将TMSP化学位移
标记为0。
6 数据处理
经谱图处理的1H NMR谱用Mnova 8.1.2将
0.1~10.0 ppm进行0.004的分段积分, 积分数据去除
水和甲醇化学位移处数据后用于主成分分析(PCA)
和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) (Trygg
2002), 差异显著结果进行200次排列交叉验证以避
免过拟合。PCA和OPLS-DA用RStudio 2.14.2完
成。OPLS-DA皮尔逊积矩相关系数0.811作为统计
学差异显著的阈值(n=5, P<0.05)。
实验结果
1 化合物鉴定
依据本实验室原有结果(Sun等2013)进行化合
物鉴定, 鉴定的代谢物包括脂肪酸(末端的— CH3)、
α-亚油酸类似物、乙醇、亚油酸或苏氨酸、乙
酸、草酰乙酸、乙醇酸、琥珀酸、丙酮、胆碱、
丙氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、丝氨
酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、松醇、肌醇、
对羟基苯衍生物1、对羟基苯乙酸、葫芦巴碱、
腺嘌呤。
2 灰斑古毒蛾取食对处理叶片代谢的影响
图1显示, 仅遭受第一代灰斑古毒蛾幼虫取食
处理的叶片与对照相比, 差异不显著(图1-A); 仅遭
受第二代灰斑古毒蛾幼虫取食叶片与对照相比,
差异显著(图1-B); 同时遭受两代灰斑古毒蛾幼虫
取食的叶片与对照相比, 差异不显著(图1-C); 同时
遭受两代幼虫取食叶片与仅遭受第二代幼虫取食
叶片相比差异显著(图1-D)。与仅遭受第二代幼虫
取食相比, 遭受两代幼虫取食处理的叶片中对羟
基苯乙酸、蔗糖、对羟基苯衍生物1含量增加, 而
松醇、胆碱、葫芦巴碱和乙醇酸含量降低 (图
1-E)。
对照与仅遭受第一代幼虫取食叶片的主成分
分析得分图表明, 对照叶片和曾经遭受第一代幼
虫取食叶片各自聚在一起, 差异不显著。因而, 曾
经遭受第一代幼虫取食叶片与对照叶片相比, 代
植物生理学报64
谢存在差异, 未达到显著水平。仅遭受第二次幼
虫取食叶片与遭受两代幼虫叶片代谢差异显著则
表明, 第一代幼虫取食影响了蒙古沙冬青叶片对
同种昆虫第二次取食的代谢水平响应。因而, 对
于处理叶片, 第一次昆虫取食对蒙古沙冬青响应
同种昆虫的第二次取食在代谢水平产生了影响,
而这种影响在第二代幼虫期只遭受第一代幼虫取
食叶片的代谢水平上并不明显。
3 灰斑古毒蛾取食对相邻分枝叶片代谢的影响
由图2-A~C可见, 与对照相比, 仅遭受第一代
幼虫取食、仅遭受第二代幼虫取食和同时遭受两
代幼虫取食植株相邻分枝叶片的代谢均未发生显
著变化, 并且这3组叶片与对照相比的主成分分析
得分图中也不存在明显的分组趋势。而仅遭受第
二代幼虫取食植株相邻分枝叶片与同时遭受两代
幼虫取食和仅遭受第一代幼虫取食的相比, 代谢
差异均较大, 前者的差异虽未达到显著水平, 但在
主成分分析得分图中分组趋势相对明显, 而与后
者的差异达到显著水平(图2-D)。与仅遭受第一代
幼虫取食相比, 仅遭受第二代幼虫取食植株的相
邻分枝叶片表现为乙醇含量增加, 而蔗糖和丝氨
酸含量降低(图2-E)。因而, 第一代幼虫取食和第
二代幼虫取食均诱导了相邻分枝叶片的代谢变化,
但这种代谢变化与正常叶片相比差异不显著, 且
第一代幼虫取食诱导的代谢变化影响了蒙古沙冬
青相邻分枝对同种昆虫第二次取食的代谢响应,
而含量发生显著变化的代谢物仅表现为乙醇、蔗
糖和丝氨酸。
4 灰斑古毒蛾取食对蒙古沙冬青代谢影响的系统
性分析
PCA结果表明, 处理叶片和相邻分枝叶片代
谢存在差异显著的只有仅遭受第二代幼虫取食的
处理植株, 其他3组不存在显著差异(图3-A~D)。
1H谱图中差异显著部位化学位移跨度均很小, 并
不能鉴定为特定的化合物(图3-E)。由于植物对昆
虫取食的系统诱导抗性依赖于可在植株内传递的
信号物质及其对昆虫取食诱导挥发物信号的识别,
仅遭受第二代幼虫取食植株可能与曾经遭受第一
代幼虫取食又遭受第二代幼虫取食植株在信号传导
和昆虫取食诱导挥发物识别方面存在差异。
图1 遭受昆虫取食叶片的PCA得分图、OPLS-DA得分图及载荷图
Fig.1 PCA and OPLS-DA scores and loading plots for leaves infested with herbivores
A: 仅遭受第一代幼虫取食叶片与对照的PCA得分图; B: 仅遭受第二代幼虫取食叶片与对照的PCA得分图; C: 遭受两代幼虫取食叶
片与对照的PCA得分图; D: 仅遭受第二代幼虫取食叶片与遭受两代幼虫取食叶片对比的OPLS-DA得分图; E: 仅遭受第二代幼虫取食叶片
与遭受两代幼虫取食叶片对比的OPLS-DA载荷图。▲: 对照; ■: 仅遭受第一代幼虫取食; ◆: 仅遭受第二代幼虫取食; ●: 遭受两代幼虫取
食。载荷图中横向为1H谱图分段积分的化学位移, 纵向为逆转换后的载荷值, 皮尔逊积矩相关系数用颜色表示; 图2和3同此。
孙敬茹等: 蒙古沙冬青对灰斑古毒蛾重复取食响应的代谢组学分析 65
图2 遭受昆虫取食植株相邻分枝叶片的PCA得分图、OPLS-DA得分图及载荷图
Fig.2 PCA and OPLS-DA scores and loading plots for leaves from sister branches of seedlings infested with herbivores
A: 仅遭受第一代幼虫取食植株相邻分枝叶片与对照的PCA得分图; B: 仅遭受第二代幼虫取食植株相邻分枝叶片与对照的PCA得分
图; C: 遭受两代幼虫取食植株相邻分枝叶片与对照的PCA得分图; D: 仅遭受第一代幼虫取食与遭受第二代幼虫取食植株相邻分枝叶片对
比的OPLS-DA得分图; E: 仅遭受第一代幼虫取食与遭受第二代幼虫取食植株相邻分枝叶片对比的OPLS-DA载荷图。Δ: 对照; □: 仅遭受
第一代幼虫取食; ◇: 仅遭受第二代幼虫取食; ○: 遭受两代幼虫取食。
图3 遭受昆虫取食叶片与相邻分枝叶片的PCA得分图、OPLS-DA得分图及载荷图
Fig.3 PCA and OPLS-DA scores and loading plots for leaves infested with herbivores and
the corresponding leaves from sister branches
A: 对照植株处理叶片(▲)与相邻分枝叶片(Δ)对比的PCA得分图; B: 仅遭受第一代幼虫取食植株处理叶片(■)与相邻分枝叶片(□)对比
的PCA得分图; C: 遭受两代幼虫取食植株处理叶片(●)与相邻分枝叶片(○)对比的PCA得分图; D: 仅遭受第二代幼虫取食植株处理叶片(◆)
与相邻分枝叶片(◇)对比的OPLS-DA得分图; E: 仅遭受第二代幼虫取食植株处理叶片与相邻分枝叶片对比的OPLS-DA载荷图。
植物生理学报66
讨　　论
准确识别取食昆虫是植物做出正确反应的基
础(Hilker和Meiners 2010), 而对曾经取食害虫进行
记忆从而在遭受同种害虫危害时更加准确做出判
断, 可能是植物应对自然环境同种虫害周期性爆
发的基础(Gális等2009)。本实验结果表明, 第二代
幼虫爆发期仅遭受第一代幼虫取食叶片与对照叶
片相比存在很小的代谢差异, 这种很小的差异在
幼苗再遭受灰斑古毒蛾幼虫取食后得到了放大;
对于相邻分枝上的叶片, 第二代幼虫爆发期第一
代幼虫取食诱导的代谢变化残留与处理叶片相比
更小 , 而且再次遭受取食时差异的放大程度也
小。因而, 蒙古沙冬青对灰斑古毒蛾取食残留的
代谢变化很小, 但能显著影响其对这种害虫的再
次取食, 而且这种记忆性代谢变化及诱导放大过
程主要表现在处理叶片, 相邻分枝叶片的表现较
弱。蒙古沙冬青用很小的代谢变化来保存灰斑古
毒蛾取食特性, 可能与虫害的不可预见性及抗虫
过程耗能有关。
植物能够通过组成型抗虫性和诱导型抗虫性
来抵御昆虫的危害。组成型抗虫性表现为持续的
抗虫性状态, 如对昆虫取食形成物理屏障的生物
形态变化的蜡质层、表皮毛等; 而诱导型抗虫性
则为昆虫侵袭后引起的抗虫性措施, 如诱导合成
某些对取食昆虫具有毒害、威慑以及引起其消化
不良的次生代谢物和蛋白酶抑制剂等。在抗虫性
方面, 植物能够在组成型抗虫性和诱导型抗虫性
之间做出权衡(Kempel等2011)。目前对诱导型抗
虫性的研究较多, 如昆虫取食诱导抗虫相关基因
转录上调(Dinh等2013; Govind等2010; Philippe等
2010), 伤信号物质(如茉莉酸类化合物)含量增加
(Yang等2011; Stork等2009), 抗虫性相关次生代谢
物(Adio等2011; Jassbi等2010; Burow等2009)和抗
虫蛋白含量(Yang等2011; Vandenborre等2010)提高
等。本实验结果表明, 蒙古沙冬青保存灰斑古毒
蛾取食信息从而影响再次遭受相同昆虫取食的响
应过程, 可能与诱导型防御相似, 而第一代幼虫诱
导的较少代谢残留信息, 可能是蒙古沙冬青响应
同种昆虫取食的基础。
相对于灰斑古毒蛾幼虫取食对同一枝条系统
叶片代谢的影响(Sun等2013), 相邻分枝系统叶片
的代谢变化很小, 因而蒙古沙冬青可能优先调整
遭受昆虫取食同一枝条上系统叶片的代谢变化。
相邻分枝系统叶片与对照相比代谢变化虽然很小,
但同样也包含了灰斑古毒蛾第一次取食的信息,
至于相邻分枝系统叶片遭受灰斑古毒蛾幼虫取食
后这种微小的代谢变化能否扩大, 还有待于进一
步分析。相邻分枝叶片较小的代谢差异可能是由
植株茎传递的信号物质造成的, 也可能是昆虫取
食诱导挥发物引起的(刘武等2012; 彭金英和黄勇
平2005)。
另外, 昆虫取食影响随后取食昆虫的现象不
仅表现在同种昆虫之间, 不同种昆虫之间也存在
相互作用。如菜青虫取食后的两个野生萝卜品种
降低甜菜夜蛾生长量, 减少蝗虫的侵袭(Agrawal
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