全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 2 3
甘薯EST资源的 SSR信息分析
黄立飞, 房伯平 *, 陈景益, 张雄坚, 罗忠霞
广东省农业科学院作物研究所, 广州 510640
提要: 从NCBI公共数据库下载获得 22 371条甘薯 EST序列, 去除低质量的和冗余的序列后, 得到总长为 5.09×103 kb的
9 204条唯一序列。从这些序列中搜索到总共 436个 SSR位点, 平均相距 11.68 kb出现一个 SSR。这些 SSR的出现频率和
平均长度分别为4.4%和24.28 bp。在2~6 bp的重复基元中, 六核苷酸重复基元出现频率最高(30.96%), 其次是三核苷酸重
复基元(29.59%)和二核苷酸重复基元(24.54%)。出现最多的重复基元是 AG/CT (16.28%), 其次是AAG/CTT (11.01%)。
关键词: 甘薯; EST-SSR; 基元
Analysis of SSR Information in EST Resource of Sweet Potato [Ipomoea batatas
(L.) Lam]
HUANG Li-Fei, FANG Bo-Ping*, CHEN Jing-Yi, ZHANG Xiong-Jian, LUO Zhong-Xia
Crop Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: In this study, 22 371 ESTs of sweet potato (Ipomoea batatas) in the database of NCBI were down-
loaded and some redundants or with low qualities were removed, finally 9 204 unique sequences with total length
about 5.09×103 kb were obtained. In total, 436 SSRs (4.4%) containing unique sequences were identified. The
overall average length of SSRs was 24.28 bp. This was equivalent to 1 SSR per 11.68 kb EST sequence. About
30.96% of the SSRs was hexanucleotides, 29.59% was trinucleotides, 24.54% was dinucleotides, and the
remaining 14.91% consisted of tetra- and pentanucleotides. Among the identified SSRs, AG/CT was the most
frequent (16.28%) followed by AAG/CTT at 11.01%.
Key words: sweet potato; EST-SSR; motifs
收稿 2008-09-26 修定 2008-11-11
资助 国家高技术研究发展计划(“863”计划) (2006AA100107)、
国家科技基础条件平台项目(20 05DKA210 0205 )、广
东省自然科学基金项目(8151064001000033)、广东省
科技计划项目(20 08B020 20000 3)。
* 通讯作者(E-m a i l : bp fa ng0 1 @ 1 6 3 .com ; T el : 0 2 0 -
8 5 5 1 4 2 4 2 )。
甘薯为同源六倍体, 包括 90条染色体, 大约
1 050 Mbp DNA, 并且自交不亲和, 这些特性延缓了
甘薯分子生物学研究(Arumugana than和 Earle
1991)。近年来包括随机扩增长度多态性 DNA
(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、简
单序列重复间区(inter simple sequence repeat, ISSR)
和扩增片段长度多态性(amplification fragment length
polymorphism, AFLP)等分子标记技术的利用促进
甘薯的遗传育种、遗传图谱构建、遗传多态性分
析和基因定位等方面研究(Huang和 Sun 2000;
Gichuki等 2003; Cervantes-Flores等 2008)。而简
单序列重复(simple sequence repeat, SSR)也称作微
卫星(microsatellite)标记具有多态性高、多等位
性、呈共显性遗传、重复性高、易于用 PCR检
测和在基因组上分布均匀等特点, 克服了其他标记
的缺点, 在甘薯中具有广泛的应用前景(姜树坤等
2007; Buteler等 1999; Hu等 2004)。
但是, 因甘薯基因组开发 SSR标记难度大, 开
发成本高, 费时费力, 引物数量偏少, 至今报道的甘
薯SSR引物仅有100多对, 限制了SSR技术在甘薯
中的利用(Buteler等 1999; Hu等 2004; Ghislan等
2 0 0 5 )。采用公共数据库登录的表达序列标签
(expressed sequence tag, EST)序列开发 EST-SSR
是一种相对简便、经济的途径。EST-SSR位点多
位于转录区, 非常保守, 是真正与性状连锁的标记;
同时, EST-SSR具有通用性, 可进行比较基因组学
研究(金基强等 2006)。近年来, 功能基因组学的发
展促进了EST测序工作的开展, 使得公共数据库中
的 EST数量迅速增长。这些大量的而可以共享的
EST序列为分子标记的开发和研究提供了丰富的序
列资源。这些序列资源已相继在马铃薯、水稻、
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大麦、小麦、木薯、油菜、人参、茶树和东
方牡蛎等多种植物开发了EST-SSR标记(Holton等
2002; Thiel等 2003; Feingold等 2005; Peng等2005;
Rota等2005; Wang和Guo 2007; 金基强等2006; 李
小白等2007; 杨成君和王军2008; 彭丁文等2008)。
截至2008年9月为止, 在NCBI数据库中已登
录了 22 371条甘薯 EST, 但是目前还没有用这些
EST大规模开发SSR的报道。本文对现有甘薯EST
中的SSR信息进行了分析, 以了解甘薯EST-SSR的
发生频率和特点, 为进一步建立 EST-SSR标记, 进
行分子生物学研究建立基础。
材料与方法
甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam] EST来自NCBI
(美国国家生物技术信息中心)数据库(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/), 共计 22 371条。采
用 EST-trimmer软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/
misa/download/est-trimmer.pl)除去5端或3端50 bp
的ploy T或ploy A以及那些长度小于100 bp的EST
序列; 对于长度大于 700 bp的 EST则保留其 5端
700 bp。
预处理后的 EST, 通过软件 CAP3 (http://seq.
cs.iastate.edu/capdownload.html)进行片段重叠群分
析和聚类, 拼接时设定的初始装配参数为默认值
(Huang和Madan 1999)。
用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/
misa/)对聚类后的 EST进行 SSR搜索。筛选标准
为: 搜索的长度标准为二核苷酸、三核苷酸、四
核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数
1 0、6、5、4、3 次以上。同时, 也筛选中间
被少数碱基(间隔小于或等于100 bp)打断的不完全
重复的 SS R。
用SSR出现频率和SSR平均分布距离来描述
EST-SSR, 同时定义出现频率前 2位的重复基元作
为优势重复基元。计算公式为: (1) SSR出现频率,
fc=c/n×100%, c为搜索到的 SSR数量, n为无冗余
EST数量; (2) SSR平均分布距离, fN=N/c, N为无冗
余 EST数量的总碱基数。
实验结果
1 EST序列的获得与组装
截至 2008年 9月 1日为止, 在NCBI数据库中
已登录了 22 371条甘薯的 EST序列, 这些 EST序
列分别来源于 11个不同类型的甘薯 cDNA文库。
构建这些cDNA文库的材料以块根为主, 其EST的
数量最多, 达到了 21 979条, 而来自叶片的有 178
条, 试管苗 214条。
全部 EST序列经过 EST-trimmer软件处理后,
用 CAP3软件进行组装。组装后产生了 9 204个唯
一序列, 序列总长为 5 092.82 kb, 其中包括 3 059个
重叠群和 6 145个单一序列。
2 EST-SSR的出现频率
在搜索的 9 204个唯一序列中, 总共发现了分
布于 407个唯一序列的 436个SSR位点, 占全部唯
一序列的 4.4%。在含有 SSR的 407条唯一序列中
没有发现包含3个以上SSR位点的唯一序列, 其中
包含 1个 SSR位点的有 378条, 包含 2个 SSR位点
有 29条。从分布情况来看, 甘薯 EST-SSR平均每
11.68 kb就出现 1个 SSR, 但不同重复类型间差异
很大(表 1 )。
3 甘薯EST-SSR的特性
在搜索出的甘薯EST-SSR中, 总共观察到134
种重复基元(表 2 )。其中二、三、四、五、六
核苷酸重复基元分别有 3、10、12、24、85种。
从出现的频率来看, 二核苷酸重复基元中的优势重
复基元为 AG/CT和 AT/AT, 出现频率分别为
表 1 SSR在甘薯唯一序列的出现频率
Table 1 Occurrence frequency of SSRs in a set of sweet potato unique sequences
重复类型 SSR数目 占全部 SSR比例 /% 出现频率 /% 平均分布距离 /kb
二核苷酸 107 24.54 1.16 47.60
三核苷酸 129 29.59 1.40 39.48
四核苷酸 27 6.19 0.29 188.62
五核苷酸 38 8.71 0.41 134.02
六核苷酸 135 30.96 1.47 37.72
总计 436 100.00 4.74 11.68
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16.28%和7.57%; 三核苷酸重复基元中的优势重复
基元为AAG/CTT和AAT/ATT, 出现频率分别为
11.01%和5.50%; 四核苷酸重复基元中的优势重复
基元AAAG/CTTT和AAAT/ATTT, 出现频率分别
为 1.15%和 1.61%; 五核苷酸重复基元中的优势重
复基元为AAAAC/GTTTT和AATAT/ATATT, 出现
频率分别为 1.15%和 0.92%; 而在六核苷酸重复基
元中的优势重复基元为 AAAAAG/CTTTTT和
AAAAAT/ATTTTT, 出现频率均为 1.61%。由上述
结果说明, 不同重复基元中出现频率最高的是
AG/CT, 其次是AAG/CTT。10个优势重复基元占
到整个 SSR出现频率的 48.39%, 其中二、三核苷
酸的优势重复基元占到整个优势重复基元的
83.41%。
从图1可以看出, 大部分甘薯EST-SSR的位点
长度都集中在 18~20 bp范围内, 其次是分布在
20~30 bp范围内, 长度大于 30 bp的位点只占很少
一部分。具体而言, 甘薯 EST-SSR位点长度分布
在 18~20 bp范围内的约有 250个, 占到整个 EST-
SSR的 59.67%; 在 20~30 bp范围内有 120个, 占到
整个 EST-SSR的 28.64%; 而长度大于 30 bp的则
不到 50个, 百分率仅为 11.69%。EST-SSR位点的
平均长度为 24.28 bp。
讨　　论
本文对22 371条甘薯EST组装后进行了搜索,
发现 436个 SSR, 其出现频率为 4.4%, 平均分布距
离为 11.68 kb。从目前的报道来看, 这个平均分
布距离高于茶树(2.61 kb) (金基强等 2006)、油菜
(4.34 kb) (李小白等 2007)、人参(5.7 kb) (杨成君
和王军 2008)、木薯(6.02 kb) (彭丁文等 2008), 低
于水稻(11.81 kb)、小麦(17.42 kb)、大豆(23.80
kb)和玉米(28.32 kb) (Gao等 2003)等植物, 表明甘
薯 EST-SSR丰富度处于中等水平。
目前, 由于 EST-SSR的频率一般是通过搜索
数据库中的EST序列而估算出的, 各个研究者在不
同的植物上对搜索 SSR重复类型和长度等标准的
不同 SSR筛选标准不同, 导致 EST-SSR的出现频
率也会有所变化, 例如金基强等(2006)对茶树的
EST-SSR筛选要求二核苷酸重复最少为 7次重复,
李小白等(2007)对油菜的筛选标准为二核苷酸重复
的次数在 6次或 6次以上, 而本文则要求二核苷酸
至少要重复 10次或 10次以上, 这样严格的筛选标
准, 必然导致 SSR出现频率降低。另一方面, 也
与所分析数据的多少以及对数据的分析程序密切相
表 2 重复基元类型的优势重复基元的比较分析
Table 2 Comparative analysis of the predominant motifs in different motif types
重复基元 重复基元数目 优势重复基元 SSR数量 出现频率 /%
二核苷酸 3 AG/CT 7 1 16.28
AT/AT 3 3 7.57
三核苷酸 1 0 AAG/CTT 4 8 11.01
AAT/ATT 2 4 5.50
四核苷酸 1 2 AAAG/CTTT 5 1.15
AAAT/ATTT 7 1.61
五核苷酸 2 4 AAAAC/GTTTT 5 1.15
AATAT/ATATT 4 0.92
六核苷酸 8 5 AAAAAG/CTTTTT 7 1.61
AAAAAT/ATTTTT 7 1.61
总计 134 12 211 48.39
图 1 甘薯 EST-SSR位点长度的分布
Fig.1 The length distribution of EST-SSR loci
in the sweet potato
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关。本文对数据库中下载的所有 EST序列进行了
预处理, 并且去冗余、聚类和组装, 这样得到的
9 204个唯一序列, 搜索到 436个SSR位点, 而如果
不对这些EST序列进行处理, 按照相同的搜索标准
竟然能搜索到 1 151个 SSR位点。
大多数植物的EST-SSR主要为二、三核苷酸
重复类型, 但出现频率最高的重复基元类型则有所
差异(Wang和Guo 2007; 彭丁文等 2008; 杨成君和
王军 2008)。本文结果显示, 甘薯 EST-SSR主要集
中在二、三、六核苷酸, 其中六核苷酸比例最大,
占总EST-SSR的30.96%, 其次为三核苷酸重复, 再
次为二核苷酸重复, 这是已报道的其他物种所没有
的。即使在相同的搜索标准下, Gao等(2003)曾报
道小麦、水稻、玉米和大豆都以三核苷酸重复为
主, 没有出现以六核苷酸重复为主的特征, 这可能
是甘薯与这些物种间真实的差异。Hu等(2004)分
析 4 153条甘薯 EST的结果也表明, 二、三、六
核苷酸重复的SSR最多, 但三核苷酸重复比例最大,
其次为二核苷酸和六核苷酸, 这些差异可能与其搜
索标准、较少数量的 EST序列以及序列的冗余性
密切相关。本文中, 在二核苷酸重复基元中又以
AG/CT占有绝对优势, 这与报道的油菜(李小白等
2007)、木薯(彭丁文等 2008)、小麦、玉米、高
粱和水稻(Kantety等2002)等作物情况相同, 而三核
苷酸重复则以AAG/CTT为主, 与大豆、水稻(Gao
等 2003)、木薯(彭丁文等 2008)类似。范三红等
(2003)认为这些占优势的重复基元可能与其编码相
应蛋白质的使用频率较高有关。
Temnykh等(2001)认为, 当 SSR长度在 20 及
20 bp以上时, 在不同品种间显示出较高的多态性,
长度低于20 bp多态性就会降低。而在本文中EST-
SSR搜索就严格限定了EST-SSR的长度, 最低限度
为 18 bp, 这样得到的 EST-SSR全部为多态潜能高
的 SSR。Hu等(2004)的研究表明, 甘薯二、三、
六核苷酸重复的SSR的多态性较高, 而在本文中这
3类重复基元占的比重特别大, 所以作者所获得的
EST-SSR大多数是属于多态性潜能高的 SSR。因
此, 本文搜索出的甘薯EST-SSR应具有较高的利用
价值。
从整个分析结果看, 甘薯 EST-SSR出现频率
较高, 而且类型十分丰富。因此, 本文的结果为新
的 EST-SSR标记的开发、基因定位、遗传图谱
绘制和功能推测, 对甘薯分子标记的理论研究和育
种利用具有一定的参考意义。
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