全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (9): 922~927922
收稿 2012-05-10　　修定 2012-07-25
资助 国家自然科学基金(31070163)。
* 通讯作者 (E-mail: xiaofeng@sippe.ac.cn; Tel: 021-54924102)。
利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控
曾民环, 许德阳, 薛景石, 袁振环, 黄海, 崔晓峰*
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032
摘要: 叶的形态建成依赖于细胞不断地分裂增殖和不同类型细胞的特化。在叶发育早期, 叶细胞主要通过旺盛的有丝分裂
来增加原基中细胞的数目。随着叶片的生长, 叶细胞自顶部向基部逐渐退出有丝分裂进入内复制来增加细胞的倍性, 同时
伴随细胞的扩展和分化。本文介绍利用流式细胞仪研究双子叶模式植物拟南芥叶发育过程中细胞周期调控的方法和具体
研究实例。我们发现至少存在3种类型的细胞周期异常的拟南芥叶发育突变体。此外, 我们还介绍利用流式细胞仪测定
DNA复制效率的方法。
关键词: 拟南芥; 细胞周期调控; 流式细胞术; 叶发育
Study on the Cell Cycle Regulation during Leaf Development in Arabidopsis
thaliana by Flow Cytometry
ZENG Min-Huan, XU De-Yang, XUE Jing-Shi, YUAN Zhen-Huan, HUANG Hai, CUI Xiao-Feng*
National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biologi-
cal Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: Leaf morphogenesis relies on continuous cell proliferation and specification of distinct types of cells.
During early leaf development, leaf cells mainly undergo vigorous mitotic cell divisions to boost the number of
primordial cells. Along leaf growth, leaf cells gradually exit from the mitotic cell cycle from leaf tip to base and
enter the endoreduplication, which is frequently associated with cell expansion and differentiation, resulting in
cells with increased nuclear ploidy levels. Here we describe the methods and several examples employing flow
cytometry to investigate the cell cycle regulation during leaf development in Arabidopsis thaliana, a model
dicotyledonous plant. We found that there are at least three types of leaf developmental mutants with abnormal
cell cycle. In addition, we introduce the assay to measure the efficiency of DNA replication in Arabidopsis.
Key words: Arabidopsis; cell cycle regulation; flow cytometry; leaf development
在真核生物中, 细胞主要通过有丝分裂的方
式进行增殖。细胞有丝分裂周期(mitotic cell cycle)
通常也被简称为细胞周期, 是指连续分裂的细胞
从前一次分裂完成到下一次分裂完成所经历的活
动和所需要的时间。细胞周期在真核生物中高度
保守, 可分为有丝分裂期(M)、有丝分裂后间期
(G1)、DNA合成期(S)和合成后间期(G2) (Beem-
ster等2003; Inze和De Veylder 2006; De Veylder等
2007; Gutierrez 2009)。母代细胞在S期基因组
DNA复制成2份拷贝, 并在M期随细胞分裂平均分
配到2个子代细胞中。
除了有丝分裂周期, 在许多双子叶植物和动
物器官发育过程中, 一些细胞由于受发育信号和/
或环境因素的影响会在S期完成后跳过G2和M期
直接回到G1期, 重新开始DNA复制, 如此循环可形
成多倍体的细胞。这种重复进行DNA复制但并不
进行分裂的细胞周期被称为核内再复制周期(en-
docycle)或内复制(endoreduplication)。在双子叶植
物的叶、下胚轴、花器官和果实等器官发育过程
中, 内复制普遍发生并与细胞扩展和分化密切相
关(De Veylder等2007, 2011; Bramsiepe等2010)。细
胞退出有丝分裂进入内复制的时间控制对于器官
的形态建成至关重要, 过早或推迟进入都会影响
器官的生长发育(Hefner等2006; Takahashi等2008;
技术与方法 Techniques and Methods
曾民环等: 利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控 923
Roodbarkelari等2010)。
在细胞周期和内复制过程中 , 细胞核内的
DNA含量(细胞倍性)会发生变化。在有丝分裂周
期中, 处于G1期的体细胞为二倍体, 其DNA含量可
表示为2C (C值表示单倍体核的DNA含量), 而在S
期DNA复制完成后, 细胞变为四倍体, 即为4C细
胞。在G2期和M期细胞分裂开始前, 细胞内DNA
含量都维持4C, 因而单纯从DNA含量难以区分G2
期和M期的细胞。一旦有丝分裂发生, 母代细胞分
裂形成2个子细胞, DNA含量又变为2C。在许多植
物器官发育过程中, 伴随细胞的扩展和分化, 细胞
退出有丝分裂进入内复制, 导致细胞倍性呈指数
增长, 从2C、4C到8C、16C甚至更高(Beemster等
2005; Vlieghe等2005)。
流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞
仪对处在液流中的动、植物和微生物细胞或其它
微粒等进行快速定量分析和分选的技术。利用流
式细胞术可以精确地测定细胞内DNA的含量, 近
年来已在植物细胞倍性和细胞周期研究等方面得
到越来越广泛的应用。对于植物发育研究而言,
通过测定植物器官中一定数量细胞的DNA含量,
可以了解器官发育过程中细胞有丝分裂周期的进
程以及内复制开始的时间, 进而了解器官中细胞
的分裂和分化情况, 从而在细胞学水平理解器官
形态建成的机理。本文以模式植物拟南芥叶片发
育为例, 介绍利用流式细胞仪如何分析叶发育过
程中细胞周期的调控。
材料与方法
1 植物材料和培养
拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Colum-
bia-0 (Col-0)和Landsberg erecta (Ler)为本实验室
保存, m1和m3突变体是本实验室通过EMS诱变获
得的, m2突变体种子购自Arabidopsis Biological
Resource Center。拟南芥种子经4 ℃处理48 h, 均
匀撒播于人工土中, 或经70%乙醇消毒后均匀播种
在1/2MS平板上, 然后置放于恒温22~23 ℃的人工
培养室中生长, 培养条件为相对湿度80%, 光照强
度80~200 μmol·m-2·s-1, 连续光照。
2 流式细胞仪测定植物细胞倍性
取约0.1 g拟南芥叶片于无菌水中清洗干净后置
入干净的培养皿, 加入0.5 mL的细胞核提取及染色缓
冲液(NIM-DAPI 10; Beckman Coulter, CA, USA)后
用锋利的刀片在缓冲液中迅速将叶片切成碎片以释
放细胞核, 含有细胞核的提取物用孔径为40 μm的
滤网进行过滤, 取约0.3 mL滤液于MoFlo XDP 型
流式细胞仪(Beckman Coulter, CA, USA)进行测定, 利
用Summit软件(Beckman Coulter)进行数据分析。
3 EdU掺入分析DNA复制效率
EdU (5-乙炔-2’-脱氧尿苷, 5-ethynyl-2’-de-
oxyuridine)是一种胸腺嘧啶(T)核苷类似物, 能够
在DNA复制时代替胸腺嘧啶掺入到正在新合成的
DNA分子中。利用EdU掺入分析DNA复制效率的
原理是EdU核苷中含有炔烃, 在铜催化剂Cu(I)催
化下可与携带有荧光标记的叠氮化物发生共价反
应(也称为click反应), 从而被标记上荧光。利用流
式细胞仪的激光激发和检测系统, 可以通过检测
细胞中被标记的荧光信号来测定DNA复制的活性
(Kotogany等2010)。具体方法为: 取1/2MS平板上
生长2~5 d的植物, 于含有10 μmol·L-1 EdU的1/2MS
溶液中孵育1~2 h, 用PBS (10 mmol·L-1 NaH2PO4,
2.7 mmol·L-1 KCl和137 mmol·L-1 NaCl, pH 7.4)缓冲
液冲洗2次后, 置于含3.7%甲醛的PBS中室温固定
15 min, PBS冲洗2次后, 用含0.1% Triton X-100的
PBS溶液洗1次。固定后的材料, 根据Click-iT®
EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit for
flow cytometry试剂盒(Invitrogen, CA, USA)的说明
加入144 μL H2O, 1.6 μL buffer additive, 14 μL reac-
tion buffer, 6.7 μL Copper sulfate solution, 0.07 μL
Alexa Fluor 488 azide, 黑暗中室温反应30 min, PBS
冲洗2次后 , 然后用细胞核提取及染色缓冲液
(NIM-DAPI 10)制备核提取液进行流式细胞测定,
利用Summit软件进行数据分析。
4 Summit软件数据分析方法
利用Summit软件分析细胞倍性的方法为: 在
流式细胞仪上, 通过355 nm的紫外激光器激发, 在
第六荧光通道(FL6, 425~475 nm)接收检测DAPI信
号。在Summit软件中首先建立横、纵坐标分别为
颗粒的侧向角(SSC)信号和前向角(FSC)信号的坐
标系, 通过颗粒的大小, 初步用门(gate)选择合适的
细胞群体进行下一步的分析。对上述的用门选中
的颗粒, 建立横、纵坐标分别为FL6-H (logarithmic
植物生理学报924
scale)强度和Counts (检测细胞数目)的直方图; 以
及横、纵坐标分别为FL6-H和SSC-Log-H的散点
图坐标系。在直方图坐标系中, 具有不同DNA含
量的颗粒具有不同的峰分布, 表示不同倍性细胞的
分布情况。用散点图对不同DNA含量的细胞数目
进行统计分析, 可得到不同倍性细胞所占的比例。
利用Summit软件分析DNA复制效率的方法
为: FL6通道检测DAPI信号的参数设定同上, 并建立
上述坐标系, 确定代表细胞核的群体。通过488 nm
的蓝激光器激发, 在第一荧光通道(FL1, 515~545
nm)接收检测Alexa Flour 488信号。建立双通道散
点坐标系(biparametric plots)同时分析Alexa Fluor
488信号与DAPI信号。纵坐标为FL1-H, 代表所检
测到的Alexa Flour488信号(EdU)的荧光强度, 横坐
标设为FL6-H, 代表所检测到的DAPI信号的荧光
强度。根据阴性对照的纵坐标信号大小, 确定代
表EdU标记的Alexa Flour488信号的阈值。以此为
依据, 分析EdU信号占总信号的比例来反映DNA
复制的效率。
结果与讨论
1 利用流式细胞仪分析野生型拟南芥叶片发育过
程中细胞周期的变化
利用流式细胞仪分析拟南芥第一对叶发育过
程中细胞的倍性变化, 可以了解叶发育过程中细
胞有丝分裂周期的变化情况以及叶发育的进程
(Beemster等2005; Vlieghe等2005)。分析野生型
Col-0第一对叶片细胞的倍性发现, 播种后第9天
(days after sowing, DAS)时2C和4C细胞所占比例
分别为67%和30%, 而8C及以上倍性的细胞所占比
例很小(图1-A)。随着叶原基的生长, 2C细胞迅速
减少, 而4C细胞的比例随之增加, 在DAS 10~11之
间, 2C和4C的细胞数目达到平衡, 各占49%左右(图
1-A), 表明此时细胞正在进行旺盛的有丝分裂来增
加叶片中的细胞数目, 2C和4C细胞可分别代表处
于G1和G2期的细胞(Takahashi等2008)。从11 DAS
开始, 伴随2C和4C细胞的减少, 而8C细胞的比例
开始显著增加, 16C、32C甚至64C的细胞也开始出
现(图1-A), 表明部分叶细胞开始退出有丝分裂进
入内复制来增加细胞的倍性。
2 利用流式细胞仪分析拟南芥突变体对有丝分裂
周期的影响
拟南芥m1突变体是一个叶片中细胞数目增加
而细胞扩展受到影响的突变体。为了研究m1突变
体叶片细胞增加的原因, 我们比较了野生型与m1
突变体叶发育过程中细胞倍性的变化。在野生型
中(图1-A), 2C和4C细胞的数目在11 DAS前即达到
平衡, 而从11 DAS开始4C细胞所占比例就开始明
显下降, 并随之8C细胞开始积累。与野生型不同,
在m1突变体叶片中(图1-B), 2C和4C细胞的数目在
13 DAS时达到平衡, 且4C细胞在DAS 15 d后才开
始下降, 表明在m1突变体中大多数叶细胞在15
DAS前还处于G1或G2期, 正进行分裂增殖, 因而在
m1突变体叶片中由于细胞分裂增殖的持续时间延
长, 导致叶片最终细胞数目增加。
拟南芥m2突变体是一个叶片细胞增殖有缺陷
的突变体。为了研究m2突变体叶发育过程中有丝
分裂周期是否受到影响, 我们分析了野生型和m2
图1 流式细胞比较分析拟南芥Col-0野生型(A)和m1突变体(B)叶发育过程中细胞倍性的变化
Fig.1 Comparative analysis of nuclear ploidy distributions during development of the first-pair leaves from
the wild-type Col-0 (A) and m1 mutant (B) seedlings by flow cytometry
曾民环等: 利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控 925
突变体第1对叶在不同时期的细胞倍性。在10
DAS的野生型第一对叶片中, 2C和4C细胞的所占
比例分别为70%和30%, 之后 4C细胞的比例明显
上升, 在接近11 DAS时2C和4C细胞各占50%, 2C
和4C细胞达到平衡(图2-A)。在m2突变体叶片中,
从10 DAS开始, 4C细胞的数目上升十分缓慢, 直到
DAS 13 d时2C和4C才达到平衡状态(图2-B), 表明
在m2突变体叶片发育早期2C到4C的转换速率变
慢。由于在叶发育早期2C和4C的细胞分别代表处
于G1和G2期的细胞(Takahashi等2008), 以上结果
表明m2突变体叶片细胞有丝分裂过程中G1到G2
期的进程受到抑制。
图2 流式细胞分析拟南芥Col-0野生型(A)和m2突变体(B)叶发育过程中细胞倍性的变化
Fig.2 Comparative analysis of nuclear ploidy distributions during development of the first-pair leaves from the wild-type Col-0 (A)
and m2 mutant (B) seedlings by flow cytometry
拟南芥m3突变体是从Ler背景下分离到的一
个细胞增殖有缺陷的叶发育突变体。利用流式细
胞仪比较分析野生型和m3突变体10 DAS时第1对
叶片细胞的倍性, 发现与野生型相比在m3突变体
叶片中2C细胞比例下降, 而4C和8C细胞比例显著
上升(图3-A), 4C/2C细胞的比率也显著高于野生型
(图3-B), 表明在m3突变体叶片中处于G1期的细胞
数目减少而G2期细胞增多并开始部分进入内复
制。因而, 拟南芥M3基因的突变导致叶片细胞提
前退出有丝分裂进入内复制。
3 利用流式细胞仪分析拟南芥突变体对内复制的
影响
为了研究拟南芥m1突变体叶片细胞的内复制
是否发生变化情况, 我们用流式细胞仪比较了野
生型和m1突变体25 DAS完全展开的第一对叶的细
胞倍性。结果发现与野生型相比, 在m1突变体叶
片中8C和16C细胞所占比例明显下降, 而2C和4C
细胞细胞所占比例显著上升(图4-A), 这说明拟南
芥m1突变体叶片中细胞增殖的持续时间延长, 导
致叶片细胞数目的增加但进入内复制细胞的数目
减少。
我们也比较了野生型和m2突变体25 DAS完
图3 流式细胞比较分析野生型和m3突变体10DAS时第1对
叶细胞倍性
Fig.3 Comparative analysis of nuclear ploidy distributions of
the first-pair leaves from 10 DAS wild-type and m3 mutant
seedlings by flow cytometry
A: 野生型和m3突变体在10 DAS时第1对叶中不同倍性细胞
所占的比例; B: 野生型和m3突变体在10 DAS 时第1对叶中4C/2C
细胞的比率。误差线代表±SD, *表示经t-检验具有显著差异
(P<0.05), **表示极显著差异(P<0.01), 图4同此。
全扩展的第一对叶的细胞倍性, 结果显示在m2突
变体叶片中8C的细胞比例显著上升, 但16C和32C
的比例下降(图4-B)。由于m2突变体叶片细胞有丝
分裂过程中G1到G2期的进程受到抑制, 而G2/M期
转换受阻会导致细胞进入内复制(De Veylder等
2007), m2突变体成熟叶片中8C细胞比例上升而
植物生理学报926
16C和32C细胞的比例下降, 表明拟南芥m2突变体
叶片细胞的内复制进程也受到影响。因而, 综合
分析图2和图4-B的结果表明拟南芥M2基因是细胞
有丝分裂周期和内复制周期正常进行所必须的。
与m1和m2突变体不同, 流式细胞分析发现在
m3突变体第1对叶中16C细胞所占的比例明显上
升, 而8C细胞群体较野生型明显减少(图4-C), 表明
在m3突变体叶片中由于有丝分裂周期受到影响,
细胞可能提前退出有丝分裂进入内复制, 导致高
倍性细胞数目增加。
4 利用流式细胞仪测定拟南芥细胞周期S期DNA
复制的效率
拟南芥m2突变体中有丝分裂周期G1-G2期延
长, 内复制进程变缓, 这可能是由于细胞内基因组
DNA的复制受到影响所引起。为了验证这一猜想,
我们首先比较了12 DAS时叶片中4C和2C细胞的
比率。与野生型相比, 在m2突变体中4C/2C细胞的
比率显著下降(图5-A, B), 表明在m2突变体叶片中
图4 流式细胞比较分析野生型, m1, m2和m3突变体25 DAS时第1对叶细胞的倍性
Fig.4 Comparative analysis of nuclear ploidy distributions of the first-pair leaves from 25 DAS wild-type, m1, m2 and m3 mutant
seedlings by flow cytometry
A-C: 分别为野生型与m1、m2和m3突变体细胞倍性的比较。
图5 EdU掺入试验结合流式分析DNA复制效率
Fig.5 The EdU incorporation assay together with the flow cytometric analysis of DNA replication efficiency
A: 野生型和m2突变体12 DAS时第1对叶细胞倍性的流式分析图; B: 野生型和m2突变体第1对叶中4C/2C细胞的比率; C: 3 DAS的野
生型和m2突变体小苗中EdU信号的流式定量分析; D: 野生型和m2突变体中EdU荧光信号占总信号强度比例。B, D中误差线代表±SD, **
表示经t-检验具有显著差异。
曾民环等: 利用流式细胞仪研究拟南芥叶发育过程中细胞周期的调控 927
DNA复制过程可能较为缓慢。我们利用EdU掺入
试验结合流式细胞仪定量分析, 比较了野生型和
m2突变体中DNA复制的效率。结果发现与野生型
相比, 在m2突变体中含有EdU荧光信号的细胞比
例显著下降(图5-C, D), 由于EdU掺入的速率可以
反映DNA的合成效率, 表明在m2突变体中DNA复
制效率下降。
流式细胞术可快速、准确地测定细胞内DNA
的含量。我们在研究拟南芥叶形态建成机理的过
程中, 发现一些拟南芥叶发育突变体的表型是由
于叶细胞的分裂增殖发生异常导致的。利用流式
细胞仪分析叶发育不同时期细胞倍性的变化, 我
们发现至少存在3种类型的细胞周期异常的叶发
育突变体。在m1突变体叶片中, 由于细胞增殖的
持续时间延长导致叶片细胞数目增加, 而在m2和
m3突变体叶片中由于有丝分裂周期进程受到抑
制, 导致叶片细胞数目减少。在m2和m3突变体叶
片中细胞可能提前退出有丝分裂进入内复制, 导
致细胞倍性增加, 然而与m3突变体不同, 在m2突变
体叶片中可能是由于DNA复制过程的缺陷使有丝
分裂周期和内复制进程都受到影响。
流式细胞仪的另一个特点是可以自动快速地
检测同一个细胞的多种荧光标记信号。利用EdU掺
入使新合成的DNA能被荧光标记, 而DAPI染色可
用来标记细胞核, 通过流式细胞仪的双参数定量分
析可测定DNA复制效率(Kotogany等2010)。我们
发现在m2突变体中DNA复制效率下降, 这也与突
变体叶发育过程中细胞倍性分析的结果相一致。
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