全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 1033~1038　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0203 1033
收稿 2014-04-24　　修定 2014-05-15
资助 国家自然科学基金(31070239)。
* 通讯作者(E-mail: haofsh@henu.edu.cn; Tel: 0371-3881387)。
拟南芥AtrbohD和AtrbohF缺失对叶蛋白质组的影响
胡盼盼, 孙立荣, 李翠, 李金侗, 郝福顺*
河南大学棉花生物学国家重点实验室, 植物逆境生物学重点实验室, 生命科学学院, 河南开封475004
摘要: 拟南芥NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF在脱落酸(abscisic acid, ABA)抑制主根伸长、ABA诱导气孔关闭以及植物
应答干旱、盐及病菌侵染等逆境胁迫反应中发挥重要作用, 但这2个蛋白亚基缺失对拟南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白质组
的影响还未见报道。我们以营养土中生长16 d的野生型及AtrbohD和AtrbohF双基因突变体atrbohD1/F1叶片为材料进行蛋
白组学分析, 在双向电泳图谱上可分辨出约1 000个蛋白点, 且蛋白表达谱存在差异。选取42个显著差异蛋白点进行MAL-
DI-TOF/TOF质谱鉴定, 成功鉴定出20个差异蛋白, 这些蛋白主要与氧化还原、能量代谢、蛋白代谢、转录和信号传导等
相关, 还有一些蛋白功能未知。
关键词: 拟南芥; NADPH氧化酶; 蛋白质组; 双向电泳
Effects of Deficiency in AtrbohD and AtrbohF on Changes in Leaf Proteome in
Arabidopsis thaliana
HU Pan-Pan, SUN Li-Rong, LI Cui, LI Jin-Tong, HAO Fu-Shun*
State Key Laboratory of Cotton Biology, Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology, College of Life Sciences, Henan Univer-
sity, Kaifeng, Henan 475004, China
Abstract: NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF play essential roles in abscisic acid (ABA)-inhibited primary
root growth, ABA-induced stomatal closure, and in response to adverse stress conditions including disease in-
fection, drought and salt stress in Arabidopsis. However, effects of deficiency in the two protein subunits on
change in leaf proteome have not been reported. Here, leaf proteomic analysis of wild type (WT) and double
mutant atrbohD1/F1 of AtrbohD and AtrbohF after grown in soil for 16 days were performed. About 1 000 pro-
tein spots in WT and the mutant were detected in the two-dimensional electrophoresis gels, and clear difference
in protein profiles was observed. The 42-protein spots were selected based on their differential expression be-
tween WT and the mutant, and 20 proteins of which were identified by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.
Most of proteins identified are involved in multiple cellular processes including redox, energy metabolism, pro-
tein metabolism, transcription and signal transduction. Some other identified proteins are functional unknown.
Key words: Arabidopsis thaliana; NADPH oxidase; proteome; two-dimensional electrophoresis
过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2¯· )等活性氧
(reactive oxygen species, ROS)作为信号分子在植
物生长发育以及应答逆境胁迫反应中起非常重要
的作用(Mittler等2011; Baxter等2014)。ROS的重
要来源之一是植物质膜NADPH氧化酶。NADPH
氧化酶能以NADPH作为电子供体催化胞外O2生成
O2¯· , 后者在超氧化物歧化酶作用下或自发生成
H2O2 (Torres和Dangl 2005)。研究表明, NADPH氧
化酶参与调节植物抵御病菌侵染、生长发育、气
孔关闭以及环境胁迫适应等众多生物学过程(Tor-
res和Dangl 2005; Suzuki等2011; Marino等2012)。
拟南芥基因组中存在10个编码NADPH氧化
酶的基因, 分别被命名为AtrbohA~J (Torres和Dangl
2005; Sagi和Fluhr 2006), 其中AtrbohB参与调控种
子的后熟作用(Müller等2009), AtrbohC调节根毛生
长和细胞的完整性(Foreman等2003; Macpherson等
2008), AtrbohD和AtrbohF则在抵御病原菌侵染、
ABA诱导气孔关闭、盐胁迫反应应答以及ABA抑
制主根伸长等过程中发挥重要作用(Torres等2002;
Kwak等2003; Ma等2012; Jiao等2013)。另外, Atr-
bohD可在光胁迫下放大ROS信号并介导多种非生
物胁迫诱导系统信号的快速传递(Davletova等2005;
植物生理学报1034
Miller等2009), 而AtrbohF则调控乙烯及外源ATP
诱导的气孔关闭过程(Desikan等2006; Song等
2006)。
尽管人们对AtrbohD和AtrbohF的功能进行了
很多研究, 但这2个基因缺失后影响哪些蛋白质表
达的变化还未见报道, 本实验中我们以拟南芥野
生型(wild type, WT)及AtrbohD和AtrbohF双基因突
变体atrbohD1/F1 (CS9558) (Ma等2012)为材料, 揭
示了正常生长条件下拟南芥AtrbohD和AtrbohF缺
失后叶中一些表达发生显著变化的蛋白质, 为进
一步研究AtrbohD和AtrbohF的作用奠定了基础。
材料与方法
1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) WT (Col-0)和
atrbohD1/F1种子用0.1%升汞消毒5 min、无菌水
冲洗5次后点播于0.6%琼脂MS固体培养基上, 4 ℃
下春化2 d, 放于培养间培养2周, 然后移栽到营养
土中继续培养16 d, 剪取叶片, 液氮速冻, –80 ℃冰
箱保存备用。培养条件: 光/暗周期为16 h/8 h, 昼/
夜温度为22 ℃/18 ℃, 相对湿度70%左右, 光照强
度为120~150 µmol·m-2·s-1。
2 试剂
IPG干胶条(pH 3~10)、IPG缓冲液购自GE公
司 ; 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇
(DTT)和十二烷基磺酸钠(SDS)购自Amresco公司;
其他试剂购自上海生工。植物总蛋白微量提取试
剂盒购自天恩泽公司。
3 方法
3.1 蛋白质样品制备与定量
称取0.2 g样品, 使用植物总蛋白微量提取试
剂盒提取蛋白质, 操作步骤按照说明书进行。采
用Bradford法测定上清液中的蛋白质浓度(Brad-
ford 1976)。
3.2 SDS-PAGE单向电泳(1-DE)
SDS-PAGE单向电泳采用4%浓缩胶和12%分
离胶。每孔上样量为40 μg蛋白。电泳条件为80
V、30 min, 然后调节电压至120 V, 到溴酚蓝前沿
到达凝胶底端为止。
3.3 双向电泳水化和等电聚焦
第一向等电聚焦使用13 cm非线性pH 3~10
IPG胶条, 胶内被动水化方式上样, 每根胶条上样
量为250 μg蛋白, 室温下水化12 h, 利用IPGphor聚
焦仪(GE公司)完成等电聚焦过程。等电聚焦程序
为: 30 V、1 h; 100 V、1 h; 200 V、1 h; 500 V、1 h;
2 000 V、2 h; 8 000 V爬升5 h; 8 000 V、10 h。
3.4 胶条平衡和SDS-PAGE
等电聚焦后 , 将胶条放入平衡缓冲液I (50
mmol∙L-1 Tris-HCl pH 8.8, 6 mol∙L-1尿素, 30%甘油,
2% SDS, 0.1% DTT, 0.005%溴酚蓝)中15 min, 然后
放入平衡缓冲液II (50 mmol∙L-1 Tris-HCl pH 8.8, 6
mol∙L-1尿素, 30%甘油, 2% SDS, 0.4%碘乙酰胺,
0.005%溴酚蓝)中15 min, 最后将胶条放到12.5%
SDS聚丙烯酰胺凝胶上端, 用0.5%低熔点琼脂糖密
封胶条, 进行第二向SDS-PAGE电泳。电泳为恒流,
起始时每胶10 mA, 1 h后, 将恒流调节为每胶30
mA, 大约4 h后溴酚蓝指示剂到达凝胶底端, 终止
电泳。
3.5 凝胶染色、图像扫描和数据分析
采用改进硝酸银染色法对凝胶进行染色(Wray
等1981)。凝胶用ImageScanner扫描仪(GE公司)采
集图像。扫描后的图像用ImageMaster凝胶图像分
析软件(GE公司)分析蛋白点。
3.6 质谱鉴定
从双向电泳凝胶上挖取显著差异蛋白点, 由
上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱鉴定,
得到蛋白质序列二级质谱MALDI-TOF/TOF鉴定
信息。
实验结果
1 蛋白提取效率及SDS-PAGE
以营养土中生长16 d的拟南芥WT和突变体
atrbohD1/F1叶片为材料提取总蛋白, 这时从外形
上可看到突变体植株矮小, 长势比WT差(图1)。
从每克叶片中最高可提取到(8.2±0.46) mg蛋
白, 最低可提取到(3.3±0.24) mg蛋白, 蛋白提取效
率较高。采用单向SDS-PAGE技术检测所获得的
蛋白质样品质量, 得到了分辨率较高的1-DE电泳
图谱。图谱背景颜色浅, 蛋白条带清晰(图2), 表明
所得到的蛋白质样品质量较高, 可用于后续双向
电泳及质谱鉴定。叶片高丰度蛋白大多分子量在
26~55 kDa区域内。
胡盼盼等: 拟南芥AtrbohD和AtrbohF缺失对叶蛋白质组的影响 1035
2 蛋白质双向电泳结果
利用双向电泳技术获得了拟南芥WT与atr-
bohD1/F1叶总蛋白的双向电泳图谱, 图谱上蛋白
点呈圆形或椭圆形 , 大部分点与点之间界限清
晰、轮廓分明, 蛋白点间有较轻的横向拖尾现象,
基本无纵向拖尾情况 , 说明双向电泳图谱质量
高。用ImageMaster软件分析凝胶, WT叶蛋白双向
电泳图谱上可分辨出(1 000±31)个蛋白点, 突变体
可分辨出(972±43)个蛋白点。两者之间表达差异
显著(差异在2倍以上)的蛋白点共有42个, 突变体
中表达高于WT的蛋白点有33个, 表达低于WT的
蛋白点有9个, 成功鉴定出的蛋白有20个(图3)。
3 质谱鉴定结果
通过MALDI-TOF MS质谱技术, 从挑选的42
个蛋白点中鉴定出20个(表1)。这些蛋白按照功能
可以分成6类(图4), 其中氧化还原功能相关蛋白
(redox)占总蛋白的25%, 能量代谢(energy metabo-
lism)相关蛋白占15%, 蛋白代谢(protein metabo-
lism)相关蛋白占10%。与转录(transcription)和信
号传导(signal transduction)相关蛋白分别占总蛋白
的20%和5%。在所鉴定出的蛋质中, 未知功能蛋
白所占比例较大, 占到总蛋白的25%。
AtrbohD和AtrbohF主要影响拟南芥中ROS或
氧化还原平衡, WT与atrbohD1/F1差异蛋白质中与
ROS或氧化还原相关的蛋白主要有胱硫醚β-合成
酶(CDCP, 332660926)、谷胱甘肽S-转移酶6 (332-
图1 土中生长16 d atrbohD1/F1幼苗的表型
Fig.1 Phenotype of Arabidopsis atrbohD1/F1 seedlings after
grown in soil for 16 d
A: 移入营养土时的幼苗; B: 营养土中生长16 d后的拟南芥苗。
图2 WT和atrbohD1/F1叶蛋白单向SDS-PAGE图
Fig.2 Map of one-dimensional SDS-PAGE electrophoresis of
WT and atrbohD1/F1 proteins from leaves
M: 蛋白质分子量标准; 1: WT; 2: atrbohD1/F1。
图3 WT和atrbohD1/F1叶蛋白双向电泳图
Fig.3 Two-dimensional electrophoresis maps of WT and atrbohD1/F1 leaf proteins
A: WT; B: atrbohD1/F1。
植物生理学报1036
189377)、谷胱甘肽S-转移酶(2554770)、谷胱甘肽
S-转移酶7/11 (332189375)和硫氧还蛋白(6539616)
(表1), 暗示AtrbohD和AtrbohF可能主要通过影响
这些蛋白或酶的表达调节细胞的氧化还原平衡。
表1 蛋白的质谱鉴定结果
Table 1 Mass spectrometry results of proteins
蛋白点 登录号 蛋白名称 等电点
分子 肽段 覆盖 蛋白
物种 量/kDa 数/个 率/% 得分
1 757534 类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease) 5.81 78.8 8 13 120 A. thaliana
2 30693071 假定剪接因子(putative splicing factor ATSRL1) 9.72 45.9 7 18 88 A. thaliana
3 332660926 胱硫醚β-合成酶结构域蛋白(cystathionine beta- 7.93 25.9 6 31 104 A. thaliana
synthase domain-containing protein)
4 334188456 60S酸性核糖体蛋白(60S acidic ribosomal protein P3-2) 5.19 7.99 5 40 243 A. thaliana
5 332194352 poly(A)结合蛋白8 [poly(A) binding protein 8] 7.13 73.0 13 21 236 A. thaliana
6 6573642 Sqd1蛋白复合体A链 (chain A, crystal structure 6.44 44.7 13 39 162 A. thaliana
of Sqd1 protein complex)
7 332190895 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate 6.67 37.0 11 40 116 A. thaliana
dehydrogenase)
8 15231200 叶绿体RNA结合蛋白33 (chloroplast RNA-binding 4.62 35.9 11 31 88 A. thaliana
protein 33)
9 332189377 谷胱甘肽S-转移酶6 (glutathione S-transferase 6) 5.8 23.5 11 47 197 A. thaliana
10 2554770 谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase) 5.93 24.0 12 56 247 A. thaliana
11 332189375 谷胱甘肽S-转移酶7/11 (glutathione S-transferase 7/11) 6.14 23.6 7 33 75 A. thaliana
12 4455184 超大的G-类蛋白(extra-large G-protein-like) 5.63 95.7 18 19 76 A. thaliana
13 6539616 硫氧还蛋白(thioredoxin) 9.21 18.7 6 39 124 A. thaliana
14 475569805 假定转录延伸因子SPT5-1类似蛋白(putative 7.08 92.6 22 23 80 Aegilops tauschii
transcription elongation factor SPT5-1-like protein)
15 223532945 保守的假定蛋白(conserved hypothetical protein) 4.67 8.7 7 61 73 Ricinus communis
16 460400027 线粒体腺嘌呤核苷酸ADNT1类转运蛋白(mitochondrial 9.42 38.7 15 31 74 Solanum lycopersicum
adenine nucleotide transporter ADNT1-like)
17 238054406 角蛋白, II型细胞骨架 1 (keratin, type II cytoskeletal 1) 8.15 66.2 15 34 458 Homo sapiens
18 269849769 角蛋白, I型细胞骨架10 (keratin, type I cytoskeletal 10) 5.13 59.0 15 27 156 H. sapiens
19 238054406 角蛋白, II型细胞骨架1 (keratin, type II cytoskeletal 1) 8.15 66.2 16 28 81 H. sapiens
20 238054406 角蛋白, II型细胞骨架1 (keratin, type II cytoskeletal 1) 8.15 66.2 15 30 237 H. sapiens
另外, WT与atrbohD1/F1差异蛋白质还包括60S酸
性核糖体蛋白(334188456)、poly(A)结合蛋白8
(332194352)、叶绿体RNA结合蛋白33 (15231200)
和多个细胞骨架蛋白(表1), 说明ROS的变化可能
影响蛋白质的合成、基因的转录或加工以及细胞
骨架的形成。
讨　　论
近年来日益增多的研究表明, NADPH氧化酶
AtrbohD和AtrbohF通过产生ROS在拟南芥生长发
育以及应答各种生物和非生物逆境胁迫反应中发
挥至关重要的作用 (Suzuki等2011; Marino等
2012)。然而, 目前人们对AtrbohD和AtrbohF调控
哪些蛋白质了解的还很少。我们利用蛋白组学技
术研究发现, 基因AtrbohD和AtrbohF同时缺失后,
鉴定出的3个谷胱甘肽S-转移酶中, 1个表达下调, 2
图4 鉴定的20种蛋白质功能分析
Fig.4 Functional analysis of the 20 proteins identified
胡盼盼等: 拟南芥AtrbohD和AtrbohF缺失对叶蛋白质组的影响 1037
个表达上调。谷胱甘肽S-转移酶是植物中非常重
要的氧化还原保护酶, 可通过清除ROS保护植物免
受氧化胁迫的伤害(Marrs 1996)。报道表明, 拟南
芥谷胱甘肽S-转移酶参与调节植物发育以及对盐
和干旱等逆境胁迫的应答(Jiang等2010; Chen等
2012)。AtrbohD和AtrbohF也在调控植物生长发育
和应答盐和干旱等胁迫反应中起作用(Kwak等
2003; Ma等2012), 因此有可能AtrbohD和AtrbohF
产生的ROS作为信号通过调节谷胱甘肽S-转移酶
的表达在植物中发挥作用, 下一步我们将研究Atr-
bohD和AtrbohF与谷胱甘肽S-转移酶的作用关系和
机制。
除谷胱甘肽S-转移酶外, 突变体atrbohD1/F1
表达下降的氧化还原相关蛋白中有一个是硫氧还
蛋白, 另一个是CDCP。硫氧还蛋白是一类广泛存
在于植物中的多功能蛋白, 参与调节细胞中一系
列生理生化反应, 在清除过量ROS和维持细胞氧化
还原平衡中发挥重要作用(Vieira Dos Santos和Rey
2006)。CDCP可通过调控硫氧还蛋白调节H2O2水
平, 保持细胞内氧化还原平衡, 维持植物正常的生
长发育(Yoo等2011; Jung等2013; Kushwaha等
2009)。AtrbohD和AtrbohF是否调控硫氧还蛋白和
CDCP以及具体的作用机制将是今后需进一步研
究的课题。
WT与atrbohD1/F1表达显著差异的蛋白中包
括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH), 该酶参与生物
体内糖酵解、卡尔文碳循环和糖异生过程, 是糖
酵解途径的一个关键酶。目前研究表明, GAPDH
还具有抵抗逆境胁迫的功能 (付国良和黄晓红
2013)。当细胞遭受冷、热和干旱等胁迫时, 植物
会出现光能吸收和驱动新陈代谢能量供给不平衡
的现象, 最终导致ROS的形成而出现氧化胁迫(梁
颖和李玉花2009)。AtrbohD和AtrbohF的缺失可能
使拟南芥中ROS信号降低或丢失, 从而使植物产生
应激反应, 激活GAPDH, 具体的机制还需要进一步
深入研究。
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