全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月108
收稿 2009-07-30 修定 　2009-12-30
资助 上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字 2008第 8-9号)。
* 与第一作者同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: aihup@yahoo.com.cn; Tel: 021-62208750)。
转基因香石竹中 F3’5’H 基因的克隆、表达和免疫学鉴定
白蓝 1,2, 贾军伟 1,*, 孙建萍 1, 李鹏 1, 赵明文 2, 潘爱虎 1,**
1上海市农业科学院生物技术研究所, 上海市农业遗传育种重点实验室, 农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上
海), 上海 201106; 2南京农业大学生命科学学院, 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室, 南京 210095
提要: 在研究转基因香石竹品系月之霓裳(Moonshade)、月之伊人(Moonlite)中外源基因F3’5’H的表达中, 本文克隆了F3’5’H
全长基因1.5 kb, 构建获得工程菌株Escherichia coli BL21(DE3) (+F35H)。SDS-PAGE分析的结果显示, 该菌株高效表达出
F3’5’H重组蛋白, 约占菌体总蛋白的30%。用经纯化的F3’5’H重组蛋白作为抗原, 制备F3’5’H重组蛋白的抗血清, 经ELISA
免疫学分析表明, 该抗血清的效价为 1:25 600。Western blot结果表明F3’5’H重组蛋白具有良好的 IgG结合活性, 且抗血清
与转基因香石竹品系月之霓裳和月之伊人中的外源基因F3’5’H所表达的蛋白发生明显的抗原抗体反应。这样, 月之霓裳
和月之伊人用于评价转基因香石竹品系的环境安全性在我国也得到了验证。
关键词: 转基因香石竹; F3’5’H; 原核表达; 免疫学鉴定
Cloning, Expression and Immunological Identification of F3’5’H Gene in
Transgenic Carnation (Dianthus canpphyllus Linn.)
BAI Lan1,2, JIA Jun-Wei1,*, SUN Jian-Ping1, LI Peng1, ZHAO Ming-Wen2, PAN Ai-Hu1,**
1Biotech Research Institute of Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and
Breeding, Supervision, Inspection and Test Center for Environment Safety of GM Crops of MOA (Shanghai), Shanghai 201106,
China; 2College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Key Lab of Microbiological Engineering of Agricultural Environment,
Ministry of Agriculture, Nanjing 210095, China
Abstract: In order to study the expression of exogenous gene F3’5’H in transgenic carnation lines Moonshade
and Moonlite, the full-length F3’5’H gene of 1.5 kb was cloned, and the strain Escherichia coli BL21(DE3)
(+F3’5’H) was obtained. SDS-PAGE analysis showed that the high-level expressed recombinant protein F3’5’H
was detected and the expression level was almost 30% of the total protein. The recombinant protein was used as
antigen to obtain the antiserum. And the immunological analysis of ELISA showed the antiserum titer was 1:25 600.
Western blot analysis indicated that the recombinant protein F3’5’H could combine with sera IgG, and the antise-
rum showed specific immunological response to the F3’5’H protein extracted from Moonshade and Moonlite.
Key words: transgenic carnation (Dianthus canpphyllus); F3’5’H; prokaryotic expression; immunological identification
蓝色花的色素苷类型主要是飞燕草色素苷及其
衍生物, 即 3’,5’-羟基花色素苷。在花色素苷的合
成途径中, 类黄酮 -3’,5’-羟基化酶(flavonoid-3’,5’-
hydroxylase, F35H)是合成3’,5’-羟基花色素苷的关
键酶, 也称为蓝色基因(blue gene) (Holton等 1993)。
自然界中, 大多数天然蓝色花是由于F3’5’H基因的
有效表达所致。因此, 通过导入 F3’5’H基因来补
充某些花卉缺少合成蓝色色素的能力已成为现在采
用基因工程技术创造蓝色花卉的途径之一。
香石竹不具有F35H基因(张石宝等2001), 因
此自然界中不存在蓝色康乃馨。澳大利亚Florigene
公司和日本三得利公司(Suntory)从杂交矮牵牛中克
隆到二氢黄酮醇 -4-还原酶(dihydroflavonol-4-
reductase, DFR)基因和 F3’5’H基因, 构建载体
pCGP1470 (Holton 2000), 并通过农杆菌介导转化
白色的香石竹品种 ‘FE123’, 经筛选获得了花色呈
蓝紫色的转基因香石竹(Raghothama等 1991; Park
等 19 92 )。月之霓裳(M oons ha de )、月之伊人
(Moonlite)是其中的两个品系。作为第一例商业化
的转基因花卉, 这两个品系已获准在美国、加拿
大、澳大利亚、日本、哥伦比亚、厄瓜多尔和
欧盟等国家或地区进行种植或释放, 在我国也进行
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 109
了环境安全性评价的中间试验。
本文对转基因香石竹月之霓裳和月之伊人中
的外源基因 F3’5’H进行了克隆、表达、纯化和
免疫学鉴定, 为转基因香石竹遗传稳定性研究提供
了分子生物学数据, 并为其用于进行环境安全性评
价建立了基础。
材料与方法
转基因香石竹(Dianthus caryophyllus Linn.)品
系月之霓裳(Moonshade)、月之伊人(Moonlite)及
其亲本非转基因香石竹品系 FE123的插条由澳大
利亚Florigene公司提供, 经扦插生根后种植于上海
市农业科学院白鹤基地(农业部转基因植物环境安
全评价试验基地)的大棚中, 同时种植本地非转基因
香石竹品系兰贵人作为对照。以不同品系的香石
竹花朵为试验材料, 用离心柱式DNA抽提试剂盒提
取基因组 DNA。
构建的质粒pCGP1470 (图1)中含有来源于矮
牵牛的 F3’5’H基因, 根据这一基因的全长序列设
计一对PCR引物, 上游引物序列: 5 CGGGATCCA-
TGATGCTACTTACTGAGCT 3, 下游引物序列: 5
CGGAATTCTTGTAACCTTGGAGTAACCA 3, 并
在上游引物中引入BamHI限制性内切酶位点, 在下
游引物中引入 EcoRI限制性内切酶位点。以月之
霓裳和月之伊人的基因组 DNA为模板, 采用 pfu
DNA聚合酶扩增出 F3’5’H全长基因。PCR 反应
条件如下: 94 ℃中变性 4 min, 然后按 94 ℃ 30 s、
58 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min进行 35轮的循环反应,
最后在 72 ℃下延伸 10 min。Taq DNA聚合酶加
尾。
图 1 pCGP1470质粒构建示意图
Fig.1 Schematic diagram of plasmid pCGP1470
LB和 RB: 根癌农杆菌章鱼碱菌株的 Ti质粒的左边界和右边界; CaMV35S: 花椰菜花叶病毒 35S启动子; SuRB(ALS): 烟草的乙酰
乳酸合成酶(ALS)基因; CHS: 金鱼草查尔酮合酶(CHS)基因启动子; F35H: 矮牵牛类黄酮 35-羟化酶基因; D8: 来源于杂交矮牵牛转
脂蛋白终止子; MAC: 花椰菜花叶病毒 35S启动子的增强子序列和农杆菌甘露碱合成酶基因启动子; DFR: 矮牵牛二氢黄酮醇 4-还原
酶基因; MAS : 农杆菌甘露碱合成酶基因启动子。
PCR 扩增得到的特异性片段用捷瑞生物的
GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收, 宝生
物工程(大连)有限公司 pMD18-T载体连接, Es-
cherichia coli DH5α转化, 经Amp抗性筛选, 随机
挑选克隆进行PCR鉴定为阳性后, 由上海英骏生物
技术有限公司完成测序。
参照 Sambrook等(1995)书中的方法完成质粒
的提取和纯化、限制性内切酶反应, 将 F3’5’H基
因连接到 pET28a(+)表达载体上, 转化到大肠杆菌
BL21(DE3)中, 挑选阳性克隆, 保存大肠杆菌 BL21
(DE3) (+F3’5’H)工程菌株。
大肠杆菌 BL21(DE3)(+F3’5’H)工程菌株经
IPTG诱导处理 3 h后, 离心(3 500×g, 5 min)收集菌
体, 用重悬液(50 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖、
1 mmol·L-1 EDTA, pH7.9)悬浮, 加入 40 mg溶菌酶,
冰上放置 30 min, 再经超声波破碎, 将破碎的溶液
进行离心(1 500×g, 10 min), 用溶液 I [0.2 mol·L-1
NaCl、1%脱氧胆碱、1% NP-40、50 mmol·L-1
Tris (pH 7.5)和 1 mmol·L-1 EDTA]洗沉淀 2次, 每次
50 mL, 离心(1 500×g, 10 min), 弃去上清液。用溶
液 II [1% TritonX-100、50 mmol·L-1 Tris (pH 7.5)
和 1 mmol·L-1 EDTA]洗沉淀 2次, 每次 50 mL, 离心
(1 500×g, 10 min), 弃去上清液。用双蒸水洗沉淀
2次, 离心(1 500×g, 10 min), 弃去上清液。用溶液
(8 mol·L-1尿素、0.5% SDS)溶解重组蛋白, 加等
体积的1×SDS凝胶加样缓冲液(50 mmol·L-1 Tris, pH
6.8、100 mmol·L-1二硫苏糖醇、2% SDS、0.1%
溴酚蓝和 10%甘油), 放入沸水浴中 5 min后加样,
以 15% SDS-PAGE分析。
将重组蛋白与弗氏完全(或不完全)佐剂充分混
匀后, 免疫新西兰大白兔。首次免疫 2周后, 隔周
加强免疫, 共免疫 4次。末次免疫后 1周, 颈动脉
放血, 血液于 4 ℃冰箱放置过夜后, 析出的透明、
淡黄色血清即为 F3’5’H重组蛋白的多克隆抗体。
F3’5’H重组蛋白的多克隆抗体进行ELISA检
测时, 将重组蛋白用包被液稀释至 5 μg·mL-1, 向酶
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标板中每孔加入 200 μL, 于 4 ℃下包被过夜。经
封闭洗涤后加入 200 μL稀释的兔抗血清, 稀释度
分别为: 1:400、1:1 600、1:6 400、1:12 800、
1:25 600, 在 37 ℃中保温 1 h, 加入 200 μL碱性磷
酸酶标记的羊抗兔 IgG (1:5 000), 在 37 ℃中保温 1
h, 洗涤后加入底物溶液显色30 min, 终止反应后测
定 405 nm处 OD值。
月之霓裳和月之伊人花蕾期和盛花期花朵中
总蛋白的抽提, 参照萨姆布鲁克等(1995)文中的方
法, 对多克隆抗体进行Western blot鉴定。以制备
的F3’5’H重组蛋白的抗血清作为第一抗体, 按1:
1 000稀释; 碱性磷酸酶标记羊抗兔 IgG抗体作第
二抗体, 按 1:2 000稀释使用。
实验结果
1 重组质粒的构建和鉴定
以转基因香石竹的基因组DNA为模板用 pfu
DNA聚合酶进行 PCR扩增, 产物大小约 1.5 kb, 与
预期大小一致(图 2)。PCR 产物经回收纯化后克隆
到 pMD18-T载体中, 测序结果经Blast序列比对表
明, 扩增得到的 F3’5’H 基因序列与矮牵牛中的
F3’5’H基因序列同源性为 100%。
图 2 F3’5’H全长基因的 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of PCR products of the full-length F3’5’H gene
M: DNA分子量标准; 1、2: 空白对照; 3、4: 月之霓裳; 5、6: 月之伊人; 7、8: 亲本 FE1 23; 9、10: 兰贵人。
另用 EcoRI和 BamHI将 F3’5’H从 pMD18-T
载体上切出, 与经同样酶切处理的表达载体pET28a
(+)连接, 构建重组质粒 pET28a(+)(+F3’5’H), 用
PCR方法和限制性内切酶酶切鉴定重组质粒的结
果与预期一致。
2 重组F3’5’H蛋白基因的表达
将 pET28a(+) (+F3’5’H)导入到表达菌株大肠
杆菌 BL21(DE3)中, 诱导处理后, SDS-PAGE分析
的结果(图 3)表明, 重组F3’5’H基因获得高效表达,
该重组蛋白约占菌体总蛋白的30%, 分子量大小约
58.6 kDa, 与预期的分子量大小一致。
3 F3’5’H重组蛋白抗血清的免疫学检测
用F3’5’H重组蛋白对新西兰大白兔进行免疫,
每次加强免疫后 14 d采血, 并用 ELISA反应检测
抗体效价的结果表明, 2只新西兰兔对F3’5’H重组
蛋白都产生了特异性的免疫反应, 血清中抗体的效
价达到 1:25 600。此外, 由Western blot鉴定结果
(图 4)可见, 在 58.6 kDa处有非常明显的条带, 表明
图 3 菌株大肠杆菌BL21(DE3)表达的 F3’5’H
重组蛋白的 SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of F3’5’H recombinant protein
expressed in Escherichia coli BL21(DE3)
M: 蛋白质分子量标准; 1: 大肠杆菌 BL21(DE3) (+F3’5’H),
未经 IPTG诱导; 2: 大肠杆菌 BL21(DE3)(+F3’5’H), 经 IPTG诱
导、超声波破碎后的上清; 3: 大肠杆菌 BL21(DE3) (+F3’5’H),
经 I P T G 诱导、超声波破碎后的沉淀。
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F3’5’H重组蛋白具有良好的 IgG结合活性, 同时抗
血清与转基因香石竹外源基因表达的目的蛋白也能
够发生特异的抗原抗体反应。
另外, 采用Western blot检测了F3’5’H在转基
因香石竹盛花期和花蕾期花中表达的结果(图 5)显
示, 花蕾期间, 花中F3’5’H的表达明显高于盛花期。
图 4 F3’5’H重组蛋白兔抗血清的Western blot检测
Fig.4 Western blot analysis of the rabbit antiserum against F3’5’H recombinant protein
1: 兰贵人花的蛋白; 2: 亲本 FE123花的蛋白; 3: 月之霓裳花的蛋白; 4: 月之伊人花的蛋白; 5: F3’5’H包涵体蛋白。
图 5 F3’5’H在转基因香石竹中不同花期的表达的Western blot检测
Fig.5 Western blot analysis of F3’5’H expressed in different flowering phase of transgenic carnation
1: F3’5’H包涵体蛋白; 2: 月之霓裳盛花期花的蛋白; 3: 月之伊人盛花期花的蛋白; 4: 月之霓裳花蕾期花的蛋白; 5: 月之伊人花蕾
期花的蛋白。
讨　　论
转基因香石竹品系中的外源F35H基因来源于
杂交矮牵牛。有研究表明, 矮牵牛作为外源基因的
主要来源, 具有非常大的优势。将矮牵牛(Petunia
hybrida)、草原龙胆(Eustoma russellianum)和风铃
草(Campanula medium) F3’5’H基因转入到不含或
F3’5’H含量很少的矮牵牛和烟草(Nicotiana tabacum)
品种中, 转化株比其野生型植株能积累更多的飞燕
草色素。同时矮牵牛F3’5’H 基因在矮牵牛和烟草
的转基因研究还发现, 转基因的矮牵牛明显比烟草
能合成更多的飞燕草色素(Shimada等 1999, 2001;
Okinaka等 2003)。澳大利亚 Florigene公司和日本
Suntory公司的研究人员将矮牵牛 F3’5’H和DFR
基因导入缺乏DFR的白色香石竹, 培育出紫色品种
月之清辉 ‘Moondust’, 成为第一例上市的转基因花
卉植物, 现已在多个国家生产和销售(Meyer 等
1987)。随后用同样的技术方法获得转基因香石竹
品系月之霓裳(Moonshade)和月之伊人(Moonlite)。
经过多代的扦插繁殖后, 从转基因香石竹中克
隆得到的F3’5’H基因全长序列与其基因来源杂交
矮牵牛的同源性仍为 100%, 没有出现碱基突变等
情况, F3’5’H基因表达正常, 表明转基因香石竹遗
传比较稳定。
SDS-PAGE分析表明F3’5’H重组蛋白在大肠
杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达, 并且主要以包
涵体的形式存在。本文在研究中发现F3’5’H基因
的表达有时间差异性, 花蕾期间表达量高, 盛花期
基本不表达, 这与Menting等(1994)研究的矮牵牛花
朵微粒体膜上的F3’5’H酶活性随着花朵的发育而
改变, 以及开花期间和盛开前酶活性最高, 但在已
开放的花朵中未检测到的结果相符合。
总之, 本文通过制备转基因香石竹外源基因目
的蛋白的多抗血清, 为建立蛋白质检测方法作出了
技术储备, 同时也为此类研究提供了初步的遗传稳
定性分析的分子生物学数据, 并为其环境安全性评
价建立了基础。
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