全 文 ：植物生理学通讯 第46卷 第12期, 2010年12月 1247
收稿 2010-09-15 修定 　2010-10-15
资助 陕西省 “1 3 1 1 5 ” 科技创新工程重大科技专项( 2 0 0 7
ZDKG-05)和河南科技大学博士科研基金(09001216)。
* 通讯作者(E-mail: wzjhaust@gmail.com; Tel: 0379-
64282669)。
叠氮化钠诱变玉扇愈伤组织的研究
吴正景 1,*, 张菊平 1, 时灿辉 1, 巩振辉 2
1河南科技大学林学院, 河南洛阳471003; 2西北农林科技大学园艺学院, 陕西杨凌712100
提要: 在含不同浓度叠氮化钠(0、0.01、0.05、0.1、0.5 和 1.0 mmol·L-1)的诱导培养基上诱导玉扇愈伤组织发生变异。结果
表明, 叠氮化钠对玉扇愈伤组织的半致死浓度为 0.1~0.5 mmol·L-1, 0.1 mmol·L-1 有利于保证一定量的有效变异率和再生率。
再生芽多发生叶片失绿、畸形和叶序改变, 其中较多的叶序变异, 有望为研究叶序决定提供材料。
关键词: 玉扇; 叠氮化钠; 诱变; 叶序
Study of Sodium Azide Inducing Effect on Callus of Haworthia Truncata var.
truncata
WU Zheng-Jing1,*, ZHANG Ju-Ping1, SHI Can-Hui1, GONG Zhen-Hui2
1College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China; 2College of Horticulture,
Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract: In this study sodium azide (0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mmol·L-1 in tissue culture medium) was used
to induce callus of Haworthia truncata. The results showed that the half-death dosage of sodium azide to
Haworthra truncata callus was between 0.1 and 0.5 mmol·L-1, but 0.1 mmol·L-1 sodium azide was able to insure
some useful variations that mostly were leaf color, shape and phyllotaxis variation, among all the mutations,
phyllotaxis variation could provide material to study leaf arrangement.
Key words: Haworthia truncata; sodium azide; inducement; phyllotaxis
自从Spence 1965年首先发现叠氮化钠(NaN3)
对大麦的诱变作用以来, 国内外的许多研究者对叠
氮化钠在植物上的诱变作用进行了广泛的研究(Vig
1973; 谢嘉华等1993; 朴铁夫等1995), 先后证明叠
氮化钠是一种有效的化学诱变剂。叠氮化钠易透
过细胞膜进入细胞内, 以碱基替换方式影响DNA的
正常合成, 从而导致点突变的产生(董颖苹等2005),
并且只作用于复制中的DNA, 染色体畸变的概率非
常低, 易于获得稳定遗传的材料和进行后续生物学
研究, 是一种高效、安全的化学诱变剂(Yonetani
1961; Pearson等1975; Vigers和Ziegler 1968;
Kleinhofs等1974; van den Buck 1991)。由于叠氮
化钠只作用于复制中的DNA, 组织培养时把叠氮化
钠加入培养基, 具有诱变群体大, 诱变效率高, 筛选
方便, 筛选时间短等优点。
目前, 利用诱变技术人工诱发遗传变异, 丰富
作物种质资源, 已成为选育新品种的重要手段之一
(王元东等1999)。玉扇为百合科十二卷属观赏植
物, 愈伤组织再生率高, 地上部一般仅有叶片存在,
变异的性状易识别。有关叠氮化钠对玉扇的诱变
至今未见报道。本文初步探讨了叠氮化钠对玉扇
愈伤的诱变方法及效果, 为进一步开展玉扇诱变育
种工作提供依据, 也为创造新的种质材料奠定了
基础。
材料与方法
1 试验材料
普通玉扇(Haworthia truncata var. truncata), 购
自洛阳市花卉市场。
2 培养基成分
基本培养基为MS培养基(30 g·L-1蔗糖, 7.0 g·L-1
技术与方法 Techniques and Methods
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琼脂, pH 5.8)。愈伤诱导培养基为MS+NAA 0.2
mg·L-1(单位下同)+6-BA 0.2; 突变诱导培养基为
MS+NAA 0.2+6-BA 3.0; 植株再生培养基为
MS+NAA 0.02+6-BA 0.2。
3 玉扇愈伤组织的诱导培养
将玉扇叶片放在自来水下自然冲洗1 h左右,
在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s, 用无菌水冲
洗1次, 再用0.1% 升汞浸泡消毒10 min, 无菌水冲
洗5次, 每次3 min, 用灭菌滤纸吸干水分后, 切成
0.5 cm见方的小块, 接种于愈伤诱导培养基上。在
LRH-250-GSII型人工气候箱中培养, 暗培养3 d后,
转入光照培养, 光照强度为18 mmol·m-2·s-1, 光照时
间为14 h·d-1、温度为(25±1) ℃。
4 玉扇愈伤组织的诱变与再生
在超净工作台无菌条件下将过滤灭菌的叠氮
化钠溶液(0、0.01、0.05、0.1、0.5和1.0 mmol·L-1)
加入到未凝固的再生培养基中, 混合均匀后, 分装。
每处理10瓶, 每瓶接种4块愈伤组织。培养条件
同玉扇愈伤组织诱导; 10 d统计致死率; 30 d后把
玉扇愈伤组织转接到无叠氮化钠的植株再生培养基
上, 培养 2个月, 并调查其再生率、突变率、致
死率、致残率、叶色变异、叶形变异以及叶序
变异情况。再生率=再生芽数/外植体数 ×100%;
致死率=死亡外植体数/接种外植体数×100%; 致
残率 =致残突变芽数/再生芽数 ×100%; 突变率=
突变芽数 / 再生芽数 ×100%。
实验结果
1 叠氮化钠对玉扇愈伤组织的致死效应
1.0 mmol·L-1叠氮化钠诱变培养玉扇的愈伤组
织3 d, 外植体全部脱绿白化; 0.5 mmol·L-1叠氮化
钠的诱变培养10 d后有90%的愈伤组织脱绿白化,
随后死亡; 低浓度的叠氮化钠处理诱导培养30 d,
愈伤组织没有致死现象(表1)。由此可见, 叠氮化
钠对玉扇愈伤组织的半致死浓度应为 0. 1 ~ 0 . 5
mmol ·L-1。
2 玉扇不定芽的再生及突变率
从表2可以看出, 随着叠氮化钠浓度的升高, 玉
扇再生芽数逐减, 而突变率越来越高。叠氮化钠浓
度从0.01 mmol·L-1 增至0.05 mmol·L-1, 玉扇再生率
下降了2.91%, 但其再生芽中的变异率从23.2%增
表1 叠氮化钠对玉扇愈伤组织的致死率
Table 1 Lethality rate of Haworthia truncata callus by
sodium azide
叠氮化钠浓度/ 外植体块数/ 死亡块数/ 致死率/
mmol·L-1 　　 个 个 %
0 40 0 0
0.01 40 0 0
0.05 40 0 0
0.10 40 0 0
0.50 40 36~40* 90~100*
1.00 40 40 100
　　*: 该浓度处理后10 d, 致死率为90%, 5 d后加重至100%。
表2 玉扇愈伤组织再生芽变异率
Table 2 Variation rate of Haworthia truncata regeneration bud
from callus
叠氮化钠浓度/ 再生芽数/ 变异芽数/ 突变率/
mmol·L-1 个 个 %
0 319 8 2.5
0.01 177 41 23.2
0.05 172 114 66.3
0.10 83 64 77.1
0.50 0 0 0
1.00 0 0 0
至 66.3%, 提高了2.86倍; 叠氮化钠浓度从0.05
mmol·L-1增至0.1 mmol·L-1, 玉扇变异率仅上升了
10.8%, 但其再生率从430.0%锐减至 207.5%。该
变化表明较合适的叠氮化钠处理浓度在 0 . 1 0
mmol·L-1 附近。
3 玉扇愈伤组织再生芽的突变情况
3.1 再生芽致残情况 所谓致残突变, 即培养中虽然
没有死亡但由于再分化不良等原因, 不能继续发育
的再生芽, 或叶片严重扭曲等生长不正常的再生
芽。从表3可以看出, 随着叠氮化钠浓度升高, 致
残率逐步升高; 叠氮化钠浓度达到0.1 mmol·L-1时,
玉扇愈伤组织再生芽的致残突变率已达到71.1%。
3.2 叶片颜色变异情况 根据玉扇突变体叶片叶绿
素缺失情况, 把其变异叶片颜色分为两种: 一种是
白黄色, 一种是黄绿色, 均呈半透明状。从表4中
可以看出, 随着叠氮化钠处理浓度的提高, 玉扇愈
伤组织突变体中叶绿素缺失的概率逐渐增大。叠
氮化钠处理浓度高于0.1 mmol·L-1, 仅黄绿色突变
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表3 再生芽中的致残变异
Table 3 Crippling variation in the regenerated buds
叠氮化钠浓度/ 再生芽数/ 致残芽数/ 致残率/
mmol·L-1 个 个 %
0 319 8 2.5
0.01 177 38 21.5
0.05 172 102 59.3
0.10 83 59 71.1
表4 再生芽中叶片颜色的变异
Table 4 Variation of leaf color in regenerated buds
白黄叶 黄绿叶
叠氮化钠浓度/mmol·L-1
个数/株 叶色变异率 /% 个数/株 叶色变异率 /%
0 6 1.95 2 0.6
0.01 5 2.8 6 3.4
0.05 31 18.2 61 35.5
0.10 19 22.9 40 48.2
表5 再生芽中的叶形变异
Table 5 Variation of leaf shape in regenerated buds
叶片变形 叶片膨大
叠氮化钠浓度/mmol·L-1
个数/株 叶形变异率/% 个数/株 叶形变异率 /%
0 8 2.5 8 2.5
0.01 41 23.2 41 23.2
0.05 114 66.3 102 59.3
0.10 64 77.1 62 74.4
3.4 叶序变异情况 诱导再生培养中突变体叶序变
异的情况主要有以下3种: (1)一排互生, 但少数叶
错位; (2)旋生; (3)叶片呈不规则顺序排列。从表
6可以看出, 叠氮化钠浓度为0.05 mmol·L-1时, 叶
序变异率最高, 为11.0%, 这与其他变异发生的规
律不一致。叶序突变芽在总突变芽中占有较大比
表6 再生芽中的叶序变异
Table 6 Phyllotaxy variance in regenerated buds
叠氮化钠浓度 /mmol·L-1 叶序变异芽/个 叶序变异率 /%
0 0 0
0.01 6 3.4
0.05 19 11.0
0.10 7 8.4
例(10.9%~16.6%)。这为诱导不同叶序突变体、克
隆叶序决定基因创造了良好机会。
讨　　论
诱导培养基中添加1.0 mmol·L-1叠氮化钠, 玉
扇愈伤组织迅速白化死亡; 0.5 mmol·L-1叠氮化钠
使愈伤组织失去芽再生能力; 其半致死剂量为0.1~
0.5 mmol·L-1。一般认为化学诱变剂用量应为其半
致死剂量, 该试验表明叠氮化钠诱导培养对玉扇的
愈伤组织有较好的诱导效果, 0.1 mmol·L-1较为合
适, 其再生芽变异率大于77.1%, 能够正常生长发
育的变异芽占全部再生芽的 6.0%。
叶绿素缺失突变是评价一种物理化学因子诱
变效率的重要指标(Bahl和Gupta 1982), 玉扇愈伤
芽数占全部再生芽的 48.2%。
3.3 叶片形状变异情况 叠氮化钠诱导玉扇愈伤组
织再生芽中叶片形状变异的情况主要有以下5种:
(1)不规则状膨大; (2)近似圆球状膨大; (3)卷曲呈圆
柱状; (4)细长; (5)叶片上具芽状突起。其中膨大
叶居多, 占全部叶片变形芽中的96.5%~100%。从
表5可以看出, 随着叠氮化钠浓度的提高, 无论是
叶片膨大还是叶片变形, 其概率均逐渐增大。
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组织经叠氮化钠诱变处理后, 随着叠氮化钠浓度的
变化其叶绿素缺失的程度明显的升高, 浓度过高, 则
导致愈伤白化, 丧失再分化能力, 甚至死亡; 同时部
分再生苗会出现严重畸形而生长不良, 难以形成正
常再生植株, 产生致残突变。因而致残率同致死率
在评价再生诱变压力时, 具有同样重要的地位。
叠氮化钠诱导玉扇变异芽伴有大量叶形改变,
且大多为膨胀肥大。
叶序突变在叠氮化钠诱变再生芽中占有一定
的比例(3.4%~11.0%), 且变异类型多样, 这为研究
叶序决定提供了一个较好方法, 叠氮化钠对叶序的
影响是作用在代谢水平还是基因水平还需进一步实
验论证(申芳芳等2006)。
已有研究表明, 能够从化学诱变剂叠氮化钠或
EMS处理的大豆后代中选择出有价值个体(王萍等
1996; 张再君等2000; 郝再彬和吴东岚2004; 姜振
峰等2006), 因此, 我们期望利用叠氮化钠的高效诱
变效应, 通过对玉扇愈伤组织的诱变效应研究以及
后续遗传鉴定, 为玉扇生物学研究和育种提供资源
材 料 。
参考文献
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