全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (2): 171~177　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0405 171
收稿 2014-09-17　　修定 2014-12-27
资助 教育部博士点专项科研基金(20123418120001)和安徽省高
等学校自然科学研究项目(KJ2013A117)。
* 通讯作者(E-mail: gaojsh@ahau.edu.cn; Tel: 0551-65786232)。
拟南芥Mo敏感变异株的筛选和表型分析
巫飞飞, 沈知临, 蔡永萍, 林毅, 高俊山*
安徽农业大学生命科学学院, 合肥230036
摘要: 本文以EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0获得的M2代种子为试验材料, 通过在不含钼(-Mo)和含170 nmol·L-1钼(+Mo)
的培养基上进行反复筛选培养, 根据拟南芥根系在2种培养基上的生长差异筛选出31株Mo敏感变异株。并对变异株2-4的
表型特征及鲜重和Mo含量进行了分析。结果显示, 在-Mo培养基中变异株2-4的生长明显受到抑制, 且叶鲜重、根鲜重和
Mo含量均低于野生型。而在+Mo培养基中变异株2-4叶鲜重、根鲜重与野生型的差异不明显, 且都高于在-Mo培养基中
的。随着钼含量的增加, 变异株2-4矮小、叶片失绿和叶缘卷曲的症状不断恢复。当钼含量达到170 nmol·L-1时, 变异株2-4
的生长情况与野生型相比没有明显差异。这说明筛选出的2-4植株是一种Mo敏感型变异株。
关键词: 拟南芥; 钼; 变异株; 培养基; 表型分析
Screening and Phenotypic Analysis of Mo-Sensitive Mutants in Arabidopsis
thaliana
WU Fei-Fei, SHEN Zhi-Lin, CAI Yong-Ping, LIN Yi, GAO Jun-Shan*
School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: In this study, M2 generation seeds from wild-type Arabidopsis thaliana Col-0 treated with ethylmeth-
ane sulfonate (EMS) were used as experimental materials, which were cultured on the no-molybdenum (-Mo)
and 170 nmol·L-1 molybdenum (+Mo) media for repeated screening. According to the growth status of roots in
two media, 31 plantlets of Arabidopsis Mo-sensitive mutants were selected. Subsequently, the phenotype, fresh
weight and Mo content of mutant 2-4 were analyzed. The results showed that the growth of mutant 2-4 was sig-
nificantly inhibited, and fresh weights and Mo contents of leaves and roots in mutant 2-4 were lower than those
of wild type Col-0 on the -Mo medium. But fresh weights of leaves and roots of mutant 2-4 and wild type Col-0
were not obviously different on the +Mo medium, and fresh weights and Mo contents were far higher than
those on the -Mo medium.With the Mo content in the medium increasing, the symptoms of dwarf, leaf chlorosis
and margin of leaf curl of mutant 2-4 recovered continuously. When the Mo content reached to 170 nmol·L-1,
the growth of mutant 2-4 had no obvious differences with the wild-type. These results showed that screened 2-4
plant was a Mo-sensitive mutant.
Key words: Arabidopsis thaliana; molybdenum; mutant; medium; phenotypic analysis
钼(molybdenum, Mo)首先被Arno和Stout
(1939)发现是植物的必需元素, 后来证明Mo对于
植物生长是必不可少的微量矿质元素(Smith等
1997)。Mo不仅对植物生长发育有着重要的影响
(Mendel和Bittner 2006), 而且对动物也起着关键性
的作用(Mendel和Schwarz 2011; Mendel和Kruse
2012)。如果土壤缺Mo, 植物无法生长, 且植物出
现典型的缺素症状, 主要表现为叶片失绿, 叶脉间
的组织形成黄绿或桔红色叶斑, 叶缘卷曲、凋萎
以至于坏死, 叶柄和叶脉干枯等(Kaiser等2005)。
据报道, 自然界土壤中Mo浓度为3~7 mg·kg-1, 而地
表水中Mo浓度为10~50 nmol·L-1 (Gupta 1997)。世
界上许多地方的土壤不能提供植物生长所必需的
钼元素, 尤其是在酸性土壤中, 在自然条件下土壤
中钼元素含量对植物生长是不足的。
钼在土壤中以辉钼矿(MoS2)或者水钼铁矿
[Fe 2(MoO 4) 3]的形式存在 , 然而植物以钼酸盐
(MoO4
2-)的形态吸收和转运钼(Mendel和Hansch
2002)。钼酸在植物体中主要是形成钼辅因子
(Moco)参与植物生理功能。其中, 钼是由CNX1催
植物生理学报172
化被插入到金属靶定的蝶呤(MPT)中, 从而代替铜
离子靶定的二硫酚硫, 这个过程与肌动蛋白丝相
关。也就是说, MPT是GTP经过cPMP循环合成的
(Schwarz等2009; Schwarz和Mendel 2006)。Moco
也是一些氧化还原酶的重要组成成分, 包括硝酸
还原酶(nitrate reductase, NR)、亚硫酸盐氧化酶
(sulfite oxidase, SO)、黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehy-
drogenase, XDH)以及醛氧化酶(aldehyde oxidase,
AO)等(Kisker等1997; Mendel和Hansch 2002; Hille
等2011)。除此之外, 钼在植物的生长发育中还有
以下主要功能: (1)提高铁离子等养分的吸收, 从而
提高植物光合速率; (2)促进磷酸酶活性, 增加植物
体内Vc的合成以及有利于糖类的形成与转化; (3)
促进植物产生抗坏血酸以及增加种子的含糖量,
从而增强植物抗寒、抗旱和抗病能力。有机钼肥
效高, 对防治植物烟草花叶病效果明显(李明华
2005)。另外, Moco在古细菌、原核生物以及真核
生物中都是高度保守的(Mendel和Bittner 2006)。
拟南芥属于十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥属
(Arabidopsis), 由于其基因组(125 Mb)是目前已知
植物基因组中最小的, 这就使得拟南芥经常被作为
植物材料来研究, 是典型的模式植物。另外, 拟南
芥生长周期短, 具有高等植物的一般特点, 对研究
和阐明植物的生长发育机制具有重要意义。同时,
拟南芥是自花受粉植物, 基因高度纯合, 用理化因
素处理突变率很高, 容易获得各种功能缺陷型突变
体。其中, 使用烷化剂甲基磺酸乙酯(ethyl meth-
anesulfonate, EMS)作为诱变剂现已被广泛运用, 它
具有突变频率高, 易获得饱和突变, 基因突变的多
种效应(功能完全缺失、功能部分缺失、功能的数
量性变化和功能的组成性表达)等特点, 能够基本
满足筛选出各种功能基因缺陷的突变体。此外, 拟
南芥基因组的成功测序为基因功能分析和遗传改
良奠定了坚实的基础, 继而可以通过图位克隆等方
法分离鉴定突变体基因, 为进一步揭示基因的功能
以及改良植物品种都具有重要的意义。
因此, 本实验以野生型拟南芥Col-0种子为材
料, 用EMS作为诱变剂, 进行化学诱变, 得到一个
突变体库, 然后在不含钼和含钼的培养基进行不
断培养, 筛选出钼敏感的变异株, 并对其表型进行
观察和分析, 旨在通过图位克隆技术分离拟南芥
中Mo吸收与转运蛋白基因。
材料与方法
1 植物材料
本试验所用EMS诱变处理拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.)野生型Colombia (Col-0) M2代种子购自
美国TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)。
2 培养基与培养条件
本试验使用的基本培养基为MGRL培养基,
参照Fujiwara等(1992)修改, 琼脂6 mg·L-1, pH 5.8,
121 ℃高温灭菌20 min。拟南芥M2种子先用75%
的酒精浸泡30 s, 然后在1%次氯酸钠中浸泡10 min,
最后用无菌去离子水冲洗5~6次, 消毒后的种子接
种于MGRL培养基上。经过4 ℃春化2 d后, 置于光
照培养箱中培养, 温度为22 ℃, 16 h/8 h昼夜交替
进行培养, 光照强度为100~150 µmol·m-2·s-1。
MGRL培养基添加170 nmol·L-1 Mo为+Mo培养基,
MGRL培养基不含Mo为-Mo培养基。
3 Mo敏感变异株的筛选
3.1 拟南芥M2代的初步筛选
对M2代种子的筛选作为初步筛选 , 分为三
步。首先, 将在-Mo培养基上培养1周的根系较短
的幼苗挑选出来, 转移到+Mo培养基上; 再培养
4~5 d后, 把根系伸长较好的幼苗再转移到-Mo培
养基上; 最后培养1周后, 将根系生长停滞或生长
困难的幼苗移栽到充满蛭石的石棉上, 在光照培
养箱中生长至开花结实, 单株收获拟南芥种子(M3
代)。在这个筛选过程中种子总共分为20个批次,
每次筛选的种子数见表1。
3.2 拟南芥M3代的再次筛选
将这些单株收获的M3代种子进行编号(如2-*,
其中“2”表示第2批次筛选的, 共筛选了20批次, “*”
表示单株的编号), 每取5粒种子消毒后, 同时接种
于-Mo和+Mo培养基上进行再次筛选。根据其根
系的生长情况, 筛选出Mo敏感或其它特殊表型的
拟南芥变异株。
4 拟南芥变异株表型的分析
针对筛选出的Mo敏感突变体植株, 移栽到充
满蛭石的石棉上, 在光照培养箱中生长至开花结
实, 单株收获拟南芥种子(M4代)。将M4代种子消毒
后接种于-Mo和+Mo培养基中, 以Col-0野生型为对
巫飞飞等: 拟南芥Mo敏感变异株的筛选和表型分析 173
照。培养2周后, 比较其生长状况以及测定叶和根
鲜重, 同时用IPC-AES法(电感耦合等离子体原子发
射光谱法)对叶和根中的钼含量进行测定, 从而分
析变异株与野生型在表型、生长状况和钼含量的
差异。为了进一步验证其结果, 又将变异株种子分
别接种于0、1.7和170 nmol·L-1浓度钼的培养基中
进行恢复实验, 培养3周后观察其表型变化。
实验结果
1 拟南芥Mo敏感变异株的初步筛选
将32 000多粒EMS诱变的拟南芥M2种子经过
消毒后, 分批接种于-Mo培养基上,垂直放置培养1
周, 第1次筛选出约5 000株根系较短的幼苗(表1)。
由于培养基中Mo缺乏而抑制植株生长, 导致主根
较短, 侧生根较少(图1)。然后将这些幼苗转移到
含有+Mo培养基上进行恢复培养。在相同条件下
培养4~5 d后, 由于培养基中补充了Mo, 3 200多株
拟南芥幼苗的根系伸长较好, 侧生根也增多, 其生
长情况恢复良好(图1)。再将这些根系伸长很好的
幼苗转移到-Mo培养基上进行筛选培养, 培养1周
后, 将拟南芥根系生长停滞或生长困难的576株幼
苗移栽到充满蛭石的石棉上, 在光照培养箱中生
长至开花结实(图2), 收获309株拟南芥M3代种子
(表1)。
2 拟南芥Mo敏感变异株的再次筛选
经过初步筛选之后, 单株收获的拟南芥M3代
种子将进一步进行筛选。分别在-Mo和+Mo培养
基上进行培养1周后, 其根系的生长情况存在明显
差异(图3)。根据这一性状, 筛选出在-Mo培养基上
根系较短而在+Mo培养基上根系生长较好的突变
体31株, 在-Mo培养基上根系生长较好而在+Mo培
养基上根系较短的突变体32株, 以及在2种培养基
中的根系为其它形态(如簇生根、根尖膨大等)的
突变体4株(表2)。这些结果说明, 筛选出的31株拟
南芥可能对Mo缺乏敏感, 是Mo敏感的拟南芥变异
株, 而另外的32株可能对Mo缺乏不敏感, 是Mo耐
性的拟南芥变异株。
3 拟南芥Mo敏感变异株的表型分析
对经过反复筛选得到的Mo缺乏敏感变异株
进行表型分析, 将单株收获的M4代种子消毒后分
表1 拟南芥M2代Mo敏感变异株的初步筛选
Table 1 The first screening of Mo-sensitive mutant from Arabidopsis M2
编号
接种于-Mo培养 第1次筛选的根系 第2次筛选的根系 第3次筛选的根系生长 最后收获种子
基上的种子数 较短的植株数 较长的植株数 停滞或缓慢的植株数 的植株数
1 1 170 151 94 20 16
2 1 200 166 85 16 10
3 1 200 204 145 17 10
4 1 200 182 122 16 13
5 1 200 174 113 24 14
6 1 100 128 90 16 13
7 1 300 214 155 22 11
8 1 250 202 169 59 31
9 1 100 159 135 22 16
10 1 000 170 140 15 8
11 2 000 243 128 22 12
12 2 100 258 134 22 9
13 2 270 314 185 31 11
14 2 060 247 132 31 13
15 2 100 315 199 37 15
16 2 100 324 213 45 15
17 2 000 371 244 36 18
18 2 170 321 183 24 15
19 2 100 414 277 53 30
20 2 150 389 279 48 29
总计 32 770 4 946 3 222 576 309
植物生理学报174
别接种于-Mo和+Mo培养基上进行培养, 以野生型
Col-0作为对照。培养2~3周后的结果显示, 与野生
型拟南芥相比, 在-Mo培养基中, 变异株生长明显
受到抑制, 主要表现为植株矮小, 叶片失绿, 叶缘
卷曲。而在+Mo培养基中野生型与变异株的生长
状况没有明显差异(图4)。同时, 对-Mo和+Mo培养
基中拟南芥植株叶和根的鲜重进行了测定。结果
表明, 在-Mo培养基中, 变异株2-4叶和根的鲜重均
低于野生型Col-0的; 而在+Mo培养基中, 变异株
2-4叶和根的鲜重与野生型Col-0的差异不明显, 但
是+Mo培养基中变异株2-4的叶和根的鲜重比
在-Mo培养基中的高(图5)。这些结果说明, Mo确
图1 拟南芥M2代种子在初步筛选中的根系生长
Fig.1 The root growth of Arabidopsis M2 seeds in the first screening
黑色短横线表示第1次筛选时在-Mo培养基上根的伸长位置, 蓝色短横线表示第2次筛选时在+Mo培养基上根的伸长位置。
图2 初步筛选后拟南芥的移栽
Fig.2 The transplanting of Arabidopsis after first screening
图3 拟南芥M3代种子在-Mo和+Mo培养基中的生长
Fig.3 The growth of Arabidopsis M3 seeds on -Mo and +Mo media
画圈的为符合实验预期的表型变异株。
巫飞飞等: 拟南芥Mo敏感变异株的筛选和表型分析 175
图4 -Mo和+Mo培养基中Mo敏感拟南芥变异株2-4的表型
Fig.4 Phenotypes of Mo-sensitive Arabidopsis
mutant 2-4 on -Mo and +Mo media
实对变异株2-4的生长有着明显的影响, 也就是说
变异株2-4对Mo的缺失较为敏感。
实验进一步对变异株2-4叶和根中的钼含量
表2 拟南芥M3代Mo敏感变异株的第2次筛选
Table 2 The second screening of Mo-sensitive mutants from Arabidopsis M3
编号
收获M3种子 在-Mo培养基中根短且在+Mo 在-Mo培养基中根长且在+Mo 在2种培养基中根的形态
的植株数 培养基中根长的植株数 培养基中根短的植株数 其它表型不同的植株数
1 16 2 0 0
2 10 2 0 1
3 10 0 3 2
4 13 1 1 0
5 14 2 2 0
6 13 1 1 0
7 11 2 3 0
8 31 4 4 0
9 16 2 0 0
10 8 1 2 0
11 12 1 0 0
12 9 1 1 0
13 11 0 2 0
14 13 2 1 0
15 15 1 2 0
16 15 2 1 0
17 18 3 2 1
18 15 2 2 0
19 30 2 4 0
20 29 0 1 0
总计 309 31 32 4
进行了测定。结果(图6)显示, 在-Mo培养基中, 野
生型Col-0的叶中钼含量是变异株2-4的3倍左右,
而根中钼含量是变异株2-4的8倍左右, 明显高于变
异株2-4。在+Mo培养基中, 野生型Col-0叶和根中
钼含量也高于突变体, 其中叶中钼含量是变异株
2-4的2.5倍左右, 而根中钼含量是变异株2-4的4倍
左右。但是在+Mo培养基中不管是野生型还是变
异株叶和根中的钼含量都远远高于在-Mo培养基
中的, 甚至达到几百倍。这一结果进一步表明变
异株2-4确实是Mo敏感的突变体。
另外, 变异株2-4表型恢复试验结果(图7)显示,
随着培养基中Mo浓度的增加, Mo敏感变异株的缺
钼症状得到不断恢复。在-Mo培养基中, Mo敏感
变异株呈现明显的缺钼症状; 而在钼浓度为1.7
nmol·L-1的培养基中, 其生长有所恢复, 缺钼症状
也有所缓解; 当培养基中钼浓度达到170 nmol·L-1
时, 这些Mo敏感变异株的表型特征与野生型相比
没有明显差异(图7)。结果进一步表明突变株2-4
确实是Mo敏感的突变株。
植物生理学报176
讨　　论
本研究是从EMS诱变拟南芥种子得到的突变
体库中筛选出对钼元素缺乏敏感的突变体。实验
材料使用种子作为EMS诱变对象, 具有操作简单,
受外界因素影响较少, 容易获得较大的突变群体的
优点(Murphy和Taiz 1995)。对于突变体的筛选, 其
中最关键的是筛选方法, 越是单一的筛选条件以及
明显的表型变化, 越是能够获得理想的突变体。
本文采用特定的培养基, 经过初筛和复筛两
个阶段根据拟南芥根生长的不同表型特征筛选出
Mo敏感型突变体以及其它表型的突变体, 实验方
法简便易行, 且具有一定的创新性。另外, 本实验
针对筛选出的Mo敏感型突变体的表型进行了解
析, 结果显示与野生型拟南芥相比, Mo缺乏敏感突
变体在-Mo培养基中生长明显受到抑制, 出现植株
矮小, 叶片失绿黄化, 叶缘皱缩卷曲等典型缺钼症
状。而且在含Mo培养基中症状完全能够恢复, 这
符合Mo作为植物生长必需矿质元素的基本标准。
钼在植物生长发育中的主要作用是通过改变自身
化合物的化合价, 参与植物体内的氧化还原反应
来实现的, 与氮、磷和碳水化合物的转化和代谢
有着密切的关系(Simis等1975), 因而缺钼会导致植
物磷酸酶活性的增加, 此时磷酸脂会产生水解, 植
物体内磷脂态磷、RNA-P及DNA-P均会减少(严小
龙和廖红2003), 从而在表型上会发生一些明显的
变化。因此, 本研究通过表型筛选Mo敏感突变体
的思路是可行的, 结果是可靠的。
据研究表明, 拟南芥中的钼转运蛋白MOT1是
在植物中发现的首个转运钼的蛋白, 并对其功能
图6 -Mo和+Mo培养基中拟南芥变异株2-4叶和根中钼的含量
Fig.6 Mo contents in leaves and roots of Arabidopsis mutant 2-4 on -Mo and +Mo media
图5 -Mo和+Mo培养基中拟南芥变异株2-4叶和根的鲜重
Fig.5 Fresh weights of leaves and roots of Arabidopsis mutant 2-4 on -Mo and +Mo media
巫飞飞等: 拟南芥Mo敏感变异株的筛选和表型分析 177
进行了鉴定(Tomatsu等2007), 这对后来研究其它
植物的钼吸收与转运的分子机制做出了突出的贡
献。而Tomatsu等(2007)获得钼转运蛋白基因就是
采用图位克隆方法获得的, 就目前来说在其他植
物中分离并鉴定钼转运蛋白的报道也还很少。本
实验通过-Mo和+Mo培养基的筛选方法, 获得拟南
芥Mo敏感突变体, 并对其表型进行了简要分析。
今后的工作拟从分子水平上对这些Mo敏感的变异
株进行遗传分析, 并采用图位克隆的方法, 获得一
些与Mo吸收与转运有关的候选基因, 为研究植物
吸收与转运Mo的分子机制以及Mo的生理功能起
着重要的理论意义。
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图7 不同Mo浓度下拟南芥变异株2-4的表型
Fig.7 Phenotypes of Arabidopsis mutant 2-4 with
different concentrations of Mo