全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 779~784　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0022 779
收稿 2014-01-17　　修定 2014-02-21
资助 山东省农业良种工程项目(LZ2011)。
* 通讯作者(E-mail: sdipss@163.com; Tel: 0538-8266372)。
苹果矮化砧木‘JM7’的组织培养及其离体叶片不定梢再生
孙洪雁, 孙清荣*, 李国田, 张琼, 李芹
山东省果树研究所, 山东泰安271000
摘要: 以苹果优良矮化砧木‘JM7’ (Malus prunifolia×M. pumila ‘Malling 9’)为试材, 研究了基本培养基对试管苗增殖生长的
影响、蔗糖浓度对试管苗生根的影响及基本培养基、细胞分裂素种类和浓度对离体叶片不定梢再生的影响。结果表明:
基本培养基MS比QL显著提高增殖梢数, 但QL比MS更有利于获得健壮生长的绿苗。3%蔗糖浓度比2%的不定根发生速度
快。叶片不定梢再生最适宜的基本培养基是QL。在QL培养基上, 6-BA和TDZ对离体叶片不定梢再生率的影响无显著差
异, 但6-BA诱导产生的不定芽在不定梢诱导培养基上可直接伸长生长形成不定梢, 而TDZ诱导产生的不定芽需转移到不加
TDZ而加低浓度6-BA的培养基上形成伸长生长的不定梢。
关键词: 苹果矮化砧木; ‘JM7’; 增殖; 离体生根; 叶片外植体; 不定梢再生
Tissue Culture and Shoot Regeneration from in Vitro Leaf Explants of Apple
Dwarfing Rootstock Cultivar ‘JM7’
SUN Hong-Yan, SUN Qing-Rong*, LI Guo-Tian, ZHANG Qiong, LI Qin
Shandong Institute of Pomology, Tai’an, Shandong 271000, China
Abstract: A good apple dwarfing rootstock cultivar ‘JM7’ (Malus prunifolia×M. pumila ‘Malling 9’) was se-
lected as material. Effects of basal medium on shoot proliferation and sucrose concentration on in vitro rooting
were examined. Effects of basal medium, the kinds and the concentration of cytokinin on shoot regeneration
from in vitro leaf explants were investigated. Results showed that basal medium MS significantly improved
shoot proliferation than that QL, but stronger shoots were obtained on QL than on MS. The concentration of 3%
sucrose improved the process of root initiation than that of 2%. The optimal basal medium for shoot regenera-
tion from leaf explants was QL. When using QL as basal medium, the effects of TDZ and 6-BA on the percent-
age of shoot regeneration didn’t show significant difference. However, adventitious buds from 6-BA were able
to directly elongate and develop into shoots on shoot regeneration induction medium (SIM), whereas adventi-
tious buds from TDZ was unable to elongate and develop into shoots on SIM, it was necessary to transfer the
buds to the medium lacking TDZ but containing low concentration of 6-BA to form shoots.
Key words: apple dwarfing rootstock; ‘JM7’; proliferation; in vitro rooting; leaf explants; shoot regeneration
果树通过嫁接在适当的砧木上进行无性繁殖
已有数千年的历史。矮化砧木的应用也可追溯到
公元前3世纪。果树砧木对接穗品种的早实、树
体大小、果实的质量和产量及对不良环境条件的
抵抗能力都有重要影响(Fallahi等2002)。而矮化砧
木的育成与应用对果树的生产更有其特殊的意
义。矮化砧木可控制树体的长势, 使树体矮化, 减
少喷药量, 便于果实采收, 避免架梯采摘的危险。
矮化可加大种植密度, 充分利用光能, 提高单产。
世界各国育成矮化砧木品种最多的是苹果矮化砧
木, 栽培上利用矮化砧木最多和最有效的果树也
要数苹果, 世界各国都越来越重视苹果的矮化密
植栽培, 矮化密植是苹果现代化种植的方向。
但是在商业化生产中, 没有一个完全理想的
砧木可获得, 因此不断改良和育成砧木新品种是
果树育种的一个长期目标。世界上不断有实验室
和研究机构选育出新的更加优良的砧木新品种。
‘JM7’是日本国家苹果研究中心在1972~1975年间
以圆叶海棠为母本, ‘M9’为父本进行杂交, 经过多
年对杂交后代的筛选, 1996年投放市场(Soejima等
2010)的优良苹果矮化砧木, 该砧木对病虫抗性好,
特别是对颈腐病、苹果斑点落叶病、苹果绵蚜等
植物生理学报780
抗性好; 对环境的适应能力及对不同品种的嫁接
亲和性等综合性状表现优良。‘JM7’引入我国已有
10年以上, 经过在我国嫁接试栽试验, 矮化效果明
显, 抗逆性和适应性广(高彦等2004), 可通过硬枝
扦插繁殖(王甲威等2012), 是苹果矮化栽培市场前
景很好的砧木之一。但硬枝扦插繁殖速度慢, 生
根率低, 满足不了当前市场对苗木的需求。组培
育苗是代替常规繁殖的一个重要的快繁手段。组
培育苗可以提高生根能力并在短期内实现快速和
大量繁殖。组培还具有防止病害扩散和保持母本
的优良特性的特点。利用组培方法实现苹果砧木
的快速繁殖已在很多品种上获得了成功(Briand和
Hicks 1989; Kermani等2009; Sicurani等2001;
Yaseen等2009)。但砧木‘JM7’的组织培养和离体
叶片的不定梢诱导研究 , 国内外尚未见成功报
道。木本果树的离体叶片是遗传转化操作和诱变
体细胞变异最常用的外植体, 离体叶片的高频率
不定梢再生是遗传转化操作和离体体细胞诱变变
异的基础。本文的研究目的是建立‘JM7’的高效快
繁技术体系, 为适宜地区苹果矮化栽培的商业化
生产提供优良无性系砧木, 为建立标准化优质果
园奠定技术基础。建立离体叶片高效不定梢再生
技术体系, 为开展外源基因转化研究及离体体细
胞诱变研究奠定基础。
材料与方法
1 材料
栽植在温室盆中生长的苹果矮化砧木‘JM7’
(Malus prunifolia×M. pumila ‘Malling 9’)树苗。
2 方法
2.1 试管苗的建立
2013年4月, 从温室盆中剪取正在生长的半木
质化绿梢, 剪成一芽一段的茎段, 先用洗衣粉水刷
洗后, 再用自来水流水冲洗30 min, 然后在超净台
上用0.1% HgCl2杀菌8 min, 倒出HgCl2用无菌水洗
3~5次, 接种到装有MS+1 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1
IBA培养基的试管中, 每管一个茎段。接种后放光
下培养, 培养4周后, 腋芽萌发并伸长成绿梢, 获得
的这些无菌苗用于进一步进行增殖实验的材料。
2.2 试管苗的增殖
将茎段上腋芽萌发获得的无菌苗, 分别转移
到添加0.5 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 IBA的QL和MS
培养基上进行继代增殖培养。每一种培养基接种
3瓶, 每瓶种10个带腋芽的茎段外植体。每一继代
培养周期为4周, 继代培养3次, 分别记录每个外植
体的新增梢数。实验重复2次。
2.3 试管苗生根诱导
试管苗增殖一定数量后, 切取生长高度在1.5
cm以上的健壮绿梢分别转移到添加2%和3%蔗糖
的生根培养基1/4MS+0.5 mg·L-1 IBA上进行生根诱
导。生根培养4周, 观察记录生根梢数及每株生根
数量, 计算生根率和平均每株生根数量。生根率=
生根梢数/接种总梢数×100%, 平均每株生根数=生
根植株产生的总根数/生根株数。
2.4 离体叶片的不定芽诱导
切取在增殖培养基上生长健壮的绿梢顶部刚
展开幼嫩叶片, 垂直于叶片中脉横切伤, 只切成伤
口, 但叶片不切断, 接种于不定芽诱导培养基上。
不定芽诱导培养基设两种基本培养基MS和QL, 分
别添加不同浓度的6-BA (3、5 mg·L-1)和TDZ (1、2
mg·L-1)共有8种处理, 每一处理都添加0.3 mg·L-1
IBA。每处理接种3瓶, 每瓶10个叶片外植体。接种
后先暗培养, 3周后转到光下培养。实验重复3次。
3 培养条件
除需要暗培养的, 其余实验都在光周期为14
h/10 h (光/暗)的光培养条件下进行培养, 光照强度
为30~40 μmol·m-2·s-1, 培养温度为(25±2) ℃。
4 数据统计分析
所有实验结果采用DPS v3.01软件进行统计
分析, 不同处理平均值用Turkey法进行差异比较
分析。
实验结果
1 试管苗的增殖
基本培养基MS上的增殖梢数显著高于QL (表
1), 但梢的生长形态以在QL培养基上生长较好。
在QL增殖培养基上, 梢的生长表现为既有良好的
增殖生长又有良好的伸长生长, 叶片大而展开, 绿
苗生长健壮(图1-A); 而在MS培养基上, 虽增殖生
长较好, 但叶片小而不伸展, 苗长势较弱(图1-B)。
因此根据试管苗生长的综合表现, QL培养基是
‘JM7’最适继代增殖培养基。
孙洪雁等: 苹果矮化砧木‘JM7’的组织培养及其离体叶片不定梢再生 781
2 试管苗的生根
2.1 蔗糖浓度对不定根发生和根生长的影响
‘JM7’在蔗糖浓度2%和3%的生根培养基上的
最终生根率和平均每株根数差异不显著(表2), 两
种浓度的生根率都达95%以上, 平均单株根数在5
条以上。但蔗糖浓度影响不定根发生的进程, 蔗
糖浓度3%比2%的不定根发生速度快(表2)。生根
培养14 d, 3%蔗糖培养基上的生根率达92.27%, 而
2%蔗糖培养基上的生根率为79.87%; 平均每株根
数也表现为3%蔗糖显著高于2%蔗糖。但培养至
表1 培养基对‘JM7’试管苗增殖生长的影响
Table 1 The effect of media on shoot proliferation of ‘JM7’
培养基/mg·L-1 4周增殖梢数 苗生长情况
QL+6-BA 0.5+IBA 0.2 3.11±0.43b 梢伸长生长良好, 叶片较大、展开, 苗生长健壮
MS+6-BA 0.5+IBA 0.2 3.97±0.80a 梢伸长生长良好, 叶片较小、不伸展, 苗生长较弱
　　数字旁不同字母表示经Turkey法检验差异显著(P<0.05)。
图1 ‘JM7’试管苗的增殖和生根
Fig.1 Shoot proliferation and in vitro rooting of ‘JM7’
A和B: 试管苗的增殖; A: QL+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IBA; B: MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IBA。C和D: 试管苗的生根; C:
1/4MS+0.5 mg·L-1 IBA+2%蔗糖; D: 1/4MS+0.5 mg·L-1 IBA+3%蔗糖。
表2 不同蔗糖浓度对’JM7’试管苗生根的影响
Table 2 The effect of sucrose concentration on rooting of in vitro shoots of ‘JM7’
培养时间/d
生根率/% 每株根数/条
2%蔗糖 3%蔗糖 2%蔗糖 3%蔗糖
14 79.87±19.90a 92.27±3.81a 4.23±2.72b 6.17±1.52a
18 93.92±6.90a 94.10±9.25a 5.46±2.70a 7.04±3.16a
22 97.43±6.29a 96.67±8.17a 5.50±2.29a 6.95±2.43a
　　生根培养基组成为1/4MS+0.5 mg·L-1 IBA。每个测定项目数字旁的不同字母表示经Turkey法检验差异显著(P<0.05)。
植物生理学报782
18 d后, 2%和3%蔗糖所产生的生根率和单株根数
都无显著差异, 尽管单株生根条数仍表现3%蔗糖
高于2%蔗糖。培养22 d后, 不再有新梢产生新根,
即生根率不再提高。根据根的产生速度和整齐度,
3%蔗糖为‘JM7’最佳生根浓度。
2.2 蔗糖浓度对不定根生长形态的影响
蔗糖浓度对生根率和平均每株生根的条数影
响差异不显著, 但蔗糖浓度影响根的生长形态。
2%蔗糖上产生的根比3%上产生的根要细和短(图
1-C、D)。因此认为3%蔗糖浓度比2%更适合
‘JM7’试管苗的生根。
根据以上不定根的发生速度、生根率、单株
生根条数及根的生长形态的综合分析比较, 可以
得出添加3%蔗糖的生根培养基为‘JM7’试管苗的
最佳生根培养基。
3 离体叶片不定梢诱导
3.1 培养基组成对不定梢再生率的影响
基本培养基组成明显影响‘JM7’离体叶片的不
定梢再生。在细胞分裂素种类和浓度相同的条件
下, 基本培养基QL比MS显著提高叶片不定梢再生
率(表3)。QL培养基上的平均再生率为72.7%, 而
MS培养基上的平均再生率仅为22.7%, 表明‘JM7’
叶片的不定梢再生, 基本培养基QL比MS有效。
6-BA不同浓度之间, 及TDZ不同浓度之间, 它们的
再生率都无显著差异。
3.2 细胞分裂素种类对不定梢伸长生长的影响
细胞分裂素种类影响不定梢的伸长生长。
6-BA诱导产生的不定芽在不定梢诱导培养基上可
直接伸长形成不定梢(图2-A、C), 而TDZ诱导产生
的不定芽在不定梢诱导培养基上不能直接伸长形
成不定梢(图2-B、D), 但转移到细胞分裂素浓度降
低的培养基上可获得伸长生长的不定梢。将6-BA
和TDZ诱导产生的不定梢分别转移到QL加0.5
mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 IBA的增殖培养基上, 都
获得了伸长生长和增殖生长良好的不定梢绿苗(图
2-E、F)。
4 不定梢生根
6-BA和TDZ诱导产生的不定梢在增殖培养基
上继代培养2次后, 选取生长高度1.5 cm以上的绿
梢转移到蔗糖浓度为3%的生根培养基上, 培养20
d时, 生根率都可达95%以上(数据未列出), 和腋芽
增殖获得绿梢的生根率相似。表明叶片产生的不
定梢和腋芽增殖获得的绿梢具有相同的增殖和生
根能力。
讨　　论
利用组培技术, 不同苹果砧木品种在腋芽增
殖(Briand和Hicks 1989; Dalal等2006; Soni等2011;
Werner和Boe 1980)、离体生根(Yaseen等2009;
Sharma等2007)及离体叶片不定梢再生(Hohnle和
Weber 2010; Rustaee等2007)研究方面都有成功报
道。但不同品种所用基本培养基、生长物质种类
和浓度不同。在MS培养基上, 苹果品种和苹果砧
木品种获得成功有效增殖的已有较多报道(Briand
和Hicks 1989; Dalal等2006; Soni等2011; Werner和
Boe 1980), 但本研究中QL比MS更有利于‘JM7’获
得健壮增殖生长的绿苗 , 这和苹果品种‘Topaz’
(Keresa等2012)及砧木‘M26’ (Sicurani等2011)的适
宜增殖培养基为QL的结果相似。表明不同基因型
其有效增殖所需要的基本培养基组成不同, 应针
对不同基因型选择其最适宜的基本培养基组成。
在商业化生产中, 采用组培方法进行木本植
物品种的无性繁殖已成为一种行之有效的方法
(Jokinen和Törmälä 1992; Lewandowski 1991;
表3 不同培养基对‘JM7’离体叶片不定梢再生的影响
Table 3 The effect of media on shoot regeneration
from leaf explants of ‘JM7’
基本培养基 细胞分裂素 不定梢再生率/%
MS 6-BA 3 mg·L-1 2.76±2.54e
MS 6-BA 5 mg·L-1 8.33±2.89de
MS TDZ 1 mg·L-1 43.33±11.55bc
MS TDZ 2 mg·L-1 36.67±11.55cd
QL 6-BA 3 mg·L-1 63.03±6.05abc
QL 6-BA 5 mg·L-1 76.67±15.28a
QL TDZ 1 mg·L-1 77.77±15.75a
QL TDZ 2 mg·L-1 73.33±11.55ab
　　同一列中的不同字母表示经Turkey法检验差异显著(P<0.05)。
细胞分裂素6-BA和TDZ对不定梢再生率的影
响, 依赖于基本培养基的不同而表现不同。以MS
为基本培养基时, TDZ比6-BA有效, 但6-BA不同浓
度之间及TDZ不同浓度之间, 其再生率都无显著差
异。以QL为基本培养基时 , 6-BA和TDZ之间 ,
孙洪雁等: 苹果矮化砧木‘JM7’的组织培养及其离体叶片不定梢再生 783
Perinet和Tremblay 1987)。不定根的形成是组培育
苗中关键的一步。有效的生根方法应该是既能诱
导较高的生根率又能诱导较高的生根数量。做为
碳源和能量的蔗糖在植物组织培养中是培养基的
重要组分, 蔗糖浓度不仅影响试管苗的增殖而且
对生根也有重要影响。蔗糖浓度从1%提高到3%,
苹果砧木‘MM.106’ (Bahmani等2009)及蒲桃试管
苗(Khan等1999)的生根率、单株生根数及根的长
度都随之增加。Vahdati等(2004)研究表明蔗糖浓
度显著影响山核桃试管苗的生根率, 蔗糖浓度1%
时, 生根率为0; 浓度2%时, 生根率为3%; 浓度3%
时 , 生根率为31%; 而浓度为4%时 , 生根率为
62%。Plego-Alfaro (1988)研究得出没有蔗糖的生
根培养基, 不仅生根率很低, 而且根生长很差。这
些都说明根的启动是一个消耗能量的过程, 在根
的形成过程中蔗糖可能充当能源。本研究中蔗糖
浓度3%和2%虽然最后的生根率无显著差异, 但
3%比2%明显提高生根的速度, 这和Al-Khalifah等
(2005)报道的蔗糖4%比3%显著缩短玫瑰试管苗不
定根发生所需时间的结果相一致。表明根的启动
诱导需要较高的能量, 较高浓度蔗糖可加快不定
根形成的速度。
本研究中, ‘JM7’叶片在QL上获得的再生率显
著高于MS, 这和苹果砧木‘M9’ (Hohnle和Weber
2010)、‘M26’ (Predieri和Malavasi 1989)、‘Jork 9’
(Sedira等2001)等叶片不定梢再生的最佳培养基为
MS的结果不一致。MS和QL组分的最主要差异是
NH4含量及NO3与NH4比例的不同(数据未列出)。
表明叶片不定梢再生适宜的NH4含量及NO3与NH4
比例因基因型不同而不同。
植物生长物质在诱导叶片不定梢形成中具有
重要作用。TDZ被认为是木本植物的组织培养中
图2 ‘JM7’离体叶片的不定梢再生
Fig.2 Shoot regeneration from in vitro leaf explants of ‘JM7’
A和B: 分别为添加5 mg·L-1 6-BA和1 mg·L-1 TDZ诱导培养基上产生的不定芽(梢); C和D: 6-BA和TDZ诱导产生的不定芽(梢)转移到继
代培养基生长1周; E和F: 6-BA和TDZ诱导产生的不定芽(梢)转移到继代培养基生长3周。
植物生理学报784
活性最强的类细胞分裂素物质(Huetteman和Preece
1993)。本文中, TDZ比6-BA显著提高‘JM7’叶片的
不定梢再生率, 表明了TDZ的高活性。但TDZ诱导
的不定梢伸长差, 需转移到加较低浓度6-BA的培
养基上促进其伸长生长, 这和前人报道的TDZ抑制
梢的伸长的结果相一致(Peddaboina等2006; Wang
等2007)。
本研究建立了苹果优良矮化砧木‘JM7’的组
织培养和离体叶片高效不定梢再生技术体系, 为
工厂化试管育苗和利用诱变及遗传转化等生物技
术手段改良品种奠定了技术基础。
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