全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (1): 77~82 77
收稿 2013-08-30　　修定 2013-11-20
资助 西北师范大学知识与科技创新工程(NWNU-KJCXGC03-
65)和国家自然科学基金(30960464)和生物学省级重点学
科项目。
* 通讯作者(E-mail: dinglan@nwnu.edu.cn; Tel: 18919807050)。
濒危植物佛手参种子的非共生萌发及种苗的快速繁殖
丁兰1,*, 张丽1, 郭柳2, 桑杰2, 秦临喜2, 王保强1
1西北师范大学生命科学学院, 兰州730070; 2西藏奇正藏药股份有限公司, 西藏林芝860000
摘要: 离体条件下对佛手参种子进行了非共生萌发研究, 成功实现了种子萌发, 并通过根状茎增殖和分化获得了大量再生
种苗。结果表明, 成熟佛手参种子难以萌发, 而未成熟种子具有萌发能力, 萌发率可达到20%, 最适萌发培养基为:
1/2MS+1.0~2.0 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA+10.0 mg·L-1腺嘌呤; 根状茎增殖最适培养基为: 1/2MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1
NAA+10.0 mg·L-1腺嘌呤; 芽分化最适培养基为: 1/2MS+1.0 mg·L-1 KT+10.0 mg·L-1腺嘌呤。较高浓度的细胞分裂素(1.0
mg·L-1 KT)与较低浓度类生长素(0.1 mg·L-1 NAA)的配比对佛手参种子萌发、根状茎增殖及芽分化具有明显的促进作用; 较
高浓度的NAA抑制种子萌发。根状茎与愈伤组织的增殖能力无明显差异, 但前者的分化能力却显著高于后者。
关键词: 佛手参; 种子非共生萌发; 根状茎; 愈伤组织; 再生植株
Asymbiotic Seed Germination and Rapid Seedling Regeneration of Endangered
Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.
DING Lan1,*, ZHANG Li1, GUO Liu2, SANG Jie2, QIN Lin-Xi2, WANG Bao-Qiang1
1College of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China; 2Xizang Cheezheng Tibetan Medicine Co. Ltd,
Linzhi, Tibetan 860000, China
Abstract: In vitro asymbiotic seed germination of Gymnadenia conopsea was successfully established and a
mount of regernerated seedlings were obtained via rhizomes multiplication and differentiation. The results
showed that immature seeds could germinate at 20% rate while mature ones could not. The optimum
germination medium was 1/2MS+1.0–2.0 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA+10.0 mg·L-1 adenine, the optimum media
for rhizome multiplication and differentiation were 1/2MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+10.0 mg·L-1
adenine and 1/2MS+1.0 mg·L-1 KT+10.0 mg·L-1 adenine, respectively. The combination of higher concentration
of cytokinin (1.0 mg·L-1 KT) and lower concentration of auxin (0.1 mg·L-1 NAA) made promoting effect on seed
germination, rhizome multiplication and bud differentiation. Higher concentration of NAA could inhibit seed
germination. Rhizomes and calluses could proliferate without significant different, while the former differentiate
more easily.
Key words: Gymnadenia conopsea; seed asymbiotic germination; rhizome; callus; regenerated plantlets
兰科手参属植物为多年生草本植物, 全世界
共10种, 我国有5种, 包括西南手参、手参、短距
手参、峨眉手参和角距手参(席以珍等2000)。佛
手参因具有可观的药用价值而被列入多部藏医药
经典(马哈也那1993; 帝玛尔·丹增彭措1986; 宇
妥·元丹贡布1987)。藏医和中医药研究认为该药
有补益、强身、安神、增智、延年益寿等功效,
是不可多得的药用珍品(林志成2009)。随着佛手
参药用产业化发展以及佛手参产地旅游业的兴起,
佛手参的需求量越来越大, 其价格也逐年攀升, 盲
目的滥采滥挖导致其野生资源急剧减少、甚至面
临枯竭, 目前佛手参已被《濒危野生动植物种国
际贸易公约》列为二级珍稀濒危植物 (李敏等
2006)。因此, 开展规模化人工栽培是保护生态环
境和解决佛手参药用资源紧缺问题的必由之路(林
志成2009; 雒成林等2001)。
兰科植物的种子极小(每粒种子长1~2 mm, 直
径0.1~0.2 mm), 由于其胚发育不完全, 缺乏供给
营养成分的胚乳, 因此在自然条件下需要与生境
中的真菌共生才能萌发, 自然萌发率极低(Kauth
2005)。兰科植物依其生长的环境可分为气生兰和
植物生理学报78
陆生兰, 生长于土壤中的陆生兰为了适应其分布
地的生态环境, 在长期的进化中发展了种皮厚及
含有阻碍萌发的物质等特征(Pant等2011; 李方
2004), 其种子比气生兰种子更难以萌发。兰科手
参属植物为陆生兰类, 据笔者野外考察发现佛手
参的无性繁殖是由老手参根部仅增生一个小手
参, 当小手参长大时, 老手参枯死, 平均繁殖倍数
低于2, 而种子的自然萌发率也极低。目前, 佛手
参的人工栽培尚未成功, 最大的困难还在于其种
苗繁殖技术难以突破。因此, 解决佛手参的种苗
规模化繁殖是实现其人工栽培、药用开发及种质
资源保护的关键。
目前, 对佛手参的研究主要集中在植物化学
(李敏等2006)、生药学(谢静等2005)及药效学(林
志成2009)等方面, 国外尚无佛手参栽培、种子萌
发及组织培养相关的报道 , 在国内仅金洪等
(1995)对佛手参缩短茎进行了初步培养, 从缩短
茎诱导出芽及不定根, 但未能进一步成功继代培
养。种子非共生萌发技术是兰科植物产业化生产
中常用的种苗繁殖途径, 该方法利用不同成熟度
种子、剪破种皮或培养基添加生长调节物质等方
式克服了兰科植物种子无共生菌难以萌发的困
难, 同时利用种子萌发后生成的原球茎(根状茎)
在一定培养条件下可大量增殖和分化的特性, 以
达到种苗规模化繁殖的目的(李方2004)。本文对
采自甘肃省兴隆山的佛手参种子进行了非共生萌
发研究, 首次成功实现了种子萌发、根状茎和愈
伤组织大量增殖、种苗再生, 为佛手参种苗产业
化生产和最终实现人工栽培提供科学依据。
材料与方法
1 材料来源
佛手参[Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.]蒴果
2010年8月采自甘肃省榆中县兴隆山, 根据种子的
颜色, 将受试种子分为3个成熟度: (1)未成熟种子:
不易与胎座剥离的白色种子; (2)中度成熟种子: 易
与胎座剥离的黄色种子; (3)成熟种子: 易与胎座剥
离的褐色种子。
2 果荚和种子的表面消毒与接种
选取绿色、饱满的未成熟果荚或未开裂的成
熟果荚, 用刷子或纱布轻轻拭去表面尘土, 流水冲
洗30 min, 洗涤剂清洗后用蒸馏水冲洗3~5遍, 在
无菌条件下将其转至无菌瓶内; 用无菌水冲洗3遍
后 , 先后用75%乙醇消毒60~120 s和浸泡0.1%
HgCl215~20 min, 最后用无菌水冲洗5~7遍, 洗去果
荚表面残余HgCl2溶液。用无菌手术刀片纵向割开
果荚, 挑出种子, 散铺于萌发培养基(表1) 中。接种
后的种子在(23±2) ℃黑暗条件下培养7 d后, 置于
光照周期12 h·d-1, 光照强度2.7 μmol·m-2·s-1的散光
条件下培养。实体镜下观察萌发情况并统计萌动
率和萌发率。萌动指种子膨大; 萌发指膨大的种
子能够形成原球茎。
本实验种子萌发诱导、根状茎(愈伤组织)诱
导及再生苗的分化均以1/2MS (Murashige和Skoog
1962)培养基作为基础培养基, 附加不同种类和浓
度的植物生长物质 , 并添加20 g·L-1 蔗糖、200
mL·L-1 椰汁、5.0 g·L-1 琼脂及1.0 g·L-1 活性炭, 培养
基pH 5.6。
3 根状茎和愈伤组织的诱导和增殖
挑取萌发种子形成的原球茎, 播种在诱导增
殖培养基(表2) 上, 诱导根状茎或愈伤组织的形成;
待根状茎和愈伤组织长出以后, 将根状茎切为长
约0.3 cm的节段, 愈伤组织切成0.3 cm×0.3 cm小
块平铺于新鲜的原培养基上; 置于温度(23±2)℃,
光照周期12 h·d-1, 光照强度18 μmol·m-2·s-1的条件
下培养。每45 d继代一次, 并观察、记录原球茎
的生长状况。根状茎和愈伤组织的增殖以继代3
次的平均增长质量计算。公式为: 根状茎(愈伤组
织)增殖倍数=接种45 d后的平均质量(g)/接种平均
质量(g)。
4 再生苗的分化形成
根状茎和愈伤组织在继代多次后会分化出芽,
统计分化率, 并将已分化的小芽从原培养物中分
离, 接种在诱导增殖培养基上, 观察并记录种苗
根、芽的生长状态。培养条件与根状茎(愈伤组
织)增殖培养条件相同。
实验结果
1 种子成熟度和植物生长物质对佛手参种子非共
生萌发的影响
将3种成熟度的佛手参种子经消毒处理后接
种于含有不同种类和浓度的植物生长物质的萌发
丁兰等: 濒危植物佛手参种子的非共生萌发及种苗的快速繁殖 79
培养基上, 中度成熟和成熟种子在培养基上均不
萌发, 也不具有萌动趋势。从表1可以看出, 未成
熟种子在培养基5~7号上能萌动和萌发, 在培养基
1号上能萌动但不能萌发, 在培养基2~4号上不能
萌动及萌发。
未成熟种子在培养10 d后逐渐从白色变为浅
褐色, 培养基5号上有10%的未成熟种子开始膨大
萌动, 但30 d后大部分膨大萌动后的种子停止发
育, 仅个别种子能发育成为原球茎(图1-A)。而在
培养基6、7号上的未成熟种子在接种10 d后分别
有32%和39%的种子萌动; 50 d后分别有20%和
19%的已萌动种子逐渐形成白色原球茎(图1-B);
培养80 d后这些原球茎向下生长, 于培养基琼脂层
中形成根状茎(图1-C)。这些根状茎不能在原培养
基中分化成芽, 若不及时转入适宜的继代培养基
中将会停止生长和发育, 继而死亡。
2 根状茎和愈伤组织的增殖与分化
将培养基5~7号上生长旺盛的根状茎切段后
转入培养基8~12号中继代培养, 切段后的根状茎
在上述5种培养基中均能良好生长和增殖(图1-D),
每45 d转接一次, 某些根状茎可逐渐分化, 一端成
芽体, 另一端成根, 最终形成完整小植株。但不同
培养基上的根状茎(图1-E~G)的生长速率及芽分化
率存在很大差异。
从表2可以看出, 根状茎在高浓度细胞分裂素
(3~12 mg·L-1 6-BA)与低浓度类生长素(0.1 mg·L-1
NAA)并附加有腺嘌呤(10 mg·L-1)的培养基8~10号
中生长良好, 增殖倍数可达到2.2~2.8倍, 但其芽分
化率很低, 仅为5.7%~10.2%。培养基11、12号降
低细胞分裂素含量并改用KT, 根状茎增殖倍数降
低至1.5~1.6倍, 而分化率大幅度提高, 尤其是去掉
腺嘌呤后, 培养基12号分化率提高至66.5%。
种子萌发形成的部分原球茎在培养基12号中
能进一步发育形成愈伤组织(图1-H)。8周后将愈
伤组织转入培养基1号、8号、9号、11~13号中,
愈伤组织均能较好的生长和增殖(图1-I), 其增殖倍
数可保持在3左右, 但其芽分化率低于根状茎。不
含植物生长物质的培养基1号和高浓度细胞分裂
表1 植物生长物质对佛手参种子萌发的影响
Table 1 Effects of plant growth substances on germination of G. conopsea
培养基 NAA浓度/mg·L -1 2,4-D浓度/mg·L -1 KT浓度/mg·L -1 腺嘌呤浓度/mg·L -1
类生长素浓度/细
萌动率/% 萌发率/%
胞分裂素浓度
1 － － － － － 5 0
2 2.0 － 0.2 － 1:0.1 0 0
3 0.5 － 0.2 － 1:0.4 0 0
4 － 0.2 0.2 － 1:1 0 0
5 1.0 － 1.0 － 1:1 10 5
6 0.1 － 1.0 10.0 1:10 32 20
7 0.1 － 2.0 10.0 1:20 39 19
表2 植物生长物质对根状茎和愈伤组织的增殖及芽分化的影响
Table 2 Effects of plant growth substances on proliferation and differentiation of rhizomes and calluses
组织种类 培养基 NAA浓度/mg·L-1 KT浓度/mg·L-1 6-BA浓度/mg·L-1 腺嘌呤浓度/mg·L-1 增殖倍数 芽分化率/%
根状茎 8 0.1 － 12.0 10.0 2.8±0.34 8.2
9 0.1 － 6.0 10.0 2.7±0.25 5.7
10 0.1 － 3.0 10.0 2.2±0.21 10.2
11 － 1.0 － 10.0 1.5±0.25 20.5
12 0.1 1.0 － － 1.6±0.16 66.5
愈伤组织 1 － － － － 3.5±0.14 0
8 0.1 － 12.0 10.0 3.3±0.20 0
9 0.1 － 6.0 10.0 3.0±0.25 5.5
11 － 1.0 － 10.0 2.8±0.31 7.2
12 0.1 1.0 － － 2.8±0.11 2.0
13 0.2 0.2 － － 2.7±0.22 2.0
植物生理学报80
素(12 mg·L-1 6-BA)培养基8号不能诱导愈伤组织分
化成芽, 其它培养基均具有一定的芽分化能力, 但
分化率很低(2%~7.2%)。
3 再生植株形成与生长
本实验中不管是佛手参根状茎还是愈伤组织,
一旦分化出芽, 便很快在芽基部长出多条根, 进而
发育形成再生植株(图1-F和G)。实验表明, 根的生
长速度远大于芽的向上生长, 因此小芽在培养基
中很快形成了根远远长于芽的小植株(图1-F、G、
J)。继续在原培养基中培养, 芽体生长缓慢, 根继
续伸长并长粗, 3个月后的再生植株有3~4片3 cm
长披针形叶、约5条5 cm长肉质根(图1-K)。如若
将已长大的再生植株转入不同的新鲜培养基(8、
11、12号)中进行壮苗培养, 4周后小苗叶逐渐发
黄, 随之根褐化, 继而死亡。也就是说所形成的
再生植株不能继续进行壮苗生长。由于再生植
株的芽体和根均很幼嫩, 直接移栽入温室其存活
率很低。
图1 佛手参种子的非共生萌发和种苗发育
Fig.1 Asymbiotic seed germination and seedling development of G. conopsea
A: 种子萌动及原球茎形成; B: 原球茎大量形成和生长; C: 原球茎向下伸长生长, 在琼脂中形成根状茎(箭头); D: 根状茎(箭头)增殖; E: 根
状茎(箭头)分化成芽; F和G: 根状茎分化形成完整植株; H: 愈伤组织形成; I: 愈伤组织增殖及芽分化; J和K: 愈伤组织分化形成完整植株。
丁兰等: 濒危植物佛手参种子的非共生萌发及种苗的快速繁殖 81
讨　　论
佛手参属于陆生兰类, 其无性及有性繁殖均
较为困难, 人为的采挖导致了野生资源日益匮乏,
迫切需要像天麻、石斛等药用兰科植物一样进行
人工栽培(王旭红和余国奠1993), 而种苗的规模化
生产是实现人工栽培的关键技术。课题组曾尝试
利用佛手参的根、芽体和花梗为外植体进行离体
培养研究, 设计了大量不同植物生长物质组合的
培养基, 但接种的150个块根、150个花梗和20余
个芽体无一例诱导成功, 表明佛手参组织培养难
度很大。因此, 有必要另辟蹊径, 探索其种子的非
共生萌发途径, 解决种苗规模化生产的问题。本
研究首次对佛手参种子进行了非共生萌发研究,
种子萌发率可达到20%, 并实现了根状茎的大量增
殖和芽分化, 成功获得了大量再生植株, 对进一步
实现佛手参种苗的产业化打下了坚实的基础。
佛手参种子非共生萌发过程中再生植株产生
途径总结如图2所示。
图2 佛手参种子非共生萌发中再生植株产生途径
Fig.2 The progress of asymbiotic germination of G. conopsea
陆生兰种子的非共生萌发是否成功通常与其
种子的成熟度有关, 且未成熟的种子更易萌发, 这
可能与种子休眠或种子内有抑制物积累相关(丁兰
和付庭治2006; Thompson等2006; 陈之林等
2004)。本实验中, 仅有未成熟的佛手参种子能够
萌发, 而中度成熟或完全成熟种子均不能萌发, 因
此 , 未成熟佛手参种子是非共生萌发的最佳材
料。关于成熟的佛手参种子不能萌发的原因还需
进一步研究。
细胞分裂素和生长素在陆生兰种子非共生萌
发中起重要作用, 前者的促进作用较后者更为明
显(Thompson等2006; Deb和Pongener 2011)。细胞
分裂素(BA或ZT)的加入可提高日本濒危野生杓兰
属一个变种(Cypripedium macranthos var. rebun-
ense)种子的萌发率, 但是, 类生长素NAA的加入会
产生相反效果(Shimura和Koda 2004), 尤其是较高
浓度(5.37 μmol·L -1)的NAA不仅不能促进唇齿兰种
子萌发, 甚至还会起抑制种子萌发的作用(Jaime和
Yolima 2006), 这与本实验结果相似。本实验中, 佛
手参种子萌发率随着类生长素(NAA)与细胞分裂
素(KT)比值的降低而增加(表1), 1.0~2.0 mg·L-1 KT
和0.1 mg·L-1 NAA的植物生长物质配比并附加有
10 mg·L-1腺嘌呤可使种子萌动率和萌发率分别达
到39%和20%; 而高浓度类生长素与低浓度细
胞分裂素的配比(培养基2~4号)不利于种子的萌
发, 表明细胞分裂素在佛手参种子的萌发中起重
要作用。
根状茎被认为在国兰组织培养中扮演着承上
启下的角色, 学者们研究不同切割方式、激素种
类和浓度以及光周期等因素对根状茎增殖与芽分
化的影响(李方2004)。本文探索了不同植物生长
物质组合对根状茎增殖和芽分化的影响。结果表
明, 细胞分裂素对佛手参根状茎增殖和分化起着
关键作用, 其中高浓度6-BA与低浓度NAA相配比
对根状茎的生长和增殖起着重要作用, 但不利于
对芽的分化 ; 而降低细胞分裂素浓度 , 使用1.0
mg·L-1 KT可以促进芽的分化。
兰科植物在种子萌发和离体培养过程中形
成特有的原球茎或根状茎 , 极少有愈伤组织产
生。陈进勇等(1998)观察到蕙兰的‘九节兰’、‘大
富翁’和‘富财’品种其种子形成的类原球茎在适宜
的培养基中能形成愈伤组织, 并可以进一步分化
出芽, 他认为这与品种和激素浓度有关。Shimura
和Koda (2004)也发现C. macranthos var. rebunense
种子萌发产生的原球茎可诱导产生黄白色致密愈
伤组织, 在含有NAA、BA或KT的培养基中又可分
化成类原球茎。本实验中佛手参种子萌发形成的
原球茎在1.0 mg·L-1 KT与0.1 mg·L-1 NAA培养基中
植物生理学报82
被诱导出愈伤组织, 并可大量增殖, 经多代低浓度
KT (1.0 mg·L-1)培养基转接具有一定的分化能力,
但与根状茎相比其分化能力非常有限。
目前实现种苗产业化的兰科植物多为气生
兰 , 陆生兰种子萌发及种苗的繁殖很困难(李方
2004)。本实验对佛手参种子非共生萌发获得了
20%的萌发率, 并通过根状茎的增殖和分化得到了
大量的再生植株, 形态如图1-G、J、K所示, 但这
些试管苗转接进行继代壮苗培养却难以持续健康
生长。其原因尚待进一步研究探寻。
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