全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 8 期，2009 年 8 月 753
收稿 2009-02-24 修定 　2009-07-15
资助 国家自然科学基金项目(30 67 0 18 3)。
* 通讯作者(E-ma i l : cu ixh@tongj i .edu .cn; Tel : 02 1 -
6 5 9 8 9 4 6 4 )。
拟南芥CEO1基因在氯化镉诱导的氧化胁迫中的作用
崔香环 1,*, 朱佩燕 2, 李保珠 2
1 同济大学生命科学与技术学院, 上海 200092; 2 河南大学植物逆境生物学重点实验室, 河南开封 475001
提要: 以拟南芥 ceo1突变体为材料, 研究 CEO1 (clone eight-one)在镉胁迫条件下作用的结果表明, 与野生型植株相比, 150
μmol·L-1的CdCl2处理10 d后, 拟南芥ceo1突变体表现为植株生长矮小, 叶片卷曲发黄, 根系短小。镉处理后, 拟南芥突变体
幼苗叶中H2O2的积累较多; 镉处理1 h后的突变体中抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性明显上升, 至2 h时又开始下降, 而镉
处理2 h后, 野生型APX活性才开始增加。镉处理2 h后的野生型的谷胱甘肽还原酶(GR)显著增加, 而突变体无明显变化。
两种类型拟南芥的超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)的活性没有明显差异。
关键词: 拟南芥; CEO1; 镉胁迫; 活性氧; 抗氧化酶
The Role of Arabidopsis CEO1 Gene under CdCl2-Induced Oxidative Stress
CUI Xiang-Huan1,*, ZHU Pei-Yan2, LI Bao-Zhu2
1School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2Key Laboratory of Plant Stress Biology,
Henan University, Kaifeng, Henan 475001, China
Abstract: The role of Arabidopsis thaliana CEO1 (clone eight-one) under cadmium stress was studied by
using A. thaliana ceo1 mutants. The result indicated that ceo1 mutant seedlings exhibited dwarfer phenotype,
yellower and more curly leaves, and shorter roots after 150 μmol·L-1 CdCl2 treatment for 10 d as compared
with the wild-type ones. In addition, the content of H2O2 increased more obviously in the leaves of mutant
seedlings after cadmium treatment. The activity of ascorbate peroxidase (APX) evidently increased after cad-
mium treatment for 1 h and didn’t decrease in the mutants till 2 h, while APX activity began to enhance in the
wild-type ones at 2 h after treatment. The activity of glutathione reductase (GR) remarkably increased in the
wild-type ones and invisibly changed in the mutants after 2 h treatment. In contrast, the activities of catalase
(CAT) and superoxide dismutase (SOD) have no obvious difference between the both types of plants after
treatment.
Key words: Arabidopsis thaliana; CEO1; cadmium stress; reactive oxygen species; antioxidative enzymes
镉(Cd)是环境中的主要重金属污染源, 是危害
植物毒性最强的元素之一, 其毒性仅次于汞。据报
道, 植物遭受镉毒害后, 植株生长受到强烈抑制, 叶
绿体和线粒体受损, 叶片变黄并出现坏死斑, 光合
作用和呼吸作用下降, 最终导致生物产量下降
(Benavides等2005; Rodriguez-Serrano等2006)。还
有研究表明, 镉伤害植物是通过氧化胁迫而引起的
(Rodriguez-Serrano等 2006)。正常条件下, 植物细
胞本身具有防止活性氧(reactive oxygen species,
ROS)和自由基早期形成的非酶机制和清除它们的
酶促防御系统。其中超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)消除超氧阴离子自由基(O2－· )的毒
害, 过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧化
物酶(ascorbate peroxidase, APX)和谷胱甘肽还原酶
(glutathione reductase, GR)参与细胞内不同区室
H2O2 的清除, 因而 ROS 维持在一个较低水平。此
外, 许多植物在遭受镉胁迫时, 体内的抗氧化酶活性
发生改变, ROS和自由基大量积累, 膜脂过氧化, 最
终表现为生长受抑制, 甚至死亡(Shaw 1995; Gallego
等 1996; Sandalio 等 2001)。镉对植物的伤害是通
过氧化胁迫进行的, 但植物应答镉胁迫的分子机制
还不太清楚。据报道, 拟南芥 CEO1 (clone eight-
one)是植物中特有的一种蛋白, 其中存在富含 Trp
和Glu的WWE基序, 该区域与酵母(Saccharomyces
cerevisiae) Yap1 (yeast activator proteins)中的 WW
基序具有一定的同源性(Ahlfors 等 2004)。Yap1 是
酵母应答氧化胁迫通路的H2O2转录因子, 此基因的
缺失会导致酵母对H2O2 和镉所引起的氧化胁迫的
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敏感性(Carmel-Harel 等 2001)。已有研究表明, 拟
南芥CEO1基因在酵母中表达后, Yap1缺失型和野
生型酵母的抗氧化能力增强(Belles-Boix等2000), 表
明CEO1在生物的氧化胁迫中起作用。虽然CEO1
在酵母细胞中有互补Yap1的作用, 可增强其对氧化
胁迫的抗性, 但它在植物中是否参与对镉诱导的氧
化胁迫的应答, 其作用机制又如何, 都不太清楚。
为此, 本文以拟南芥CEO1基因的突变体为材料, 探
讨了拟南芥CEO1基因在镉诱导的氧化胁迫中的作
用。
材料与方法
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生型(Col-0)
和 CEO1 (AT1g32230)的 T-DNA插入突变体 ceo1
( Sa lk_ 11 6 43 2)种子购自拟南芥生物资源中心
(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC)。
野生型和纯合突变体种子分别经0.1%升汞表面消
毒 7 min, 用无菌水冲洗几次, 然后点种于 0.8% 琼
脂粉的 MS 培养基上, 放在 4 ℃中 2 d后, 移入光照
培养室中(光 / 暗周期为 12 h/12 h, 昼夜温度为 22/
18 ℃, 光照强度为 120~130 μmol·m-2·s-1, 相对湿度
为 70% 左右)培养。MS 培养基上萌发后生长 4 d
的拟南芥野生型和 ceo1 突变体幼苗移到含有 150
μmol·L-1 CdCl2的MS培养基上生长10 d后照相, 并
参照 Cui 等(2008)文中的方法测定根长。参照 Lee
等(2002)文中的方法, 将生长在含 150 μmol·L-1
CdCl2的MS培养基上10 d的拟南芥野生型和 ceo1
突变体的叶片分别转移到含 0.1 mg·mL-1 二氨基联
苯胺(3,3-diaminobenzidine, DAB)的50 mmol·L-1 Tris-
乙酸(pH 5.0)缓冲液中染色, 黑暗下室温孵育 24 h,
未处理的作为对照, 然后立即将材料投入到80%的
乙醇中煮沸10 min脱去叶绿素, 然后在新鲜的乙醇
中浸泡 4 h, 观察并照相。另外, 选取在 MS 培养
基上萌发后生长14 d的野生型(WT)和ceo1突变体
拟南芥苗, 用 150 μmol·L-1 的CdCl2 分别处理 0、1、
2、3 h, 然后称重, 液氮速冻, 存于 -80 ℃冰箱待
用。按 Jiang 和 Zhang (2001)文中的方法制备幼苗
的粗酶液并测定 SOD、CAT、APX、GR 的活
性。所有操作均在 4 ℃下进行。以上实验至少重
复 3 次, 在 0.05 概率水平上用 Student’s t 检验计算
差异显著性。
结果与讨论
1 CdCl2对ceo1突变体生长的影响
图 1 显示, 在镉处理 10 d 后, 野生型拟南芥幼
苗表现为叶片变黄、植株矮化的症状。这与
Rodriguez-Serrano等(2006)在豌豆(Pisum sativum)
中观察到的现象是相似的。而与野生型相比, 拟南
芥 ceo1 突变体植株更加矮小, 叶片小、卷曲且明
显失绿, 根系更为短小(图 1-c)。这表明镉明显抑
制 ceo1 突变体幼苗的生长。此外, 从镉处理后两
种植株的主根长度变化来看, 与未处理的相比, 镉
处理后, 野生型主根长度下降 33% , 而突变体却下
降 69% (图 1-e)。这些结果表明, ceo1 突变体幼苗
的生长对镉胁迫更加敏感, 显示CEO1基因可能介
导了拟南芥幼苗对镉胁迫的应答。
2 CEO1对镉胁迫下拟南芥幼苗产生H2O2的影响
为了检测镉胁迫对拟南芥野生型和ceo1突变
图 1 CEO1 对镉胁迫下拟南芥幼苗生长的影响
Fig.1 The effect of CEO1 on the growth of Arabidopsis seedlings under cadmium stress
a 和 b 分别为生长在 MS 培养基上的 ceo1 突变体和野生型拟南芥; c 和 d 分别为镉处理后的 ceo1 突变体和野生型拟南芥; e 为拟
南芥幼苗主根生长的分析。WT: 野生型拟南芥; ceo1 : CEO1 基因的突变体。
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体植株产生H2O2的影响, 我们用DAB染色方法确
定植物体内H2O2的水平。在有过氧化物酶存在下,
DAB一旦与H2O2接触就会迅速形成红褐色聚合物
沉淀, 因此, 可以通过直接观察颜色深浅及其出现
的部位来分析H2O2的含量和产生部位。图 2显示,
在未作CdCl2处理的拟南芥ceo1突变体和野生型植
株中H2O2的染色较浅(图2-a、b), 突变体的染色较
深(图 2-a); 而 CdCl2 处理 10 d 后, 这两种植株的染
色都明显变深(图 2-c、d), 其中 ceo1 突变体植株
的染色程度变化更明显(图 2-c)。这表明 ceo1突变
体叶片中积累了更多的 H2O2。这些结果不仅进一
步佐证了汤春芳等(2004)和 Rodriguez-Serrano 等
(2006)报道的“镉对植物的伤害是由氧化胁迫引起
的”看法, 而且还表明, CEO1基因可能参与拟南芥
幼苗对镉诱导的氧化胁迫的应答。
3 CEO1对镉胁迫下拟南芥中CAT和SOD活性的
影响
图 3 显示, 虽然在镉处理 1 h 内, CAT 或 SOD
的酶活性在拟南芥野生型与突变体中均明显下降,
但处理后的不同时间内, 野生型与突变体中2种酶
的活性变化趋势和幅度均基本上一致。突变体的
SOD的酶活性本底水平略低于野生型, 而CAT酶活
性的本底水平差异不明显。这些结果表明, 虽然镉
胁迫明显影响了拟南芥幼苗中CAT和SOD的活性,
但CEO1基因的缺失对镉胁迫诱导的2种酶的活性
变化不明显, 这说明 CAT 和 SOD 在 CEO1 基因介
导拟南芥幼苗对镉诱导的氧化胁迫的应答过程中作
用不明显, 且突变体中较低的 SOD 本底水平是由
CEO1 基因缺失引起的, 与镉胁迫似乎没有关系。
图 2 DAB 染色法确定拟南芥幼苗中 H2O2 水平
Fig.2 Detection of H2O2 level in Arabidopsis
seedlings by DAB staining
a 和 b 分别为生长在 MS 培养基上的 ceo1 突变体和野生型拟
南芥；c 和 d 分别为镉处理后的 c e o 1 突变体和野生型拟南芥。
图 3 CEO1 对镉胁迫下拟南芥幼苗 CAT 和 SOD 活性的影响
Fig.3 The effects of CEO1 on the activities of CAT and SOD in Arabidopsis seedlings under cadmium stress
WT: 野生型拟南芥; ceo1: CEO1 基因的突变体。
4 CEO1对镉胁迫下拟南芥中APX和GR活性的
影响
如图4所示, 镉胁迫下拟南芥野生型与ceo1突
变体中 APX 和 GR 的活性均有显著变化。与处理
前相比, 野生型的 APX 活性明显下降, 直至 2 h 后
才有所回升, 而 ceo1 突变体在处理后 1 h, 其 APX
的活性下降到最低水平, 比处理前下降 96%, 随后
开始回升, 至 2 h 时又下降。虽然两者的酶活性之
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后又均回升, 但仍远远低于处理前的酶活性水平。
从 GR 的酶活性变化来看, 两者的 GR 活性在处理
后 1 h 内都急剧下降, 下降趋势和幅度无明显差
异。从处理后 1 h开始, 突变体中此种酶活性开始
缓慢回升, 至2 h时, 酶的活性也仅为处理前的60%,
之后无明显变化; 而野生型植株的此酶活性于处理
后 2 h 时开始急剧上升, 3 h 后, 酶活性为处理前的
117%。此外, 从图 4 也可以看出, 未作镉胁迫处
理的拟南芥 ceo1突变体中两种酶活性均低于野生
型, 这可能就是镉处理前的ceo1突变体叶片中H2O2
染色比野生型染色深(图 2)的原因。这些结果表
明, 拟南芥植株中APX和GR可能参与对镉胁迫的
应答, 且CEO1基因的缺失不仅导致拟南芥ceo1突
变体幼苗中APX和GR的本底水平下降, 而且镉处
理后二者的活性均有变化, 尤其是对镉胁迫抑制GR
活性的上升更明显。这说明拟南芥 CEO1 基因的
图 4 CEO1 对镉胁迫下拟南芥幼苗的 APX 和 GR 活性的影响
Fig.4 The effects of CEO1 on the activities of APX and GR in Arabidopsis seedlings under cadmium stress
WT: 野生型拟南芥; ceo1: CEO1 基因的突变体。
表达可能调节着镉胁迫下 APX 和 GR 的活性。
参考文献
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