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柑橘叶片中叶黄素循环对 PSII 反应中心 D1 蛋白的保护效应



全 文 :植物生理学通讯 第 46 卷 第 1 期,2010 年 1 月4 2
收稿 2009-07-23 修定  2009-11-23
资助 国家自然科学基金(30 7 71 4 9 7)。
* 通讯作者(E-ma i l : ypgu o@zju .edu .cn; T el : 0 5 7 1 -
8 6 9 7 1 1 2 1 )。
柑橘叶片中叶黄素循环对 PSII反应中心D1蛋白的保护效应
郑洁 1,2, 周慧芳 3, 陈蔚涛 1, 徐建旭 2, 郭延平 2,*
1 上海市柑橘研究所, 上海 201913; 2 浙江大学园艺系, 杭州 310029; 3 浙江省农业厅, 杭州 310020
提要: 用叶黄素循环抑制剂二硫苏糖醇(DTT)处理7 h的柑橘离体叶片, 其非光化学猝灭系数NPQ大幅度下降; 在中等强度光
(500 μmol·m-2·s-1)和高强度光(1 500 μmol·m-2·s-1)下, DTT处理的叶片光化学效率(Fv/Fm)分别下降3.8%和 39.7%, 光合电子传递
速率(ETR)分别下降 12%和 49.5%, D1蛋白含量也分别下降 87%和 92.3%; 黑暗对DTT处理叶片的各种荧光参数和D1蛋白
的影响不大。显示叶黄素循环在保护光系统(PS) II反应中心、抵御光抑制中有一定的积极效应, 可能影响了D1蛋白周转。
关键词: 柑橘; 叶黄素循环; 光系统 II; 叶绿素荧光; D1蛋白; 保护效应
Protective Effect of Xanthophyll Cycle on the D1 Protein of PSII in Leaves of
Citrus reticulate Blanco.
ZHENG Jie1,2, ZHOU Hui-Fang3, CHEN Wei-Tao1, XU Jian-Xu2, GUO Yan-Ping2,*
1Shanghai Citrus Institute, Shanghai 201913, China; 2Department of Horticulture, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;
3Department of Agriculture of Zhejiang Province, Hangzhou 310020, China
Abstract: In this study, NPQ (non-photochemical quenching coefficient) in leaves of Citrus reticulate Blanco.
declined significantly after seven hours with DTT (dithiothreitol) treatment. After DTT treatment, under moder-
ate light of 500 μmol·m-2·s-1, Fv/Fm (photochemical efficiency), ETR (electron transport rate), and the content
of D1 protein in leaves of C. reticulate decreased by 3.8%, 12%, and 87%, respectively. Under high light of
1 500 μmol·m-2·s-1, the corresponding parameters decreased by 39.7%, 49.5%, and 92.3%, respectively. In the
dark, DTT treatment did not have significant effect on the chlorophyll fluorescence parameters and the level of
the D1 protein. This result indicated that xanthophyll cycle played role in protecting PSII against photoinhibition
and might have effect on the D1 protein turnover.
Key words: Citrus reticulate Blanco.; xanthophyll cycle; PSII; chlorophyll fluorescence; D1 protein; protective
effect
一般来说, 在我国南方柑橘种植区夏季常出现
持续高温高光天气, 以致柑橘发生光合作用的光抑
制, 影响柑橘的产量和品质。光抑制的原初作用部
位是 PSII。强光下, 植物吸收的过剩光能必须及
时耗散掉, 否则就会损伤 PSII 反应中心。已有研
究表明, 植物具有多种光保护机制, 如叶黄素循环
(Demmig-Adams 和 Adams 1996)、活性氧清除系
统(Asada 1992)、光呼吸(郭连旺等 1995)等。所
谓叶黄素循环是指叶黄素的3种组成物质通过环氧
化和脱环氧化作用在不同的光照和pH条件下相互
转化的循环机制(Yamamoto 1975)。叶黄素循环在
耗散过剩光能、保护 PSII 免受强光破坏中起重要
作用 , 这在小麦、茶树、银杏、黄瓜、生姜、
杨梅等植物中已有报道(孟庆伟和赵世杰 1998; 韦
朝领等 2000; 张宁等 1999; 孙艳等 2006; 赵世杰等
1999; Guo等2006), 但在柑橘中还未见叶黄素循环
对 D1 蛋白影响的报道。
本文以橘橙类柑橘品种‘象山红’幼苗为试材,
在不同强度光下用叶黄素循环抑制剂DTT处理其
离体叶片后, 测定叶片叶绿素荧光参数和PSII反应
中心D1蛋白含量的变化, 研究叶黄素循环与D1蛋
白的关系。
材料与方法
选取大小和生长状态一致的橘橙品种‘象山红’
(Citrus reticulate Blanco. cv. Xiangshanhong)幼苗10
盆, 从室外移至控温控光的培养室内, 在室温为
(25±2)℃、光照强度为(600±50) μmol·m-2·s-1 (光源
为镝灯, 灯与叶片之间有隔热流动水槽)和光周期为
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12 h 的条件下预培养 30 d。
选取测定叶片, 暗适应 30 min 以上后, 使用
PAM-2000 (Walz, Germany)便携式叶绿素荧光仪, 依
据 Guo 等(2006)的方法测定 Fo、Fm、Fo、Fm、
Fv/Fm、qP 和 NPQ。按公式 ETR =(Fm-Ft)/Fm×
PAR×0.5×0.84 计算(Genty 等 1989)。
叶片的快相荧光诱导动力学参照Lichtenthaler
(1992)和 Govindjee (1995)的方法。经过充分黑暗
的叶片以每点 1 000 μs 的测样速率照射红光(PAR
约为 50 μmol·m-2·s-1, 2 s), 整个过程持续 4 s。为了
使PQ库完全氧化, 在快相荧光诱导动力学测定前,
照射 5 s 的远红光。
将荧光参数相近的 2 个叶片在水中从叶柄处
剪下, 一个叶片插入 10 mmol·L-1的DTT溶液中, 另
一叶片插入蒸馏水中作为对照, 2 个叶片一同置于
PFD 约 20 μmol·m-2·s-1 的弱光下至少 4 h, 然后置于
强光(1 500 μmol·m-2·s-1)、中等光(500 μmol·m-2·s-1)
以及黑暗中处理 7 h, 观察不同处理叶片荧光参数
的变化。
类囊体膜的制备, 参照Russell等(1995)文中方
法提取。称取处理后的叶片 3.0 g, 洗净后除去中
脉。放入研钵中, 加入冰冷的提取液(含 10 mmol·L-1
NaF、50 mmol·L-1 Tricine、100 mmol·L-1 蔗糖、
5 mmol·L-1 MgCl2, pH 7.8), 期间加入少量PMSF, 研
碎, 然后1 157×g离心3~5 min去沉淀, 再用12 857×g
离心 30 min, 去上清液, 在沉淀中加入适量的提取
液保存, 最后所得即为类囊体颗粒。
类囊体膜样品制备好后, 加入样品缓冲液[25
mmol·L-1 Tris-HC1 (pH 6.8), 7%SDS, 10% 甘油, 8
mol·L-1 尿素, 5% 2- 巯基乙醇, 0.1% 溴酚蓝]后离
心。采用 Leammli (1970)文中改进法(在分离胶和
堆积胶中分别加入 8 mol·L-1 和 4.8 mol·L-1 尿素)进
行 SDS-PAGE 电泳。
W e s t e r n - b l o t t i n g 蛋白质印迹分析采用
Yamamoto等(2004)文中方法并加以改进, 每孔上样
量为 5 μg。将凝胶转移印迹至 PVDF 膜后, 与特
异性 D1 蛋白抗体进行反应。最后用 ECL 显色试
剂盒进行显色, 显色后在暗室内曝光, 显影。试验
用的 D1 蛋白一抗为兔抗体, 二抗为辣根过氧化物
酶标记的兔抗体(horseradish peroxidase-conjugated
anti-rabbit antibody)。
结果与讨论
1 DTT对柑橘叶片叶绿素荧光参数及快相动力学
的影响
(1)与中等强度光(500 μmol·m-2·s-1)相比, 高强
度光(1 500 μmol·m-2·s-1)照射柑橘离体叶片 7 h 后,
叶片的光化学效率(F v/Fm)和光合电子传递效率
(ETR)均显著下降, 而黑暗中的变化不明显(图1-a、
b), 表明 500 μmol·m-2·s-1 以上强度的光就可致使柑
橘离体叶片发生光抑制, PSII 反应中心功能下调。
DTT 是叶黄素循环的抑制剂。在中等光强和较高
光强下, DTT处理后的叶片 Fv/Fm 分别比不经DTT
处理的叶片(加H2O)下降 3.8%和 39.7%, ETR分别
下降 12% 和 49.5%。这说明, DTT 处理的离体叶
片受光抑制的程度加剧, 有可能是发生光破坏所
致。
(2)光化学淬灭系数qP反映的是PSII天线色素
吸收的光能用于光化学电子传递的份额, qP变小, 证
明从 PSII 氧化侧向 PSII反应中心的电子流动受到
抑制(王可玢等 1997)。经 DTT 处理后, 中等光强
和高光下的叶片其qP均低于对照叶片(H2O), 高光下
的叶片下降了 25% (图 1-c), 这可能是导致 Fv/Fm
和光合电子传递效率(ETR)下降的主要原因。
(3)依赖叶黄素循环的热耗散是近年来人们经
常关注的一种重要的非辐射能量耗散方式。
Demmig-Adams和Adams (1992)认为与叶黄素有关
的热耗散可能是防御光合机构光破坏的主要途径。
非光化学淬灭系数NPQ反映了PSII天线色素吸收
的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉
的光能部分。用叶黄素循环抑制剂 DTT 处理后,
非光化学淬灭系数 NPQ 大幅下降(图 1-d), 说明
PSII 反应中心依赖于叶黄素循环热耗散途径已被
抑制, 尤其是在中等光强下差异非常明显, 这也进
一步表明叶黄素循环在保护 PSII 反应中心、抵御
光抑制方面发挥着重要作用。在高光下, DTT 处
理的叶片与不经DTT处理的叶片其NPQ差异并不
明显, 说明高光强下叶黄素循环热耗散作用不足以
保护对 PSII 免受强光破坏。
(4) qP 也反映了 PSII原初电子受体 QA 的还原
状态。在线性电子传递过程中, QA- 向QB的光合电
子传递是必不可少的环节。正常情况下, 植物体内
的荧光动力学曲线按时间先后分为 7 个相位: O-I-
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图 1 DTT 对柑橘叶片光化学效率(Fv/Fm)、电子传递效率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)和非化学猝灭系数(NPQ)的影响
Fig.1 Effects of DTT on photochemical efficiency (Fv/Fm), electron transport rate (ETR), photochemical quenching
coefficient (qP) and non-photochemical quenching coefficient (NPQ) in leaves of Citrus reticulata
D-P-S-M-T, 因此该曲线称为 OIDPSMT 曲线。从
荧光动力学快速诱导曲线O相位上升到P相位反映
电子由 PSII反应中心向QA、QB 和 PQ库传递的过
程。(Fi-Fo)/(Fp-Fo)反映具有非还原性 QB 的 PSII 反
应中心(即电子传递从QA-到QB受阻的PSII反应中
心)的比率(Lichtenthaler 1992); I 至 P 反映 PSII 有
活性中心QA的还原, I至P的斜率可以用于估计QA
的还原速率, 即 QA 的活性(Govindjee 1995)。DTT
处理柑橘离体叶片在高光强(1 500 μmol·m-2·s-1)下,
荧光动力学曲线中 P 点均明显下降(图 2), (Fi-Fo)/
(Fp-Fo)值显著升高, 而 Fi 到 Fp 的斜率极显著下降
(表 1)。这说明 DTT 处理后其叶片的 PSII 反应中
心 QB 比例增加, 而 QB- 的比例减少, 即电子传递从
QA- 到QB 受阻, QA 的活性下降。在黑暗中, DTT处
理的柑橘离体叶片, 其荧光动力学曲线变化不明显
(图 2)。我们推测QA- 到QB电子传递受阻可能是导
致 Fv/Fm 下降的原因。
图 2 DTT 对柑橘叶片叶绿素荧光快相
诱导动力学曲线的影响
Fig.2 Effect of DTT on chlorophyll fluorescence
kinetic fast phase in leaves of Citrus reticulata
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2 DTT对柑橘叶片中D1蛋白的影响
较大的叶黄素循环池和较高的叶黄素循环活
性可以防止高光强下菠菜叶片中 D1 蛋白的失活
(Thiele 等 1996)。当水稻叶黄素循环受到抑制时,
qN 下降并导致 D1蛋白更多的降解和 Fv/Fm 的大幅
度下降(季本华和焦德茂 2003)。Ciompi 等(1997)
报道, 叶黄素循环能防止南瓜在臭氧条件下 D1 蛋
白的降解, 对维持 PSII 反应中心的活性有作用。
高强光下, 叶黄素循环突变体的研究表明, 三组分
中的玉米黄质可以调节 D1 蛋白的周转, 保护 PSII
反应中心免遭失活(Jahns 等 2000)。在本研究中,
与黑暗及中等光强下相比, 高光强下的 D1 蛋白含
量急剧下降, 而且中等光强(500 μmol·m-2·s-1)和高
光强(1 500 μmol·m-2·s-1)下, DTT 处理的离体叶片
其 D1 蛋白含量分别比不经 DTT 处理的叶片(加
H2O)下降 87%和92.3%, 黑暗中变化不明显(图3)。
这说明当叶黄素循环受到抑制时, 由于失去叶黄素
循环的保护因而 D1 蛋白被更多的降解。联系到
Fv/Fm、ETR 及 QA 的氧化还原状态, 我们推测光化
学效率的下降也与 D1 蛋白降解有关。
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表 1 DTT 处理后柑橘叶片叶绿素荧光快相诱导动力学参数的变化
Table 1 Change of chlorophyll fluorescence kinetic fast parameters in leaves of Citrus reticulata after DTT treatment
PAR/μmol·m-2·s-1 处理 7 h (Fi-Fo)/(Fp-Fo) Fi 到 Fp 的斜率
0 H2O 0.356±0.002d 1.369±0.07a
0 D T T 0.378±0.002c 1.508±0.11a
500 H2O 0.270±0.002f 0.158±0.006b
500 D T T 0.291±0.003e 0.149±0.012b
1 500 H2O 0.524±0.004b 0.128±0.007b
1 500 D T T 0.543±0.003a 0.020±0.001b
  用 SPSS 数据处理软件分析各处理间的差异, 不同字母表示差异达 P<0.05 显著水平。
图 3 不同光强下 DTT 处理后的柑橘叶中类囊体膜的
SDS-PAGE 电泳图谱及 D1 蛋白含量的变化
Fig.3 Changes of the SDS-PAGE and D1 contents in
thylakoid of Citrus reticulate leaves with DTT treatment
under different light intensity conditions
1: H2O+1 500 μmol·m-2·s-1; 2: DTT+1 500 μmol·m-2·s-1; 3:
DTT+500 μmol·m-2·s-1; 4: H2O+500 μmol·m-2·s-1; 5: H2O+Dark; 6:
D T T + D a r k。
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