全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 191
收稿 2009-11-10 修定 2009-12-23
致谢 本文工作曾得到西南林学院杨斌先生、云南大学生态
学与地植物学研究所苏文华先生和张光飞先生的帮助和
指导。
* 通讯作者(E-mail: Panghx593@sohu.com; Tel: 0871-
5 1 5 9 1 9 0 )。
一种芽孢杆菌促进春兰等种子萌发试验方法初报
庞惠仙 *
昆明市林业科学研究所, 昆明 650223
春兰[Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f.]
(中国科学院植物研究所2006; 和积鉴1990)又称朵
朵香、草兰、山兰等, 本实验用的春兰品种有 ‘黄
花春兰 ’、‘ 宽叶朵香 ’ 和 ‘ 荷瓣春兰 ’ ; 豆瓣兰
[Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f. var. serratum
(Schltr.) Y. S. Wu et S. C. Chen] (和积鉴 1990)即线
叶春兰, 本实验用的豆瓣兰品种是 ‘绿豆瓣 ’; 莲瓣
兰(Cymbidium tortisepalum Fukuyama) (潘光华2006)
又称小雪兰、卑亚兰, 本实验用的莲瓣兰品种有
‘大花莲瓣 ’、‘ 白花莲瓣 ’ 和 ‘ 红莲瓣 ’。上述 3
种植物均为兰属(Cymbidium)植物中的地生种(卢思
聪 2002)。
以通过人工授粉得到的 ‘黄花春兰’ב绿豆瓣’
(组合 1)、‘大花莲瓣 ’ב绿豆瓣 ’(组合 2)、‘宽叶
朵香 ’ב荷瓣春兰 ’(组合 3)、‘白花莲瓣 ’ב红莲瓣 ’
(组合 4) 4种杂交组合、果实生长至八九分成熟、
发育良好的蒴果为材料, 采用无菌播种方法进行处
理, 即: 清理干净蒴果枯残花瓣, 蘸洗衣粉水仔细刷
洗, 自来水下冲洗干净; 超净工作台上用酒精棉球
擦拭消毒, 再浸入 0.1%升汞液中消毒15 min, 无菌
水洗 2遍, 无菌纱布擦干蒴果表面水分; 在灭菌培
养皿里切掉蒴果两头, 沿蒴果脊线切开果壳, 掰开
将种子全部取出, 置于另一培养皿里, 用播种勺充
分拌匀, 最后分别将种子均匀播种于配制好的培养
基中, 各瓶的播种量尽量一致(约 1 500粒), 培养瓶
为 6.5 cm×8.0 cm的罐头瓶。
种子萌发培养基采用 1/2MS+20 g·L-1蔗糖 +1
g·L-1 AC+8 g·L-1琼脂粉固体培养基, pH值5.6, 其中
组合1培养基未加AC; 采用无菌萌发的, 播种后每
瓶滴入适量无菌水, 以润湿种子; 与芽孢杆菌共生
萌发的, 用吸管滴入菌液 10滴, 并向各方倾斜, 促
使菌液均匀分布。其中 1、4 组合播种后随即接
种 Bs芽胞杆菌; 2、3组合在播种一年半后才接种
Bs芽胞杆菌, 即在无菌萌发无效情况下接种 Bs芽
孢杆菌。
芽胞杆菌来源于本单位组培室, 即 2005年初
在观察春兰等种子萌发时偶然发现的: 受一种细菌
感染的 1瓶种子萌发率特别高, 且萌发整齐, 随后
将这瓶带细菌的培养基接种到其他4瓶无菌萌发培
养瓶中进行验证, 种子萌发效果特别好, 萌发率高
出无菌萌发的 10倍以上。后经西南林学院杨斌先
生初步鉴定为一种芽孢杆菌即: Bacillus sp. (以下
简称 Bs芽孢杆菌)。接种用芽胞杆菌在 1/2MS+50
g·L-1马铃薯提取液+20 g·L-1蔗糖(pH值5.6)的液体
培养基中, 常温下培养48 h后置于冰箱中低温保存
待用。
接种后的培养瓶置于温度(23±3) ℃培养室的
培养架上, 不补充光照, 在室内散射光下进行萌发
试验。定期观察种子变化及萌动情况, 及时分批将
肉眼可见萌发小球或小根状茎在超净台上取出, 处
理和转接, 并记录, 直至种子萌发完或确定该瓶种
子不再萌发为止。试验期间, 培养基中水分蒸发后
及时添加无菌水, 得到以下结果(表 1、2)。
(1) 4个杂交组合种子中, 除 4组合外, 其余 3
个组合的种子无菌播种后基本上没有萌发(表 1)。
(2) Bs芽胞杆菌促进春兰杂交种子的萌发, 组
合 2的效果最好, 组合 1和 3的萌发效果也好; 而
组合4的效果相对较差, 接种12个月后其种子才开
始萌发, 但与Bs芽胞杆菌共生萌发时, 杂交种子的
萌发率提高, 种子萌发所需时间缩短(表 2)。
(3)接菌 3 d后, Bs芽胞杆菌就在培养基表面
形成一层雾状膜, 以后细菌逐渐向下扩散; 加入活
性炭的培养基表面可见到灰白色菌膜; 不加活性炭
的培养基表面有一层米汤样菌液, 并随着培养基中
·小方法·
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水分的蒸发, 培养基色泽略显浑浊, 但不能明显分
辨出培养基里有菌还是无菌, 而种子逐渐受细菌侵
染, 呈灰白色湿润状, 一直持续至种子萌发。种子
萌发时, 种胚逐渐膨大呈小颗粒状, 肉眼可见到白
色亮点, 以后由小球逐渐发育成绿色棒状小根状
茎。不同组合种子萌发时的形态不同, 组合 1、组
合 3和组合 4的萌发后呈棒状; 组合 2萌发后多为
球状, 无论何种形态, 最后都发育为分叉的丛状根
状茎。组合 1的种子刚开始萌发时萌发数量较少
(平均每瓶仅有 5粒), 2个月后逐渐增加, 至 6个月
时每瓶 23粒; 10个月的萌发数量最多(每瓶达 200
粒) , 以后萌发数量呈下降趋势。组合 2、3的种
子萌发很整齐、集中, 每次每瓶都能挑出上百个小
球或小根状茎; 组合4的萌发过程与组合1的相似。
表 1 无菌播种萌发情况
组合编号 播种日期(年 -月 -日) 播种数 /瓶 开始萌发时间 /月 萌发总数 /粒 萌发情况
1 07-09-12 1 5 0 无萌发迹象
2 06-10-21 1 0 2 5 2 污染 2瓶, 其余无萌发迹象
3 05-12-07 1 2 2 1 1 污染 3瓶, 其余无萌发迹象
4 05-09-27 1 6 1 9 4 1 萌发仍在陆续进行
种子萌发形成的小球或小根状茎数量为种子萌发数(下同)。
表 2 接种Bs芽胞杆菌后的萌发情况
组合编号 播种日期 接菌日期 接种数 / 开始萌发 萌发总数 / 萌发率 / 萌发情况
(年 -月 -日) (年 -月 -日) 瓶 时间 /月 粒 ·瓶 -1 %
1 07-09-12 07-09-12 5 8 303 20.2 污染 2瓶, 萌发未结束
2 06-10-21 08-08-08 3 6 约 417 27.8 萌发尚未结束
3 05-12-07 07-05-11 3 4 354 23.6 萌发尚未结束
4 05-09-27 05-09-27 3 1 2 138 9.2 已萌发完毕
除组合 4 种子萌发完毕外, 其余 3 个组合的种子萌发尚未结束, 因此这 3 个组合的萌发率不是最终的萌发率。
(4)带菌萌发形成的小根状茎, 经过灭菌后可进
行无菌培养。方法是: 先将带菌根状茎用无菌水涮
洗 2~4次, 去除部分细菌后, 再根据根状茎的大小,
用 0.1%升汞消毒液浸泡 4~8 min, 充分摇晃几次,
最后用无菌水涮洗 5~6次即可。生长势旺盛的杂
交组合也可以带菌培养, 但培养基中不宜添加香
蕉、马铃薯和椰乳。
参考文献
和积鉴(1990). 昆明种子植物要览. 昆明: 云南大学出版社, 654
卢思聪(2002). 兰花栽培入门. 北京: 金盾出版社, 37~67
潘光华(2006). 兰属新宠莲瓣兰. 首届云南省兰文化学术研讨会
文集, 玉溪兰花, 12 (1): 10~11
中国科学院植物研究所主编(2002). 中国高等植物图鉴(第五册).
北京: 科学出版社, 746