全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 9 期，2009 年 9 月 859
收稿 2009-06-16 修定 　2009-07-21
资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)和
河南省杰出人才创新基金(02 21 00 09 0)。
* 通讯作者(E-mail : chenjunying3978@126.com; Tel:
0 37 1-63 5 58 12 6)。
小麦成熟胚脱分化过程中WRKY家族转录因子基因及其下游基因的表达
崔琰, 舒文涛, 赵一丹, 陈新建, 陈军营 *
河南农业大学农学院, 郑州 450002
提要: 用Affymetrix小麦基因芯片研究了小麦成熟胚在MS+2,4-D (2 mg·L-1)培养基上脱分化过程中不同时间点的基因表达
变化, 用NCBI、DATF和DRTF等生物信息学相关网站对基因表达信息进行处理, 并针对WRKY家族转录因子相关基因
的变化情况进行分析的结果表明: WRKY家族中有20个相关基因在脱分化过程中的不同时点至少发生一次上调或下调表
达变化, 变化幅度分别为2~40倍和2~16倍, 其中WRKY6、WRKY18、WRKY33及其下游基因CA692019、CA660172、CA640435
等与小麦成熟胚脱分化过程可能有密切关系。WRKY6在脱分化的全过程中一直呈下降趋势, 推测2,4-D诱导可能导致成熟
胚细胞的抗性下降, 从而有利于脱分化的进行。WRKY33基因可能在脱分化初期的信号转导中有作用。不同物种的组织或
器官脱分化过程中的转录因子基因表达有差异, 说明其脱分化机制的多样性和复杂性。
关键词: 小麦成熟胚; 脱分化; 基因芯片; WRKY家族转录因子基因
Expressions of Transcription Factor Genes in WRKY Family and Their Target
Genes during Dedifferentiation of Mature Wheat (Triticum aestivum L.) Em-
bryos
CUI Yan, SHU Wen-Tao, ZHAO Yi-Dan, CHEN Xin-Jian, CHEN Jun-Ying*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The expression profiles of transcription factor genes in WRKY family and their target genes were
analyzed using Affymetrix wheat GeneChip in this study during dedifferentiation of mature wheat (Triticum
aestivum) embryos which cultured on MS medium supplemented with 2,4-D (2 mg·L-1) at different time points
of 2, 6, 12, 24 and 72 h. The information was processed using bioinformatics tools at NCBI, DATF, and DRTF
websites. The result showed that there were 20 transcription factor genes in WRKY family and their target
genes changed significantly in up- or down-regulation ranged 2–40 or 2–16 times at least one time point in
mature wheat embryos dedifferentiation. According to the known functions of WRKY transcription factors and
their changed trend, it was predicted that these genes, especially, WRKY6, WRKY18 and WRKY33 and their
target genes CA692019, CA660172 and CA640435, might play roles in dedifferentiation of mature wheat embryos.
WRKY6 was down-regulation in dedifferentiation and this indicted that 2,4-D might induce the low tolerance of
mature wheat embryos to the stress of environment and thus facilitate the initial of dedifferentiation and its
proceeding. WRKY33 might play a role in signal transduction in the early dedifferentiation stage. The different
expressions of transcription factor genes in tissue and organ in different species implied the diversity and
complex in dedifferentiation mechanism.
Key words: mature wheat embryos; dedifferentiation; gene microarray; WRKY transcription factor family
WRKY蛋白是植物所特有的一类转录因子家
族 , 因其结构域中的 N 端均含有高度保守的
WRKYGQK 氨基酸序列而得名。它能够与(T)
TGAcc(A/T)序列(W-box)发生特异性作用, 调节启
动子中含 W-box 元件的调节基因或功能基因的表
达, 从而参与植物的各种防卫反应, 调节植物的发
育和代谢。第一个 WRKY 转录因子是由 Ishiguro
和 Nakamura (1994 年)从白薯中克隆得到, 随后在
野燕麦、拟南芥、马铃薯、烟草和水稻中也相
继发现。目前在拟南芥和水稻中分别发现了 74和
97个完整的WRKY成员。已有的证据表明, WRKY
与植物的胁迫响应、种子表皮发育、果实成熟、
蔗糖及赤霉素信号转导等过程关系密切(Rushton等
植物生理学通讯 第 45 卷 第 9 期，2009 年 9 月860
1996; Robatzek和Somssich 2002; Kalde等2003; Kim
和 Zhang 2004; Zheng 等 2006; Oh 等 2006; Liu 等
2006; Journot-Catalino 等 2006; Devaiah 等 2007)。
脱分化(dedifferentiation)是已分化的植物器
官、组织或细胞, 在受到创伤或离体培养时, 细胞
改变原有的分化状态, 重新恢复分裂, 形成愈伤组
织的生物学过程。早在上世纪 50年代就开始研究
植物细胞脱分化, 但由于植物脱分化过程的复杂性
和以前研究技术的局限性, 几十年来对其研究进展
缓慢。而基因芯片技术的应用为脱分化的研究提
供了技术平台。本文采用 Affymetrix 小麦芯片技
术在小麦成熟胚脱分化过程中检测到WRKY家族
及其下游基因的表达也发生变化, 说明该家族成员
在小麦成熟胚脱分化过程中可能也有作用。现报
道如下。
材料与方法
普通小麦(Triticum aestivum L.)品种‘豫麦18’,
由本校小麦遗传育种研究室提供。成熟小麦种子
经 75%的乙醇浸泡 30 s后用 0.1%的HgCl2表面消
毒 15 min, 再用无菌水冲洗 4~5次, 置于含有 2 mg·L-1
2,4-D 的 MS 培养基上培养, 以 0 h 为对照, 分别放
在培养基上诱导 2、6、12、24、7 2 h 后, 取
样并迅速用液氮处理后放到-80 ℃中保存备用。
按 Invitrogen公司的Trizol试剂盒操作程序提
取总RNA。总RNA纯化按QIAGEN公司的RNeasy
Mini试剂盒操作程序进行, 用琼脂糖凝胶电泳(180
V, 0.5 h)检测总RNA的 28S和 18S比例, 以评估总
RNA的完整性; 在波长260 nm处测定总RNA的含
量, 利用 260 nm与 280 nm吸光值的比值检测RNA
的纯度。
cDNA、cRNA合成按 Affymetrix 公司试剂盒
方法进行。合成 cDNA 时, 模板量为 1~8 μg 总
RNA。合成生物素标记的 cRNA 时, 取 12 μL 上
述 cDNA 溶液作模板。cDNA、cRNA 纯化按基
因芯片分析样品纯化操作程序进行。两者的浓
度、纯度和质量检测方法同上。
cRNA片段化和芯片杂交扫描检测时, 取15 μL
浓度为 1 μg·μL-1 的 cRNA, 加 6 μL 5× 片段化缓冲
液, 加入 9 μL 无 RNA 酶水混匀后放入 94 ℃温浴
中 35 min, 得到长度为 35~200 bp 的 cRNA 片段。
按 Affymetrix公司提供的配方配制杂交液, 然后将
杂交液加至经预杂交处理的 Affymetrix 小麦芯片
中, 于 45 ℃、转速为 60 r·min-1 的摇床上杂交 16 h,
吸去杂交液, 用 GeneChip 全自动洗涤工作站 450
(Affymetrix 公司)洗涤和染色芯片。用高分辨芯片
扫描仪 3000 (Affymetrix 公司)扫描芯片, 获得基因
表达信号值。
数据分析用GCOS1.2软件读取、处理信号值
数据, 获得归一化后的信号值、信号检出(P, A, M)
以及实验和对照组的比值。为减少芯片分析误差,
用 Affymetrix wheat GeneChip® 对每个时点脱分化
重复检测 2 次, 将 2 次检测的平均值视为矫正值。
以不同时点的荧光信号值除以0 h荧光信号值并取
以2为底的对数, 对数值≤-1或≥1为有意义下调
或上调差异表达, 其他视为表达差异不显著。
确认脱分化相关基因时, 将查出WRKY家族转
录因子名称分别输入 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.
gov)、DATF (www.datf.cbi.pku.edu.cn)和 DRTF
(www.drtf.cbi.pku.edu.cn)等网站找出它们在拟南
芥和水稻等植物中的下游基因, 然后查阅相关文献
资料对上述基因进行再确认。最后在芯片数据中
挑出这些基因, 对其数据进行分析。
半定量 RT-PCR 扩增时, 将 RNA 反转录成
cDNA, 以肌动蛋白(β-actin)为内参, 对基因WRKY2
及 CA744619 进行 PCR 检测。PCR 条件为: 94 ℃
预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃
延伸 30 s, 40 个循环; 72 ℃延伸 5 min。4 ℃保存。
其他2个待测基因的PCR条件除退火温度与内参的
不同外(表 1), 其他均保持一致。
实验结果
1 WRKY家族转录因子基因在脱分化过程中的表
达动态
在 Affymetrix 小麦基因芯片实验中, 检测到
WRKY家族基因有7个, 其下游基因28个, 这35个
基因中, 有20个基因至少在脱分化过程中一个时点
发生有意义的表达变化; 其中, 有 6 个基因表达上
调, 5个基因表达下调, 还有9个基因在不同时间点
分别表达上调或下调; 其上调和下调范围分别为
2~40 倍和 1~16 倍(表 2)。推测这些基因在脱分化
过程中可能发生了剧烈的变化。
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2 WRKY家族转录因子基因和它们的下游基因在
脱分化过程中的表达
根据WRKY家族转录因子对下游基因调节情
况将上述 20 个基因分为 6 类: (1) WRKY2在 2、6、
72 h 时间点表达上调; WRKY3 在 12 h 时间点表达
下调; 其下游基因CA642823在 0~72 h都表达上调
(图 1-a), 从其表达趋势可以推测在脱分化过程中
WRKY2对CA646823正调控而WRKY3对CA646823
进行负调控。(2) WRKY18 在 2、24、72 h 时间
点表达上调, 在 6 和 12 h 表达下调; 其下游基因
CA692019、BJ287603 和 AF384143.1 在 6~72 h都
表现为上调, 而在 2 h 时间点表达下调, 推测在脱
分化过程中 WRKY18 可能正调控 CA692 019、
BJ287603 和 AF384143.1 (图 1-b)。(3) WRKY6 与
其下游基因CA729979和CA744619在所有时间点
都表达下调(图 1-c)。推测在脱分化过程中WRKY6
正调控 CA729979 和 CA744619, WRKY6 可能是脱
分化过程中一个正调节因子。(4) WRKY27 对其下
游基因 C A6 6 0 17 2 起负调控作用(图 1 -d)。( 5 )
WRKY33 对其下游基因 CA679714 和 CA662794,
WRKY53 对其下游基因 CD875153 (除 12 h 时间点
外)、CA640435、CK192992 分别起正调控作用
表 1 用于半定量 RT-PCR 分析的基因引物序列、退火温度和扩增产物
Table 1 The primer sequence, annealing temperature and product size of genes analyzed by semi-quantity RT-PCR
引物(5 → 3)
基因 ID 号 退火温度 /℃ 扩增产物 /bp
上游引物 下游引物
β-actin GTTCCAATCTATGAGGGATAC GAACCTCCACTGAGAACAACA 5 5 421
WRKY2 GGTAAGAAGCCACCAGAG GAAGCTAACCCAACAACA 5 4 204
CA744619 CATTGACATCCTTGAGCAG CATTGTAGGGGTCTCATTTA 5 2 295
表 2 7 个 WRKY 家族转录因子基因及其下游基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达
Table 2 Expression profile of 7 WRKY family transcription factor genes and their target genes during
dedifferentiation of mature wheat embryos
GenBank 登录号 0 h 2 h 6 h 12 h 24 h 72 h 基因描述
BJ286829 0 1.1 1.2 0.7 0.7 1.2 WRKY 家族转录因子 2 (WRKY2)
CK207466 0 -0.6 -0.9 -1.7 -0.9 -0.2 WRKY 家族转录因子 3 (WRKY3)
CA623872 0 -0.2 -1.0 -0.8 -0.4 -0.5 WRKY 家族转录因子 6 (WRKY6)
CK203728 0 1.7 -0.3 -1.1 1.3 2.4 WRKY 家族转录因子 18 (WRKY18)
BQ605592 0 -3.2 -0.3 -3.0 -4.0 -0.6 WRKY 家族转录因子 27 (WRKY27)
CD454906 0 1.1 0.5 0.2 1.6 0.5 WRKY 家族转录因子 33 (WRKY33)
BQ838257 0 0.05 -1.0 0.5 2.2 3.8 WRKY 家族转录因子 53 (WRKY53)
CA642823 0 1.9 1.6 2.4 2.3 0.6 病原相关蛋白 1-3 (PRB1-3)
BJ287603 0 -1.6 0.02 1.7 1.7 3.9 病原相关蛋白 1 (PR1)
AF384143.1 0 -2.5 -0.4 1.9 0.4 5.3 病原相关蛋白 1 (PR1)
CA692019 0 -0.8 0.4 1.5 2.9 2.5 病原相关蛋白 1 (PR1)
CA744619 0 -1.3 -2.7 -2.5 -2.2 -1.0 NPR1 基因 (NPR1)
CA729979 0 -2.2 -3.4 -3.1 -3.4 -1.3 NPR1 基因 (NPR1)
CK212409 0 0.1 -1.3 0.7 1.9 1.9 GH3 生长素响应蛋白 (DFL-1)
CA660172 0 1.1 2.8 3.8 0.2 3.7 GH3 生长素响应蛋白 (DFL-1)
CD875153 0 -1.0 -0.8 -1.9 2.8 4.3 衰老特异性半胱氨酸蛋白酶 12 (SAG12)
CA679714 0 1.3 0.9 0.5 0.2 0.8 裂源有丝蛋白激酶 4 (MPK4)
CA662794 0 1.3 1.3 1.0 0.9 0.8 裂源有丝蛋白激酶 4 (MPK4)
CA640435 0 1.8 -1.0 1.07 0.8 3.0 衰老特异性半胱氨酸蛋白酶 12 (SAG12)
CK192992 0 -1.7 2.0 3.4 4.4 2.7 衰老特异性半胱氨酸蛋白酶 12 (SAG12)
　　粗体和下画线标示的数字分别表示有意义上调和下调。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 9 期，2009 年 9 月862
(图 1 - e、f )。
3 目的基因在脱分化过程中表达的半定量RT-PCR
检测
为了检测基因芯片数据的可靠性, 对 WRKY2
和CA744619两个基因作半定量RT-PCR检测(图2)
表明, 该结果与芯片检测结果基本一致, 说明芯片
结果正确可靠。
讨　　论
Oh等(2006)研究辣椒中WRKY2及PR1的结果
表明, 在创伤处理 3 h 内, WRKY2 表现为上调, 3 h
后表达下调; 其下游基因 PR1 在处理后 0~1.5 h、
6~24 h表达上调, 1.5~6 h表达下调, 我们芯片的结
果与其基本上一致, 由此推测本文中小麦成熟胚离
体培养可能会导致成熟胚组织的创伤, 从而启动了
WRKY2、WRKY3和WRKY18共同调节的水杨酸代
谢途径, 表明小麦成熟胚脱分化可能也与胁迫响应
类似。WRKY6调控的NPR1基因是调控植物抗性
的关键基因(Robatzek和Somssich 2002), 本文结果
表明, WRKY6 在脱分化的全过程中一直呈下降趋
图 1 WRKY 家族转录因子及其下游基因在小麦成熟胚脱分化过程中的动态表达
Fig.1 Dynamic expression of WRKY transcription factor family genes and their target genes during
dedifferentiation of mature wheat embryos
植物生理学通讯 第 45 卷 第 9 期，2009 年 9 月 863
势, 其下游基因CA729979和CA744619都明显呈下
调趋势, 推测 2,4-D 的效应可能会导致成熟胚细胞
的抗性下降, 从而有利于脱分化的进行。
Nakazawa (2001)的研究表明, DFL-1 基因与
植物激素信号传递相关, 本文结果显示, WRKY27在
脱分化过程中的表达变化可能会影响 DFL-1 基因
的表达, 从而影响脱分化过程。Andreasson 等
(2005)的研究表明, WRKY33与MPK4在信号转导
途径中相互协调, 相互促进。从本文结果也可以看
到, 在0~2 h它们呈明显的快速上调趋势, 而在2~12
h的响应期间呈明显的下调趋势, 在 12 h以后的脱
分化过程中它们的表达变化比较复杂, 说明其可能
还有其他转录因子对其进行调控, 这种调控作用大
于 WRKY33对它的调控。由此可以推测WRKY33
基因可能在脱分化初期的信号转导中起作用。
从上述分析中可以看到, PR1和NPR1在脱分
化过程中的表达相反, 与PR1相似的基因在脱分化
过程中主要表现为上调, 而在芯片中与 NPR1相似
的基因主要表现为下调。这与 Che 等(2006)在拟
南芥根愈伤组织诱导过程的结果有所不同。Che
等(2006)曾观察到, PR1 在形成愈伤组织过程中主
要表现为下调, NPR1 在愈伤组织形成过程的前半
期下调而后半期则上调。这表明愈伤组织的形成
过程很复杂, 可能还有大量的转录因子对它们进行
调控。WRKY27 负调控的一个下游基因激素响应
GH3蛋白在脱分化过程中各个时点与0 h都表现为
上调, 而Che等在拟南芥的研究表明在脱分化的全
过程都为下调。据此可以推测, 不同物种的组织或
图 2 基因芯片检测与 RT-PCR 检测结果比较
Fig.2 The result comparison of gene chip and RT-PCR
器官脱分化过程有很大的差异, 其脱分化的途径可
能完全不同。
参考文献
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