全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (10): 1757~1763　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0326 1757
收稿 2015-06-19　　修定 2015-09-02
资助 国家自然科学基金(31372105)、中医药行业科研专项子课题(201407005-08)、中国博士后科学基金(2011M500457)、中央高校基
本科研业务费专项资金(2011JS076)、河南省高校科技创新团队支持计划基金(15IRTSTHN020)和河南省创新型科技人才队伍建
设工程基金(C20130037)。
* 共同通讯作者(E-mail: zhaoxt0411@126.com, Tel: 18237391085; E-mail:limingjun2002@263.net, Tel: 13613731041)。
番茄不孕病毒(TAV)脱除对‘怀白菊’活性氧代谢的影响
赵喜亭1,2,3,*, 田莹1, 周颖媛1, 范子建1, 朱玉婷1, 蒋丽微1, 李明军1,2,3,*
1 河南师范大学生命科学学院, 河南新乡453007; 2绿色药材生物技术河南省工程实验室, 河南新乡453007; 3河南省高校道地
中药材保育及利用工程技术研究中心, 河南新乡453007
摘要: 以前期获得的脱除番茄不孕病毒(TAV)的‘怀白菊’试管苗为试材, 从同工酶谱和DNA分子简单序列间重复(ISSR)多态
性方面分析其遗传稳定性, 在此基础上, 对其继代培养过程中叶片中的活性氧代谢进行了研究。结果表明, TAV脱除没有改
变‘怀白菊’叶片中SOD、POD同工酶谱带及ISSR扩增条带的数目, 但相应同工酶谱带亮度增强; 也没有改变‘怀白菊’试管
苗继代培养过程中膜脂过氧化相关指标(O2¯·生成速率及H2O2和MDA含量)和保护系统相关指标(保护酶SOD、POD、CAT、
APX和GR, 抗氧化物质GSH和AsA)的变化趋势, 但却显著降低了相同时间点膜脂过氧化相关指标的绝对值, 降幅最大值超
过30% (O2¯·生成速率、MDA含量), 显著增加了保护酶活性及抗氧化物质的含量, 增幅最大值超过了50% (APX活力、GSH
含量)。以上说明, TAV脱除不仅没有改变‘怀白菊’的遗传稳定性, 而且降低了其活性氧代谢水平, 提高了其抗氧化能力。
关键词: ‘怀白菊’; 番茄不孕病毒; 脱毒; 遗传稳定性; 活性氧代谢
Effect of TAV-Free on Active Oxygen Metabolism of Chrysanthemum morifolium
‘Huaibai’
ZHAO Xi-Ting1,2,3,*, TIAN Ying1, ZHOU Ying-Yuan1, FAN Zi-Jian1, ZHU Yu-Ting1, JIANG Li-Wei1, LI Ming-Jun1,2,3,*
1College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China; 2Engineering Laboratory of Biotechnology
for Green Medicinal Plant of Henan Province, Xinxiang, Henan 453007, China; 3Engineering Technology Research Center of
Nursing and Utilization of Genuine Chinese Crude Drugs, University of Henan Province, Xinxiang, Henan 453007, China
Abstract: Tomato aspermy virus (TAV)-free Chrysanthemum morifolium ‘Huaibai’ test-tube plantlets were
used as experimental materials. In this study, genetic stability of TAV-free ‘Huaibai’ test-tube plantlets was ana-
lyzed from isozyme zymogram and DNA molecular ISSR polymorphism. Based on this, active oxygen metabo-
lism of TAV-free ‘Huaibai’ plantlets had been studied during subculture. The results showed that: TAV-free
didn’t change the number of SOD isozyme and POD isozyme bands but the band brightness were brighter than
the virus-carrying plantlets, and also didn’t change the number and brightness of ISSR amplification bands. So
TAV-free maintained its genetic stability and increased the activities of SOD and POD. TAV-free also didn’t
change the trend of lipid peroxidation related indexes (O2¯· produce rate, the MDA and H2O2 contents) and pro-
tection system related indexes (protective enzymes SOD, POD, CAT, APX and GR activities; antioxidants GSH
and AsA contents) during subculture, but significantly reduced the absolute value of lipid peroxidation related
indexes and significantly increased activities of protective enzyme and the contents of antioxidants at the same
time of subculture. The maximum decrease of more than 30% (O2¯· produce rate and MDA content) and the max-
imum increase of more than 50% (APX activity and GSH content) were gotten in the leaves of TAV-free plant-
lets. In conclusion, TAV-free didn’t only change genetic stability of Chrysanthemum morifolium ‘Huaibai’, but
also reduced the active oxygen metabolism and improved its antioxidant capacity.
Key words: Chrysanthemum morifolium ‘Huaibai’; tomato aspermy virus; virus-free; genetic stability; active
oxygen metabolism
植物生理学报1758
怀菊花属于菊科(Asteraceae)菊属(Chrysan-
themum L.)多年生草本植物, 因产于古怀庆府(今河
南省焦作市辖区)一带而得名, 是著名的“四大怀
药”之一, 具有极高的药用价值。怀菊花具有上千
年栽培历史, 但其栽培上多采用扦插、分株等无
性繁殖方式, 常常连作, 因此菊花的病毒感染较为
严重。菊花受到病毒感染后, 其株型、花色、叶
色均会受到影响, 进而使其种质退化, 产量降低,
品质下降(雷强等2013; 杨鹏辉等2011; Kondo等
2011; 楼望淮2012)。茎尖脱毒技术是一种有效的
脱除菊花病毒的方法。研究表明, 病毒脱除能够
有效改善作物农艺性状及生理生化特性, 提高脱
毒苗的产量、品质以及抗性(赵霜等2013; 代丽萍
2009; 王丽花等2012; 李松等2010; 薛建平等
2004)。目前, 活性氧代谢的研究主要集中在高温
胁迫(李秀等2014)、低温胁迫(王玲丽等2014; 刘
玉凤等2011)、肉桂酸胁迫(乔永旭等2015)等逆境
对其的影响, 但病毒脱除对怀菊花品种‘怀白菊’
(Chrysanthemum morifolium ‘Huaibai’)叶片活性氧
代谢的影响鲜有报道。前期研究发现‘怀白菊’感
染的主要病毒是番茄不孕病毒(tomato aspermy vi-
rus, TAV), 弄清了它的结构和全核苷酸序列(Zhao
等2015), 并采用茎尖结合热处理脱除了TAV。本
研究以前期获得的脱除TAV的‘怀白菊’试管苗为
试材 , 从同工酶谱和DNA分子简单序列间重复
(ISSR)多态性方面分析脱毒试管苗遗传稳定性后,
对其继代培养过程中叶片中的活性氧代谢进行研
究。旨在探索TAV脱除对‘怀白菊’试管苗生长过
程中叶片活性氧代谢水平的影响, 为‘怀白菊’脱毒
苗的大田推广应用提供理论依据。
材料与方法
1 实验材料
供试材料为脱除TAV的怀菊花品种‘怀白菊’
(Chrysanthemum morifolium Ramat. ‘Huaibai’)试管
苗, 来自绿色药材生物技术河南省工程实验室(河
南师范大学生命科学学院)。
2 方法
2.1 脱毒苗的遗传稳定性分析
从同工酶谱和DNA分子简单序列间重复(inter-
simple sequence repeat, ISSR)多态性两个方面进行
脱毒苗的遗传稳定性分析。
同工酶谱分析包括超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD),
参照宋萍萍(2010)的方法, 用不连续聚丙烯酰胺凝
胶电泳系统。SOD同工酶谱染色采用罗广华和王
爱国(1983)的方法, POD同工酶染色参照何忠效和
张树政(1999)的方法。ISSR多态性分析采用Ghis-
lain等(2004)的方法, 鉴于本实验室前期研究结果
(Zhao等2015), 本研究用ISSR05 (5′-ACACACA-
CACACACACAT-3′)作为ISSR扩增的引物。
2.2 活性氧代谢相关指标的测定
从脱毒试管苗继代培养第22天开始, 取顶端
完全展开第二、三片叶片测定其活性氧代谢相关
指标, 每隔8 d测定一次, 每个指标测定样本数为3,
共测定5次。
丙二醛(malon-dialdehyde, MDA)含量测定参照
张志良和翟伟菁(2003)的TBA法, 过氧化氢(H2O2)含
量、O2¯·生成速率、SOD、POD活性测定参照宋萍
萍(2010)文献, 过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血
酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)和谷胱甘
肽还原酶(glutathione reductase, GR)活力参照邵换娟
(2013)文献, 谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量的测
定参照Boyne和Ellman (1972)的方法, 抗坏血酸
(ascorbic acid, AsA)含量的测定参照Tonamura (1978)
的方法。
3 数据处理
实验数据采用Excel 2010、SPSS 13.0统计软
件进行整理分析, 其中不同小写字母表示在P<0.05
水平上达到显著差异。
实验结果
1 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗遗传稳定性的影响
本文对TAV脱除后的试管苗进行了SOD和
POD电泳酶谱和ISSR多态性分析, 结果如图1所
示。从图1可以看出, 与非脱毒苗相比, 脱毒苗叶
片中SOD和POD同工酶谱条带数没有改变, 均为7
条, 但后者条带亮度增强, 这说明TAV脱除没有改
变‘怀白菊’的SOD和POD同工酶谱的遗传稳定性,
但提高了其活性(图1-A和B)。ISSR多态性分析显
示, TAV脱除与否ISSR05扩增条带数均为9, 且二者
条带亮度相同, 这说明TAV脱除保持了‘怀白菊’试管
苗DNA分子水平的遗传稳定性(图1-C)。综合分析
显示, TAV脱除没有改变‘怀白菊’的遗传稳定性。
赵喜亭等: 番茄不孕病毒(TAV)脱除对‘怀白菊’活性氧代谢的影响 1759
2 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗活性氧代谢的影响
2.1 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗膜脂过氧化相关指
标的影响
如图2所示, 在继代培养过程中, ‘怀白菊’试管
苗叶片中MDA和H2O2含量、O2¯·生成速率变化趋
势相同, 均随培养时间的增加而升高。与对照相
比, TAV脱除显著降低了MDA和H2O2含量及O2¯·
生成速率, MDA含量降幅最高可达33.54% (54 d)
(图2-A), H2O2含量降幅最高可达20.84% (46 d) (图
2-B), O2¯·生成速率最高降幅为32.10% (46 d) (图
2-C)。说明TAV脱除降低了‘怀白菊’活性氧自由基
水平, 进而降低了膜脂过氧化程度。
2.2 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗保护酶活性的影响
本文对脱除TAV的试管苗叶片保护酶活性进
行了测定, 发现在继代培养过程中, ‘怀白菊’试管
苗叶片中SOD、POD、CAT、APX和GR活性变化
趋势相同, 均随培养时间的增加呈现出先升高后
降低的趋势, 至培养第46天各项指标均达到最大
值。TAV脱除显著提高了5种保护酶的活性, SOD、
POD、CAT、APX和GR活性提高的最大幅度分别
为21.05% (46 d)、45.31% (38 d)、27.07% (22 d)、
57.08% (30 d)和16.19% (22 d) (图3)。SOD的增幅
最大值出现在继代培养46 d (图3-A), 这和O2¯·生成
速率最高降幅出现的时间相吻合(图2-C)。说明
TAV脱除提高了‘怀白菊’活性氧自由基清除能力。
图1 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗遗传稳定性的影响
Fig.1 Effect of TAV-free on genetic stability of C. morifolium ‘Huaibai’ test-tube plantlets
A: SOD同工酶谱; B: POD同工酶谱; C: ISSR多态性分析, 引物为ISSR05。
植物生理学报1760
2.3 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗抗氧化物质的影响
如图4所示, 在继代培养过程中, ‘怀白菊’试管
苗叶片中GSH、AsA含量变化趋势相同, 均随培养
时间的增加呈现出先升高后降低的趋势, 至培养
第46天各项指标均达到最大值, 与保护酶GR和
APX变化趋势一致(图3-D和E)。TAV脱除显著提
高了GSH和AsA含量, GSH含量增幅最大达50.14%
(54 d) (图4-A)，AsA含量增幅最大达24.91% (54 d)
(图4-B)。
讨　　论
正常情况下, 植物细胞内活性氧产生与清除
总是处于动态平衡, 且维持在较低水平。植物一
旦受到病毒感染后, 其自身生理生化代谢受到影
响, 这种动态平衡就会被打破, 导致活性氧自由基
(O2¯·、H2O2)积累而使膜脂过氧化水平增高 , 即
MDA含量增加, 使膜系统损伤及细胞氧化, 加速植
物衰老和死亡。MDA作为膜脂过氧化作用的产
物, 具有很强的细胞毒性, 含量高低可反映出膜脂
过氧化的水平, 与细胞膜的损害程度直接相关(Mi-
nami等2005)。研究表明植物脱除病毒后, 其O2¯·产
生速率、H2O2 和MDA含量降低, 即脱毒降低了膜
脂过氧程度。香石竹在经过脱毒处理后MDA含量
降幅最高达27.49% (王丽花等2012)。在整个生长
期脱毒骏枣幼树叶片O2¯·、H2O2、MDA含量均显著
低于对照(刘和等2006)。感染甜菜坏死黄脉病毒
病的甜菜MDA含量和H2O2含量显著高于抗病品种
(陈贵华等2011)。这均与本实验结果一致, 本研究
中, ‘怀白菊’脱除TAV病毒后, 其MDA含量、H2O2
含量和O2¯·生成速率在继代培养过程中均显著低于
非脱毒苗, 三者降低最大幅度值分别为33.54% (54
d)、20.84% (46 d)和32.10% (46 d)。说明TAV脱除
能够有效的减少活性氧自由基O2¯·和H2O2的积累,
进而降低MDA含量(图2)。
SOD、POD、CAT、APX和GR是膜的保护酶
系统, 在清除活性氧、抑制膜脂过氧化、维持膜
系统的稳定性中起重要作用(Wang等2000)。保护
酶活性的变化是衡量植物抗性强弱的重要生理指
标。SOD作为抵御活性氧伤害的第一道防线, 将
生物体内的O2¯·歧化成H2O2, 而CAT和POD将H2O2
转化为对生物体无害的水分子。当CAT不足时, 叶
绿体中H2O2主要依赖AsA-GSH循环系统来清除。
APX作为叶绿体中AsA-GSH循环的关键酶, 是植
物和藻类特有的清除H2O2的重要酶类, 而GR是植
图2 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗MDA和H2O2含量及O2¯·产生速率的影响
Fig.2 Effect of TAV-free on MDA and H2O2 contents, and O2¯· produce rate of C. morifolium ‘Huaibai’ test-tube plantlets
不同小写字母表示同一培养时间点上TAV脱除试管苗与对照在P<0.05水平上达到显著差异。下同。
赵喜亭等: 番茄不孕病毒(TAV)脱除对‘怀白菊’活性氧代谢的影响 1761
物细胞AsA-GSH循环中将GSSG还原为GSH的关
键酶, 主要通过GSH起到清除活性氧的作用, GR活
性与GSH含量密切相关(吴锦程等2009; 刘玉凤等
2011)。研究发现植物脱除病毒后, 保护酶活性会
不同程度的提高。吴玉霞(2008)在对苹果脱毒试
管苗和普通试管苗生理生化特性比较研究中发现
‘华红’、‘粉红佳人’和‘烟富1号’脱毒苗叶片的
SOD、POD、CAT三种酶活性均比普通苗高。乔
芬(2010)研究发现较非脱毒株系, 脱毒柑橘的SOD
活性、POD活性显著增强。蔡蕊(2013)在研究脱
毒处理对紫色甘薯抗氧化酶的影响时发现脱除病
毒后SOD、POD活性均显著大于对照。这均与本
实验结果一致(图3-A、B和C)。本研究还发现,
TAV脱除后, 也提高了AsA-GSH循环系统的APX
和GR活性(图3-D和E), 其中APX活性最大增幅为
57.08% (30 d), GR活性最大增幅为16.19% (22 d),
对整个保护酶系统均有显著的改善作用。
抗氧化物质GSH和AsA与抗氧化酶APX和GR
图3 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗SOD、POD、CAT、APX和GR活性的影响
Fig.3 Effect of TAV-free on SOD, POD, CAT, APX and GR activities of C. morifolium ‘Huaibai’ test-tube plantlets
植物生理学报1762
等酶组成植物叶绿体AsA-GSH循环中的抗氧化防
御系统 , 在清除活性氧方面起重要作用(Asada
1999; Noctor和Foyer 1998)。AsA在APX作用下与
H2O2反应, GSH是GR催化反应的产物, 参与或直接
清除胞内活性氧自由基。本研究中, TAV脱除与
否, 试管苗中GSH、AsA含量在整个继代培养过程
中呈现出先升高后降低的趋势, 至第46天时达到
最大值, 这与保护酶APX和GR变化趋势一致(图
3-D和E)。在整个继代培养过程中脱毒苗GSH、
AsA含量均显著高于非脱毒苗, 二者增幅最高可达
50.14% (54 d)和24.91% (54 d) (图4-A和B)。说明
在相同条件下脱除TAV病毒的‘怀白菊’苗表现出
更强的抗氧化性, 即有更强的活性氧自由基清除
能力。
总之, 活性氧代谢是否能够引起氧化损伤, 致
使膜脂过氧化作用取决于活性氧产生与清除之间
的平衡, 而有效清除活性氧需要整个防御系统即
保护酶系统和抗氧化物质的协调作用(Sharma等
2012)。本研究中TAV的脱除显著降低了相同时间
点‘怀白菊’叶片O2¯·产生速率、H2O2和MDA含量(图
2), 显著提高了保护酶系统SOD、POD、CAT、
APX和GR活性(图3)以及抗氧化物质GSH和ASA
含量(图4), 说明TAV脱除能够有效降低‘怀白菊’活
性氧代谢水平, 提高其抗氧化能力。
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图4 TAV脱除对‘怀白菊’试管苗GSH和AsA含量的影响
Fig.4 Effect of TAV-free on GSH and AsA contents of C. morifolium ‘Huaibai’ test-tube plantlets
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