全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 439~446　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0417 439
收稿 2013-11-18　　修定 2014-02-27
资助 中国烟草总公司贵州省公司科技计划项目“基因组学指导的烟草定向突变育种新技术研究及应用” (201201)、中国烟草总公司贵
州省公司科技项目“抗TMV、富钾转基因烟草育种研究” (合同号200910)和贵州省科学技术基金“去甲基烟碱生物合成调控分子
机制研究” (黔科合J字[2011]2161)。
* 同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: dgzhao@gzu.edu.cn; Tel: 0851-3863615)。
超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性
秦利军1,2,3,*, 孙洪荣2,3,4,*, 赵丹2,3,4,*, 赵杰宏5, 赵德刚1,2,3,4,**
贵州大学1绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 2贵州省农业生物工程重点实验室, 3山地植物资源保护与种
质创新省部共建教育部重点实验室, 4生命科学学院, 贵阳550025; 5贵州省烟草科学研究院行业烟草分子遗传重点实验室,
贵阳550081
摘要: 利用农杆菌介导的遗传转化法将含有普通烟草Ubi.U4启动子驱动NrCN基因表达的元件导入TMV敏感烟草品种K326
中, 对筛选鉴定出的T0代转基因植株接种TMV, 测定其接种前后不同时期的理化指标, 以接种TMV的野生型植株为对照。
结果显示, 转基因植株和野生型植株接种TMV前叶绿素(Chl)和MDA含量及SOD、POD和CAT酶活力均无显著差异, 但接
种TMV后野生型植株Chl含量逐渐降低, 转基因植株Chl含量先增后降, 在接种TMV后5 d时转基因植株叶片Chl含量显著高
于野生型植株。接种前期(0~3 d)转基因植株MDA含量略低于野生型植株, 但差异不显著; 但接种后期(3~5 d)前者的MDA
含量显著低于后者。接种TMV后转基因植株中SOD、POD及CAT酶活性变化幅度较野生型植株高, 以CAT的变幅最为显
著。另外, Real-time PCR分析结果表明, 接种TMV后3 d时转基因植株MAPK、PR-1a及NrCN表达量均显著高于野生型植
株。以上结果表明, 通过转基因技术提高烟草抗病基因NrCN的表达量, 能提高防御酶活性及病程相关基因的表达量, 从而
延缓植株感染TMV的发病时间, 增强敏感植株对TMV的抗性。
关键词: TMV抗性; NrCN; 防御酶活性; 烟草
Overexpression of NrCN Gene Improved the TMV Resistance in Nicotiana ta-
bacum L.
QIN Li-Jun1,2,3,*, SUN Hong-Rong2,3,4,*, ZHAO Dan2,3,4,*, ZHAO Jie-Hong5, ZHAO De-Gang1,2,3,4,**
1The State Key Lab of Green Pesticide and Agricultural Biological Engineering, 2 Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering, 3 Key
Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region, Ministry of Education, 4 College
of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 5 The Key Laboratory of Molecular-Genetics on Industrial Tobacco,
Research Institution of Tobacco Sciences in Guizhou Province, Guiyang 550081, China
Abstract: In this study, we transferred TMV-resistance NrCN gene drived by the Nicotiana tabacum Ubi.U4
promoter into TMV-sensitive tobacco variety K326 by using the Agrobacterium-mediated transformation meth-
od. The content of chlorophyll (Chl) and malonaldehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase
(SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) were determinated after part of transgenic tobacco plants were
inoculated with TMV. There was no significant difference among these physiological indexes between the trans-
genic and wild-type plants before inoculating the virus. However, the chlorophyll content became to decline in
the transgenic plants and the wild-type plants after TMV-inoculation executed and the decreasing extent was so
higher in the wild-type than the transgenic. Compared with the variable range of the chlorophyll content, the
change of MDA content was more significant in the transgenic plants than the wild-type. In addition, the en-
zyme activity of SOD, POD and CAT was analyzed among these TMV-inoculated plants. We found that there
was a significant difference in enzyme activity of SOD and POD between the transgenic and wild-type tobacco
plants after inoculation. Real-time PCR was executed to study the expression level of some pathogenesis-re-
sponded genes, which concluded the mitogen-activated protein kinase (MAPK) gene MAPK, pathogenesis-re-
植物生理学报440
lated proteins (PR) gene PR-1a and TMV-resistance N-like protein (CN) gene NrCN. The results showed that
MAPK gene expression level in transgenic plants TMV-inoculated was nearly 3 folds than that in wild-type,
while it was 2 folds than transgenic plants inoculated-H2O. The highest expression level of NrCN gene was
found in transgenic plants inoculated with TMV, which was about 9 folds higher than the wild-type and 4 folds
highe than the transgenic inoculated with H2O. The research results suggested that the over-expression of NrCN
gene improved the disease-resistance ability in transgenic tobacco plants.
Key words: TMV-resistance; NrCN gene; defense enzymes; Nicotiana tabacum
烟草花叶病毒病是烟草中最广泛存在的病毒
病害之一, 几乎在所有烟草栽培的国家和地区均
有发生(Beekwilder 1999)。植株感染TMV后, 出现
株高矮小、叶片畸形和花叶症状, 严重影响了烤
烟产量和品质。目前, 烟草抗病品种的选育已成
为控制该病害发生的重要途径之一(赵明敏和赵健
2006)。早期报道的黏烟草(Nicotiana glutinous)含
有TMV抗性N基因, 该基因可与TMV互作, 引起感
病叶片产生超敏反应(hypersensitivity, HR)形成抗
病斑, 从而抑制病毒扩散(Whitam等1994), 将该N
基因导入TMV敏感番茄及烟草后, 提高了转基因
植株对TMV的抗性(Whitam等1996; Dinesh-Kumar
等2000)。研究发现TMV侵染抗性烟草时, 植株通
过提高SOD (superoxide dismutase)、CAT (catalase)
等防御酶活性增强植株对TMV的抗性(Montalbini
等1986; 孔凡明等2002); 另外, HR的发生伴随着水
杨酸(salicylic acid, SA)含量积累, 后者又可作为信
号分子调控病程相关蛋白(pathogenesis-related pro-
tein, PR)基因PR-1a基因的表达(Grüner等2003); 另
有研究表明, 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-acti-
vated protein kinase, MAPK)也参与了N基因介导的
HR应答(Takabatake等2007)。近年来, Zhang等
(2009)发现我特有黄花烟草(Nicotiana rustica)品种
HZNH接种TMV后产生与N基因类似的HR反应和
系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR),
并利用同源克隆法从该抗病烟草种质中分离到新
的TMV抗病基因NrCN, 该基因与N基因具有较高
同源一致度(93.63%), 亦属TIR/NBS/LRR基因家族
类抗性基因家族成员, 该家族成员在植物防御病
害和植物生长过程中可作为受体类似蛋白或受体
类似激酶识别病原生物和植物激素(v an der Hoorna
等2005)。张改云等(2010)利用RNA干扰(RNA
interference, RNAi)技术进一步研究NrCN基因功能
时发现, NrCN基因可独立于N基因发挥抗病功能,
推测该基因在参与TMV的抗性应答时与N基因类
似但不完全相同。因此, 研究NrCN基因的抗病机
制以及利用该基因培育抗病烟草新种质具有重要
的理论研究及实际应用价值。本文报道了利用农
杆菌介导遗传转化法将NrCN基因导入TMV敏感
烟草品种K326, 超量表达NrCN基因提高了敏感
K326对TMV的抗性, 为培育抗TMV烟草种质提供
依据。
材料与方法
1 材料
烟草品种K326 (Nicotiana tabacum L.)由贵州
省烟草科学研究院提供。质粒载体pSH737由本实
验室保存并提供; KpnI、EcoRI、T4 DNA 连接酶
和DL 2000 DNA marker均购于Takara宝生物工程
(大连)有限公司; 普通质粒小提试剂盒及新型植物
DNA提取试剂盒均购于TIANGEN BIOTECH公司;
MultiScribeTM Reverse Transcriptase Kit和Power
SYBR® Green PCR Master Mix Kit均购自Applied
Biosystems公司; Ubi.U4-CN片段扩增上下游引物
(Pu和Put)及抗病相关基因的Real-time PCR引物均
由上海旭冠生物科技发展有限公司合成; SOD、
POD、CAT及MDA检测试剂盒均购于南京建成生
物工程研究所; 无水乙醇(分析纯)购于天津科密欧
化学试剂有限公司。
2 方法
2.1 载体构建
用KpnI和EcoRI双酶切质粒载体pSH737, 同
时用EcoRI和KpnI双酶切人工合成的、两端含
KpnI和EcoRI双酶切位点的表达序列。该序列含
普通烟草(N. tabacum) Ubi.U4基因启动子、黄花烟
草(N. rustica)抗病基因NrCN及Ubi.U4基因终止序
列的表达元件, 经T4 DNA连接酶作用, 连接构建成
植物表达载体pSH-CN (图1)。
秦利军等: 超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性 441
2.2 烟草转化及转基因植株鉴定
参照叶圆盘转化法(Horsch等1985)对野生型
烟草品种K326叶片进行烟草遗传转化。新鲜烟草
叶片经灭菌消毒处理后, 切成0.5 cm2小叶块, 置于
携带有含pSH-CN植物表达载体的农杆菌菌液
(OD600为0.5)中侵染转化。之后用无菌滤纸吸去多
余菌液, 接种叶块于共培养基MS1 (MS+1.0 mg·L
-1
6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂)
上, 28 ℃黑暗共培养2 d。共培养完毕后的叶块转
移至脱菌分化培养基MS2 [MS+1.0 mg·L
-1 6-BA+0.2
mg·L-1 NAA+100 mg·L-1卡那霉素(kanamycin)+150
mg·L-1替门汀(timentin)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂]
上, 25 ℃, 16 h光照/8 h黑暗培养2周, 以诱导抗性
芽分化。待抗性芽长至2 cm左右时, 切下并转接
到生根培养基MS3 (1/2MS+0.1 mg·L
-1 NAA+100
mg·L-1 Kan+100 mg·L-1 Tim+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼
脂)上诱导抗性芽生根。待抗性苗生根2周后, 移栽
于含培养基质(园土: Hawita泥炭土=2:1)的花盆(盆
高16 cm, 直径20 cm, 每盆装培养基质10 kg)中生
长, 每盆施1~2 g复合肥(N:P2O5:K2O=10:10:12), 期
间追肥一次。
筛选的抗性植株经GUS组织化学染色鉴定后,
按照TIANGEN BIOTECH公司新型植物DNA提取
试剂盒步骤提取G U S染色阳性植株的基因组
DNA。以目标片段中烟草Ubi.U4基因启动子和
NrCN基因接连部分的807 bp片段(Ubi.U4-CN片段)
设计特异性引物(Pu: 5′-AGGAGCCTC TTTGTTC-
CC-3′和Put: 5′-TCATTCAAACACCACCTCG-3′),
对抗性植株进行Ubi.U4-CN片段的扩增。扩增条
件: 94 ℃, 3 min; 94 ℃, 30 s, 58 ℃, 30 s, 72 ℃, 60 s,
30 个循环; 72 ℃, 7 min; 4 ℃保持。
2.3 TMV提取及接种
TMV提取及接种参照宋莉等(2010)的方法。
剪取感TMV后出现典型花叶病症的新鲜病叶20 g,
流水洗净擦干后去除主脉, 置于研钵中加入等量
0.2 mol·L-1 磷酸缓冲液(pH 7.2)冰上研磨, 经四层纱
布过滤、9 800×g离心及1:5 (V离心上清液:V磷酸缓冲液)稀
释后制备TMV接种液。以同批繁殖的6~8叶期T0
代转基因与野生型烟草作为接种对象, 按照商文
静等(2006)的半叶枯斑法进行TMV接种。分别选
取3株T0代转基因植株和野生型植株的至下向上数
第3片展叶进行人工接种TMV。接种1~2 h后用清
水喷洗叶片上的接种液, 置于人工培养箱中培养
(光照为1 800 µmol·m-2·s-1, 温度25~27 ℃, 相对湿度
>80%, 光周期为16 h光照/8 h黑暗)。同时, 各选3株
T0代转基因和野生型植株以接清水为对照。
2.4 理化指标测定
2.4.1 叶绿素含量测定 叶绿素(chlorophyll, Chl)含
量测定参照邹琦(1995)的方法进行, 分别测定待测
样品在649和665 nm波长下的吸光值, 以95%乙醇
为空白对照; 丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量测
定参照植物MDA含量测定试剂盒操作进行, 测定
待测样品在532 nm波长下的吸光值, 以上实验每
组设3个重复。取接种TMV 0、1、3和5 d后转基
因和野生型烟草接种叶上方的第4片叶进行Chl和
MDA含量测定, 以接清水的转基因植株和野生型
植株为对照。
2.4.2 SOD、CAT及POD酶活性测定 POD、SOD
和CAT酶活力测定参照试剂盒说明书进行。测定
待测样品在420、550和405 nm波长下吸光值, 分
别计算POD、SOD和CAT酶活力, 每组设3个重复,
以接清水的转基因植株和野生型植株为对照。取
样参照方法及部位参照2.4.1。
2.5 抗病基因的表达差异分析
根据NCBI数据库中报道的病程相关蛋白
PR-1a基因、促分裂原活化蛋白激酶MAPK基因和
图1 pSH-CN植物表达载体构建
Fig.1 The construction of the plant expressing vector pSH-CN
植物生理学报442
抗病N蛋白类似蛋白(TMV-resistance N-like pro-
tein) CN基因序列在线设计Real-time PCR引物(表
1), 以烟草β-Actin基因作为内参。
表1 实时定量PCR引物序列
Table 1 Primer sequences for Real-time PCR
基因 GenBank 登录号 引物序列(5′→3′)
β-actin AB158612 TGGTTAAGGCTGGATTTGCT
TGCATCCTTTGACCCATAC
PR-1a X05452 ACAGCTCGTGCAGATGTAGGT
GCTAGGTTTTCGCCGTATTG
MAPK AF325168 TCACAACGGTGAAATCCAAG
TCGGGTTAGATCCGAAAGAG
NrCN EF091690.1 GCATAACCTACGACTGACT
GCTCCAATCCATCATAACTG

剪取6~8叶期接种TMV病毒3 d后的转基因植
株、野生型烟草植株及清水对照植株0.1 g, 提取
总RNA并反转录为cDNA后, 以烟草β-Actin作为内
参基因, 通过SYBR® Green实时定量PCR染料分别
对各植株的病程相关蛋白基因PR-1a、促分裂原
活化蛋白激酶基因MAPK和TMV抗性N蛋白类似
蛋白基因NrCN进行了相对表达差异研究。根据
ABI公司提供的仪器使用说明, 按ΔΔCT法分析各
基因的相对表达量, 每组设3个重复。总RNA提取
参照OMEGA bio-tek公司的Plant RNA Kit操作步
骤进行, cDNA反转录及Real-time PCR分析参照
Applied Biosystems公司的MultiScribeTM Reverse
Transcriptase Kit和Power SYBR® Green PCR Mas-
ter Mix Kit操作说明进行。
实验结果
1 表达载体pSH-CN的构建及鉴定
构建成功的pSH-CN质粒经KpnI和EcoRI双酶
切可得到10 125 bp和4 635 bp两个片段(图2), 与预
期片段大小一致, pSH-CN质粒经特异引物扩增
Ubi.U4-CN片段可得到807 bp (图3)的片段, 电泳结
果表明构建正确。
2 转基因烟草植株的筛选鉴定
以烟草叶片为外植体, 以农杆菌介导遗传转
化法将烟草NrCN基因导入烟草品种K326中, 共培
养2 d后(图4-A), 转入脱菌筛选培养基上培养2~3
周, 烟草叶缘出现绿色的愈伤组织后(图4-B), 经继
图2 pSH-CN质粒EcoRI/KpnI双酶切鉴定
Fig.2 The enzyme digestion of pSH-CN with EcoRI/KpnI
M: DL 2000 DNA marker; 1, 2: pSH-CN质粒酶切鉴定。
图3 卡那霉素抗性菌落PCR检测
Fig.3 PCR confirmation of kanamycin-resistance colony
M: DL 5000 DNA marker; 1: 阴性对照; 2~5: 阳性菌落; 6: 阳
性质粒对照。
代培养诱导产生抗性芽(图4-C), 将高1 cm左右的
抗性芽切下于生根培养基上诱导生根(图4-D), 待
苗长至3~5 cm后炼苗并移栽至营养土中培养(图
4-E)。经GUS组织化学染色和Ubi.U4-CN片段的
PCR鉴定(图5), 共获得转基因植株24株。
3 转基因植株接种TMV抗性鉴定
3.1 接种TMV叶片的超敏反应
野生型烟草植株接种TMV 5 d后, 接种叶片未
见抗病斑形成, 而转基因烟草植株接种叶片产生
HR反应, 形成少量抗病斑(图6-B); 接种TMV 16 d
后, 野生型烟草接种叶上方叶片出现了大量花叶
病斑(图6-C), 而转基因植株接种叶上方叶片出现
秦利军等: 超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性 443
少量花斑(图6-D); 接种清水植株的接种叶和接种
叶上方叶片无抗病斑和花叶病斑形成。
3.2 接种TMV植株Chl和MDA含量变化
转基因植株和野生型植株接种TMV前(0 d)
Chl和MDA含量无明显差异; 但接种TMV后, 野生
型烟草Chl含量从接种前的2.45 mg·g-1 (FW)降至接
种5 d时的1.32 mg·g-1 (FW), 而转基因烟草Chl含量
从2.32 mg·g-1 (FW)变至2.47 mg·g-1 (FW), 野生型植
株Chl含量降幅显著高于转基因植株。接清水对照
植株的Chl含量表现为持续增加(图7-A); 接种TMV
图4 烟草K326的遗传转化
Fig.4 Process of transforming tobacco K326
A: 叶片侵染后共培养; B: 愈伤形成; C: 抗性芽分化; D: 抗性芽生根; E: 烟草移栽。
图5 含Ubi.U4-CN片段转基因烟草检测
Fig.5 Detention of transgenic plants contained the
Ubi.U4-CN fragment 图6 接种TMV不同天数烟草植株症状比较
Fig.6 Comparison of the symptom between tobacco plants
after inoculation
A: 接种TMV 5 d后的野生型植株叶片; B: 接种TMV 5 d后的
转基因植株叶片; C: 野生型植株接种16 d后接种叶上方叶片; D:
转基因植株接种16 d后接种叶上方叶片。
后1 d时, 转基因植株与野生型植株MDA含量差异
不显著; 但接种TMV 5 d时, 野生型烟草MDA含量
为35 nmol·g-1 (FW), 显著高于转基因烟草, 而接种
清水对照植株MDA含量恢复至接种0 d时的水平
(图7-B)。
植物生理学报444
3.3 接种TMV植株SOD、POD和CAT酶活变化
转基因植株和野生型植株接种TMV前(0 d)
POD、SOD和CAT酶活力无明显差异, 说明转入
NrCN基因对这些酶活性没有影响。转基因和野生
型植株接种后3 d时达到最大值, 且转基因植株
POD酶活变幅显著高于野生型植株(图8-A); 接种
TMV后, 转基因植株SOD酶活从接种前(0 d)的26.5
U·mg-1 (蛋白)增加至接种后3 d时的41.39 U·mg-1
(蛋白), 酶活增幅较野生型植株不显著(图8-B); 转
基因植株接种TMV后CAT酶活随接种天数的推移
逐步增加, 在接种后5 d时达到最大值46.06 U·mg-1
(蛋白), 显著高于接种TMV的野生型植株和接清水
对照植株(图8-C)。以上结果表明, CAT、POD和
SOD在NrCN基因介导抗病应答中可能起到了重要
的调控作用。
3.4 接种TMV植株抗病相关基因表达量分析
对接种TMV 3 d后的转基因植株和野生型植
株的PR-1a基因、MAPK基因及NrCN基因表达量
分析表明, 转基因植株PR-1a基因表达量为野生型
植株的2倍以上(图9-A), MAPK基因的表达量为野
生型植株的1倍以上, 最高可达1.8倍, 均显著高于
接种清水对照植株(图9-B); 而转基因植株中NrCN
的表达量显著高于野生型植株, 其表达量为野生
型植株的6~11.5倍, 为接清水转基因植株的 2.5~
4.5倍(图9-C)。因此, 推测TMV感染转基因烟草植
株引起NrCN表达量显著上调, 进而引起病程相
关蛋白基因PR-1a、促分裂原活化蛋白激酶基
因MAPK基因表达量上调 , 从而实现对TMV的
控制。
图7 不同接种天数烟草植株Chl和MDA含量变化
Fig.7 The content change of Chl and MDA in tobacco plants
after inoculation
A: 叶绿素含量变化; B: 丙二醛含量变化。TP-I: 转基因植
株接TMV; TP-M: 转基因植株接清水; WT-I: 野生型植株接TMV;
WT-M: 野生型植株接清水; 图8和9同此。
图8 不同接种天数POD、SOD及CAT酶活变化
Fig.8 Change of enzyme activity in tobacco plants
after inoculation
A: POD酶活力变化; B: CAT酶活力变化; C: SOD酶活力变化。
秦利军等: 超量表达NrCN基因提高烟草植株对TMV的抗性 445
讨　　论
TMV (tobacco mosaic virus)是一种在全世界
各烟区普遍发生、局部地区严重流行的烟草病毒
病害。该病田间发病率一般在5%~20%, 幼苗期或
大田初期感染常造成植株严重矮化, 叶片皱缩, 损
失可达30%~50%, 严重的甚至绝产绝收, 据报道全
世界每年仅TMV造成的危害就超过1亿美元(耿召
良等2011)。利用基因工程手段培育耐(抗)病烟草
新种质是寻求生态和谐、环境友好、人畜安全和
成本低廉的有效途径之一。Zhang等(2009)从我国
特有烟草黄花烟(Nicotiana rustica) HZNH品种鉴
定和分离到TMV抗性NrCN基因, 本研究通过构建
了含烟草Ubi.U4基因启动子启动抗病基因NrCN的
表达的植物表达载体pSH-CN, 遗传转化法获得含
NrCN基因的转基因烟草植株, 并通过对其进行人
工接种实验研究NrCN基因对TMV的抗性。
接种烟草花叶病毒0~3 d内, 转基因植株Chl含
量出现小幅度增加, 但在接种后3~5 d内Chl含量开
始下降; 而野生型植株Chl含量在接种TMV后逐步
下降, 且在接种后3~5 d内Chl含量降幅显著高于转
基因植株。推测在接种TMV早期(0~3 d内), 转基
因植株中的NrCN基因与TMV互作后, 调动机体的
抗性应答机制, 抑制病毒的迅速扩散; 而野生型敏
感植株中由于不存在抗病基因NrCN, 因此接种
TMV后病毒扩散迅速, 在接种叶片上方出现了严
重的花叶病症。另外, 在接种TMV前期(0~3 d), 转
基因植株和野生型植株MDA含量不断增加, 推测
MDA含量上升与生物(或非生物)胁迫引起的细胞
膜脂损伤有关; 在接种病毒后期(3~4 d), 野生型和
转基因植株中MDA含量开始下降, 但两者降幅差
异不显著, 但转基因植株在接种病毒5 d时, MDA
含量显著低于野生型植株。推测接种病毒0~4 d内,
MDA含量变化可能更多由于非生物(摩擦接种)胁
迫所致, 但在接种病毒5 d时, 随着转基因植株中
NrCN基因表达量上升, 延缓了质膜氧化产物MDA
含量的积累, 该结果与白海群(2009)报道的植物提
取液处理感病植株降低其MDA含量及提高抗病性
结论类似。接种病毒0~3 d内, 转基因及野生型植
株的SOD、POD和CAT酶活性随接种天数增加而
上升, 与惠娜娜等(2007)的研究结果相似。表明在
植物体防御外界胁迫时, 通过增加防御酶的活性
来诱导机体产生对逆境胁迫的应答。接种TMV前
期(0~3 d), 转基因植株的SOD及POD酶活性显著高
于野生型植株, 推测转基因植株对TMV产生抗性
应答主要在接种早期阶段, 通过提高SOD和POD
酶活性调控植物体内的抗病应答机制 , Yang等
(1997)也报道了抗病基因与TMV识别后可引起活
性氧(reactive oxygen intermediates, ROI)含量增加,
而ROI积累可引起SOD活性上升, 后者以ROI为底
物催化成抗病应答机制中的重要信号分子H2O2;
接种TMV后, 转基因植株的CAT酶活不断增加, 在
接种后5 d时达到最高值, 推测在NrCN基因介导的
抗病应答机制中, CAT酶活的提高一方面参与清除
过剩的质膜氧化有害物质ROI; 另一方面, CAT可
诱导植物细胞内信号分子的活化, 从而激活NrCN
图9 烟草植株接种TMV及清水3 d时基因表达分析
Fig.9 The analysis of gene expression in tobacco plants
after inoculation
植物生理学报446
基因介导的抗病信号通路, Dorey等(1998)认为烟
草植株产生HR和局部获得抗性(localized acquired
resistance, LAR)时, 细胞中的I型过氧化氢酶的转
录水平下降, 而II型过氧化氢酶的转录水平会急剧
上升。
抗病相关基因Real-time PCR分析表明接种病
毒3 d时, 转基因植株中MAPK基因、PR-1a基因及
NrCN基因的表达量显著高于接种TMV的野生型
植株, 与宋莉等(2010)的研究结果类似。接种TMV
的转基因植株中NrCN基因的高表达量伴随着
MAPK基因表达量的增加, 表明TMV与NrCN基因
互作后产生信号分子 , 激活病程相关蛋白基因
PR-1a及MAPK基因的表达。转基因植株接种
TMV后, TMV与抗病基因NrCN互作可引起植株体
内SOD、POD及CAT等氧化还原酶活性增强, 以清
除机体产生的多余活性氧, 或产生抗病信号分子
H2O2, 而信号分子可进一步诱导病程相关基因
PR-1a及MAPK的表达量增加, 引起植株产生HR抑
制病毒扩散, 该结果与转基因植株Chl和MDA含量
变化相印证。综上所述, NrCN基因的超量表达提
高了敏感烟草植株对TMV的抗性, 延缓了植株的
发病期, 有关NrCN在转基因植株中如何调控抗病
机制以及参与的抗病信号转导通路仍在进一步研
究中。
参考文献
白海群(2009). 植物提取液对感染TMV烟叶生理生化特性及超微
结构的影响[学位论文]. 郑州: 河南农业大学
耿召良, 商胜华, 陈兴江, 曹毅(2011). 植物源抗烟草花叶病毒天然
产物研究进展. 中国烟草科学, 32: 84~91
惠娜娜, 郭成瑾, 商文静, 商鸿生(2007). 壳寡糖诱导和TMV侵染烟
草防御酶活性的变化. 西北农林科技大学学报(自然科学版),
35: 213~216
孔凡明, 杨光, 陈学平, 夏凯, 许志刚, 周燮(2002). 烟草与TMV不同
互作体系中的活性氧及抗氧化酶系活性比较. 安徽农业大学
学报, 29: 217~223
商文静, 吴云峰, 赵小明, 杜昱光, 商鸿生(2006). 壳寡糖诱导烟草
抑制TMV增殖的研究. 西北农林科技大学学报(自然科学版),
34: 88~91
宋莉, 赵德刚, 田晓娥, 吴拥军(2010). ChlFN-α基因在烟草中的
表达及转基因烟草对TMV的抗性. 中国农业科技导报, 12:
118~122
邹琦(1995). 植物生理生化实验指导. 北京: 中国农业出版社,
33~34
赵明敏, 赵健(2006). 烟草抗TMV 基因工程的研究进展. 西北植物
学报, 26: 201~206
张改云, 熊腾飞, 马有志, 郭家明, 陈学平(2010). 烟草CN基因的
RNA沉默载体构建与功能分析.中国烟草学报, 16 : 77~82
Beekwilder KM (1999). The inheritance of resistance to tobacco mo-
saic virus in tobacco introductions.. Blacksburg: Virginia Poly-
technic Institute and State University
Dinesh-Kumar SP, Tham WH, Baker BJ (2000). Structure-function
analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N. Proc Natl
Acad Sci USA, 97: 14789~14794
Dorey S, Baillieul F, Saindrenan P, Fritig B, Kauffmann S (1998). To-
bacco class I and II catalases are differentially expressed during
elicitor-induced hypersensitive cell death and localized acquired
resistance. Mol Plant Microbe In, 11: 1102~1109
Grüner R, Strompen G, Pfitzner AJP, Pfitzner UM (2003). Salicylic
acid and the hypersensitive response initiate distinct signal trans-
duction pathways in tobacco that converge on the as-1 like ele-
ment of the PR-1a promoter. Eur J Biochem, 270: 4876~4886
van der Hoorna RAL, Wulffb BBH, Rivas S, Durrante MC, van der
Ploega A, de Wita Pierre JGM, Jones JDG (2005). Structure-
function analysis of Cf-9, a receptor-like protein with extracyto-
plasmic leucine-rich repeats. Plant Cell, 17: 1000~1015
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG Fraley RT
(1985). A simple and general method for transferring genes into
plants. Science, 227: 1229~1231
Montalbini P, Buonaurio R (1986). Effect of tobacco mosaic virus
infection on leaves of soluble superoxide dismutase (SOD) in
Nicotiana tabacum and Nicotiana glutinosa leaves. Plant Sci, 47:
135~143
Takabatake R, Ando Y, Seo S, Katou S, Tsuda S, Ohashi Y, Mitsuhara
I (2007). MAP kinases function downstream of HSP90 and
upstream of mitochondria in TMV resistance gene N-mediated
hypersensitive cell death. Plant Cell Physiol, 48: 498~510
Whitham S, Dinesh-Kumar SP, Choi D, Hehl R, Corr C, Baker B
(1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene
N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell, 78:
1101~1115
Whitham S, McCormick S, Baker B (1996). The N gene of tobacco
confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato.
Proc Natl Acad Sci USA, 93: 8776~8781
Yang Y, Shah J, Klessig DF (1997). Signal perception and transduc-
tion in plant defense responses. Genes Dev, 11: 1621~1639
Zhang GY, Chen M, Guo JM, Xu TW, Li LC, Xu ZS, Ma YZ, Chen
XP (2009). Isolation and characteristics of the CN gene, a to-
bacco mosaic virus resistance N gene homolog, from tobacco.
Biochem Genet, 47: 301~314