全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 903
茉莉酸甲酯与二氢茉莉酮酸甲酯对悬浮培养的甘草细胞生长和黄酮积累的
影响
杨英, 郑辉, 李赟 , 季家兴, 余龙江 *
华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉 430074
提要: 建立了稳定的甘草细胞悬浮培养体系, 在一个培养周期内, 细胞的生长曲线呈 “S”型, 培养21 d的干重、鲜重和黄酮
产量都达到最高值。甘草细胞悬浮培养体系中分别添加100 µmol·L-1二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯时, 虽然对细胞生长
有一定程度的抑制, 但细胞中甘草黄酮产量仍有提高。添加二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯的最适时间分别为细胞培养后
的第 5天和第 10天。
关键词: 胀果甘草悬浮细胞; 甘草黄酮; 茉莉酸甲酯; 二氢茉莉酮酸甲酯
Effects of Methyl Jasmonate and Methyl Dihydrojasmonate on the Cell Growth
and Flavonoids Accumulation in Cell Suspension Culture of Glycyrrhiza inflata
Bat.
YANG Ying, ZHENG Hui, LI Yun, JI Jia-Xing, YU Long-Jiang*
College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: The effects of methyl jasmonate and methyl dihydrojasmonate on cell growth and flavonoids produc-
tion in suspension cultures of Glycyrrhiza inflata Batal were investigated. Biomass accumulation and flavonoids
production both exhibited “S” curve in one culture cycle, with the greatest values obtained on day 21. In
addition, although the cell growth was restrained to some degree by the methyl dihydrojasmonate and methyl
jasmonate treatment with the concentration of 100 µmol·L-1, the flavonoids accumulation was increased. Moreover,
the optimum time for the addition of methyl dihydrojasmonate and methyl jasmonate was the 5th day and the
10th day during the cell culture, respectively.
Key words: cell suspension cultures of Glycyrrhiza inflata; flavonoids production; methyl jasmonate; methyl
dihydrojasmonate
收稿 2008-06-16 修定 2008-07-22
资助 新疆建设兵团新疆昆仑神农股份有限公司提供经费。
* 通讯作者 ( E -m a i l : Y u l j @ h u s t . e d u . c n ; T e l : 0 2 7 -
8 7 7 9 2 2 6 4 )。
采用细胞培养大规模生产甘草的有效成分已
有报道, 如梁玉玲等(2000)用胀果甘草(Glycyrrhiza
inflata)愈伤组织培养生产甘草酸; 杨世海等(2005)
的乌拉尔甘草(G. uralensis)愈伤组织培养条件的探
索以及杜旻等(2001)乌拉尔甘草毛状根培养体系的
建立等。但有关采用甘草细胞培养生产总黄酮的
研究还未见有报道。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,
MJ)是一种小的信号分子, 具有广泛的生理作用(刘
燕等2007), 它可以作为细胞信使, 参与到植物细胞
的代谢过程中, 激活特定的防御相关基因表达, 引
起细胞抗逆反应产物表达(宾金华和潘瑞炽1999)。
张进杰和徐茂军(2006)研究NO和茉莉酸甲酯影响
黄芩悬浮细胞生长及黄芩苷合成的结果表明, MJ能
增加黄芩苷的合成。余龙江等(1999)的研究表明,
茉莉酸甲酯有诱导紫杉醇生物合成的作用。茉莉
酸甲酯对植物培养物的次级代谢的诱导也引起人们
的注意(于树宏和李玲 2002; 徐亮胜等 2005; 罗建
平等 2006), 但其对胀果甘草悬浮细胞合成甘草黄
酮的研究尚未见报道。二氢茉莉酮酸甲酯是MJ的
类似物, 在工业中可以作为一种香料, 但价格比MJ
便宜很多。为此, 本文研究MJ及其类似物二氢茉
莉酮酸甲酯(methyl dihydrojasmonate)对甘草细胞生
长和甘草黄酮积累的影响, 以期为甘草细胞规模化
生产黄酮类化合物提供参考。
材料与方法
实验材料为我们实验室保存的高产甘草黄酮
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的胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)细胞系。其悬
浮培养的培养基为MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1
6-BA+0.5 mg·L-1 2,4-D, 3%蔗糖, 高压灭菌前将pH
调至 5.8。在光照强度为 30 µmol·m-2·s-1条件下振
荡培养, 光暗周期为 12 h/12 h。摇床转速为 120
r·min-1, 培养温度为(25±1) ℃, 每 20 d继代一次, 接
种量为 5%, 用 250 mL三角瓶, 每瓶装 80 mL培养
基。所有实验至少重复 3 次。
细胞培养一个周期(共 20 d)后, 培养物以沙芯
漏斗过滤, 用蒸馏水将残留的培养液冲洗干净, 再
次抽滤, 称重, 得到细胞鲜重(FW), 然后将所得细
胞置于 50 ℃烘箱中烘干至恒重, 冷却后称得细胞
干重(DW)。
不同浓度二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯经
过滤除菌后, 于细胞培养的不同时间添加到悬浮培
养体系中。细胞培养一个周期(共 20 d)后, 测定细
胞的干重。测定甘草黄酮的含量时, 准确称取 1 g
干燥至恒重的甘草细胞粉末, 过 100目筛, 加入 30
倍量 80%乙醇溶液超声提取 1 h, 提取液减压浓缩
至 5 mL后, 用 5 mL乙酸乙酯萃取 3次, 合并萃取
液, 然后用 95%乙醇提取, 以 3 500×g离心 5 min
后, 得到的上清液即为甘草黄酮液。甘草黄酮含量
测定用比色法(张雪辉等2001), 即用甲醇稀释后, 再
加 0.5 mL 10% KOH溶液, 充分摇匀后显色 5 min,
用甲醇定容至 10 mL, 摇匀后用Unico紫外可见分
光光度计[Unico wfz UV-2100, 尤尼柯(上海)仪器
有限公司]测定其波长 410 nm处的吸收值, 以芦丁
为标准样品。
结果与讨论
1 悬浮培养的甘草细胞的生长和黄酮的积累
从图1可以看出, (1)甘草细胞悬浮培养的生长
周期为25 d左右, 细胞的鲜重和干重增长的时间进
程非常相似, 基本上呈现 “S”型。在培养的前 6 d,
细胞生长缓慢, 有明显的延迟期, 6 d之后, 生物量
迅速增长, 即为对数生长期, 第 21天的干重和鲜重
都达到最高值, 分别为 16.4 g·L-1和 232.4 g·L-1, 为
培养初期的 5倍左右。21 d后, 进入稳定期, 干重
变化不大, 鲜重开始缓慢下降。(2)前 6 d, 总黄酮
积累缓慢, 之后黄酮总产量迅速增加, 第 21天达到
最高, 为 95.7 mg·L-1。在随后的培养过程中, 黄酮
的总产量略微下降。甘草细胞生长的最佳周期为
21 d, 在整个培养周期中, 黄酮积累和细胞生长是同
步的。
2 不同浓度二氢茉莉酮酸甲酯和MJ对甘草细胞
生长和甘草黄酮产量的影响
不同浓度的MJ和二氢茉莉酮酸甲酯在第 10
天加入培养基中, 培养后 20 d收获细胞, 从图 2可
以见到, (1)在一定浓度二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸
甲酯的范围内, 随着两者浓度的增加, 甘草细胞的
生物量下降, MJ抑制细胞生长比二氢茉莉酮酸甲酯
强。二氢茉莉酮酸甲酯浓度小于20 µmol·L-1时, 其
对甘草细胞生长影响不大, 而当二氢茉莉酮酸甲酯
和MJ的浓度为 120 µmol·L-1时, 细胞褐化严重, 可
能是大多数细胞已经死亡。(2)在一定浓度二氢茉
莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯的范围内, 随着二者浓度
的增加, 甘草细胞中总黄酮产量也增加, 二者浓度
均为100 µmol·L-1时, 甘草细胞中总黄酮产量最大。
两者浓度继续增大时, 甘草细胞的总黄酮产量都开
始下降, 浓度达到120 µmol·L-1时, 甘草细胞的总黄
酮产量明显低于不加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ的。
这说明低浓度二氢茉莉酮酸甲酯和MJ均促进甘草
黄酮的积累, 而高浓度的二氢茉莉酮酸甲酯和MJ
则有抑制作用。
图 1 悬浮培养的甘草细胞生长和黄酮的积累
Fig.1 Time curves of cell growth and flavonoids accumula-
tion in suspension culture of Glycyrrhiza inflata Bat.
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3 不同时间添加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ对甘草
细胞生长和甘草黄酮产量的影响
为了寻找最佳的添加时间, 于细胞培养后 0、
5、10、15 d加入浓度为 100 µmol·L-1的二氢茉
莉酮酸甲酯和MJ, 培养后 20 d收获细胞, 测定细
胞的生物量和甘草黄酮产量的结果如图3所示, 培
养开始时 0 d加入 100 µmol·L-1二氢茉莉酮酸甲酯
和MJ对细胞的影响最大, 细胞褐化现象严重, 甘草
细胞干重分别仅为不加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ的
28.3%和 35.5%, 总黄酮产量也显著比不加二氢茉
莉酮酸甲酯和MJ的低, 但于第5天加入浓度为100
µmol·L-1二氢茉莉酮酸酯对细胞的生长几乎没有影
响, 为不加的 98.1%, 而在第 10天加入MJ对细胞
的生长影响也最小, 为不加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ
的 89.6%。第 5天添加二氢茉莉酮酸甲酯对提高
黄酮产量最有效, 为不加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ
的 1.45倍, 达到 108.26 mg·L-1; 第 10天加入MJ能
达到最好效果, 为不加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ的
1.47倍, 达到 110.26 mg·L-1。
图 3 不同时间添加二氢茉莉酮酸甲酯和MJ对甘草细胞生长和黄酮积累的影响
Fig.3 Effects of the addition time of methyl dihydrojasmonate and methyl jasmonate on the cell biomass and flavonoid
accumulation
图 2 不同浓度二氢茉莉酮酸甲酯和MJ对甘草细胞生长和黄酮积累的影响
Fig.2 Effects of methyl dihydrojasmonate and methyl jasmonate on the cell biomass and flavonoid accumulation
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月906
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