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大蕉果皮脱镁螯合酶的纯化和某些特性初探



全 文 :植物生理学通讯 第 44卷 第 3期,2008年 6月426
大蕉果皮脱镁螯合酶的纯化和某些特性初探
杨晓棠 1,张昭其 1,徐兰英 1,黄雪梅 1,庞学群 2,*
华南农业大学 1园艺学院,2生命科学学院,广州 510642
提要:用盐析法从大蕉果皮中初步纯化了脱镁螯合酶(Mg-dechelatase, MDCase),纯化程度约为 3.01倍。以叶绿酸
(chlorophyllin)为底物,MDCase Km值为 13.47 nmol·L-1;活性最适反应温度为 50 ℃;在 30~70 ℃内,活性较稳定,但在
100 ℃下 40 min仍保持 50%活性;在 pH 6.5~9.5范围内,随着 pH的升高,酶活性逐渐增大。MDCase活性受还原剂 β-
巯基乙醇、二硫苏糖醇、抗坏血酸、Na2SO3 (SO2)和还原型谷胱甘肽的抑制,而受过氧化氢激活;金属离子Cu2+、Zn2+、
Fe2+、Ca2+和K+都在不同程度上抑制MDCase活性;不同的螯合剂效应不同,EDTA对酶活性有抑制作用,而柠檬酸却
影响不大。
关键词:大蕉果皮;脱镁螯合酶;纯化
Purification of Mg-Dechelatase from Plantain Peel and Its Enzymatic Properties
YANG Xiao-Tang1, ZHANG Zhao-Qi1, XU Lan-Ying1, HUANG Xue-Mei1, PANG Xue-Qun2,*
1College of Horticulture, 2College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: In this report, we reported the Mg-dechelatase was partially purified from plantain peel tissues by
ammonium sulfate fractionation and some properties of the enzyme. The enzyme was purified about 3.01 times.
The Km of the enzyme for the substrate chlorophyllin was 13.47 nmol·L-1. The enzyme had higher thermo-
stability at 30–70 ℃ and about 50% of the activity was retained at 100 ℃ for 40 min. The optimum reaction
temperature and pH were 50 ℃ and a range of 6.5–9.5, respectively. The enzyme activity was inhibited by some
reduced reagents, such as β-mereaptoethanol, dithiothreitol, ascorbic acid, Na2SO3 (SO2) and reduced glutathione,
and activated by H2O2. Cu2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, K+, inhibited the enzyme activity. EDTA and citric acid had inverse
effect on the activity.
Key words: plantain peel; Mg-dechelatase; purification
收稿 2008-01-30 修定 2008-04-28
资助 国家自然科学基金(30 3 00 2 4 3)、广东省联合基金重点
项目 ( U 0 6 3 1 0 0 4 )和广东省自然科学基金团队项目
(0 6 2 00 6 7 0 )。
* 通讯作者(E-mail:xqpang@scau.edu.cn;Tel:02 0-
8 5 2 8 0 1 9 5 )。
叶绿素降解是叶片衰老过程中的生理过程,
其降解途径已基本得到阐明(Hörtensteiner和Matile
2003;Matile等1999)。在叶绿素酶(chlorophyllase,
Chlase)的作用下,叶绿素分子首先脱去植醇长
链,生成绿色叶绿素降解产物脱植基叶绿素
(chlorophyllide, Chlide) ;脱植基叶绿素在脱镁螯
合酶(Mg-dechelatase, MDCase)的作用下失去中心
镁离子,产生脱镁叶绿酸 a (pheophorbide a, Pheide
a) ;最后在脱镁叶绿酸 a氧化酶(pheiphorbide a
oxygenase, PaO)和红色叶绿素降解产物还原酶(red-
chlorophyll catabolite reductase, RCCR)的共同作用
下,脱镁叶绿酸 a生成具有蓝色荧光无色的叶绿
素降解产物,叶绿素分子卟啉大环在这一步中失
去环状结构,从绿色转变为无色。这条始于叶绿
素酶,经过MDCase到达 PaO 的代谢途径称为
“PaO 途径”(Matile等 1999)。
脱镁离子反应是叶绿素降解途径中的关键步
骤之一,由于此反应不可逆,因此成为叶绿素降
解途径中限速步骤之一(Tanaka等 2003)。在许多
植物中均发现有脱镁叶绿素类物质的存在(Jananve
1997;Shioi等 1996;Tang等 2000) 。体外试验
证明,叶绿素降解途径中的关键酶 PaO仅作用于
脱镁叶绿酸 a (Hörtensteiner等 1995) ;此外,叶
绿素必须脱镁离子后才能顺利降解为对植物组织无
毒性的物质(Kunieda等 2005;Langmeier等 1993;
Shimokawa等 1990;Shioi等 1991;Suzuki等
2005;Suzuki和 Shioi 2002;Takahashi等 2001;
Tanaka等 2003;Vicentini等 1995)。随着草莓果
实的成熟,MDCase活性逐渐升高,完熟时达到
最高,而叶绿素迅速降解(Costa等 2002)。我们
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的研究表明,随着大蕉果实的后熟转黄,
MDCase活性逐渐升高,表明MDCase与大蕉果
实后熟过程中叶绿素的降解紧密相关(杨晓棠
2006)。MDCase是负责植物脱镁离子反应的主要
酶类(Matile等1999),有关植物MDCase酶学性质
的研究报道甚少,仅在草莓(Costa等 2002)、藜
科植物(Suzuki和 Shioi 2002)以及油菜(Costa等
2002;Suzuki和 Shioi 2001;Vicentini等 1995)中
有报道,有关MDCase酶学性质的结果也很不一
致。有人曾在草莓和油菜子叶MDCase粗提液过
滤液中发现有热稳定性小分子量的物质,并有脱
镁离子的能力(Costa等 2002;Suzuki等 2005)。
Suzuki等(2005)从柱层析分步纯化的藜科植物
MDCase粗提液中也得到多种具脱镁活性的物质。
这表明在植物中存在多种不同的具有脱镁活性的物
质。
在果实中,随着果实的不断成熟或后熟,果
皮中叶绿素不断降解,绿色逐渐消失,呈现出类
胡萝卜素或花色素苷的颜色(杨晓棠等 2006)。我
们以前的工作表明,大蕉果实在后熟过程中叶绿
素降解途径与一般的衰老叶片一样,也是通过
PaO途径,较高温度下果皮MDCase活性更高,
较高温度还会促进果皮褪绿转黄(杨晓棠 2006),
说明MDCase是在大蕉果实叶绿素降解过程中起作
用的。为了了解大蕉果皮MDCase的性质,我们
对其进行了初步纯化,并对其酶学特性作了初步
探讨。
材料与方法
大蕉(Musa paradisiaca L.)购自广州番禺香蕉
园,挑选成熟度为 70%~80%的果实进行催熟处
理,选取不同后熟成度的果实,清洗后剥取果
皮,以液氮速冻后置于 -80℃低温中备用。
MDCase的提取和纯化参照 Costa等(2002)文
中的方法。取果皮按照 2 mL·g-1的比例加入 4 ℃
预冷的提取液[0.1 mol·L-1 pH 6磷酸缓冲液含0.2%
(V/V) Triton X-100、30 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)、1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 5
mmol·L-1半胱氨酸],冰浴中匀浆后放在低温(4 ℃)
摇床上振荡 2 h后,4层纱布过滤,滤液在 4 ℃
下以 9 000×g离心 20 min,上清液为粗酶提取液。
向粗酶液中边搅拌边加硫酸铵至 45%饱和度,混
合物在 4 ℃下振荡 5 h后,以 9 000×g离心60 min,
沉淀弃去。继续向上清液中加入硫酸铵至 90%饱
和度,在 4 ℃下振荡过夜。以 9 000×g离心 60
min,上清液弃去。沉淀悬浮于少量 0.1 mol·L-1
pH 7.0磷酸缓冲液中,并在 4 ℃下以相同的缓冲
液透析过夜,即是酶液。初步纯化的酶液进行超
滤、苯基琼脂糖凝胶(phenyl-sepharose) CL-4B或
DEAE柱层析,均未能成功获得具有活性的组
分,本文所用的制剂为硫酸铵初步纯化的酶
液。
参照Vicentini等(1995)文中的方法制备底物叶
绿酸(chlorophyllin, Chlin)。用 80%冷丙酮从菠菜
叶中提取出叶绿素,过滤去残渣。按照 1:1 (V/V)
的比例加入石油醚萃取叶绿素,除去丙酮层后在
醚层加入 2次蒸馏水洗涤。在叶绿素石油醚提取
液中按照 1 mL·mg-1叶绿素的比例加入 30% (W/V)
KOH-甲醇溶液,出现叶绿酸(Chlin)沉淀后,再
用 5 500×g离心 15 min,收集沉淀溶于 10 mL蒸
馏水中。用2 mol·L-1三胺(tricine)缓冲液调节pH至
9.0,分装后置于 -20 ℃下备用。
MDCase活性测定参照 Jananve (1997)和
Vicentini等(1995)文中的方法。反应混合物包含50
mmol·L-1 Tris-Tricine缓冲液(pH 8.8)、10 µL叶绿
酸和 200 µL酶液,总体积为 3 mL。37 ℃放置
水浴中 30 min后,用紫外可见分光光度计测定波
长692 nm处吸光值,酶活性以每分钟OD变化0.001
为一个单位(U),活性用 U·g-1 (FW)表示。
结果与讨论
1 MDCase活性测定体系的建立
比较了磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液和 Tris-
三胺缓冲液中底物叶绿酸稳定性,结果表明Chlin
在 Tris-三胺缓冲液中最稳定,基本上不发生自发
的脱镁离子反应(数据未列出),因此以后MDCase
活性测定均采用 Tris- 三胺缓冲液。波长扫描表
明,底物叶绿酸的特征峰为 6 4 4 n m,加入
MDCase液后,644 nm的峰值下降,并在 692 nm
处出现一个新的产物峰,且随着时间的延长,
644 nm的峰值逐渐减小,而 692 nm的峰值则不
断增加(图 1-a)。随着时间的推移(0~35 min),A692
逐渐呈线性增加(图 1-b),说明这一反应体系可用
于测定MDCase活性。
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2 MDCase的纯化
大蕉果皮提取液经硫酸铵45%~90%饱和度盐
析后,酶纯化程度增加约 3.01倍(表 1)。有研究
表明,超滤可以在滤液中获得具有脱镁螯合作用
的组分(Costa等 2002)。但本文的结果表明,以
离心超滤管(10 kDa)进行超滤后,滤液中并没有
测出脱镁螯合活性。苯基琼脂糖凝胶 CL-4B曾成
功用于叶绿素酶的纯化(Trebitsh等 1993),用同为
疏水层析材料的丁基琼脂糖凝胶(Butyl-Sepharose)
纯化MDCase也有成功的尝试(Suzuki和 Shioi
2001)。一般认为叶绿素酶和MDCase是位于叶绿
体膜上的,因此我们也曾尝试用苯基琼脂糖凝胶
CL-6B对MDCase进行纯化,但获得的组分均未
能测出MDCase活性。
图 1 大蕉果皮的MDCase活性变化
Fig.1 The MDCase activity in peel of plantain
a:大蕉MDC 酶液和底物叶绿酸反应的波长扫描;b:随
着时间进程 6 9 2 nm 吸光值的变化。
表 1 大蕉果皮MDCase的分离纯化
Table 1 Purification of Mg-dechelatase of plantain peel
纯化步骤 总体积 /mL 总活性 /U 总蛋白量 /mg 比活性 /U·mg-1 回收率 /% 纯化倍数
粗酶液 158 790 260.70 3.03 100 1
45% (NH4)2SO4 174 405.42 104.71 3.87 51.32 1.28
90% (NH4)2SO4 15 250 27.41 9.12 31.65 3.01
3 MDCase的Km值
作为植物MDCase活性测定的人工底物叶绿
酸在酶促反应中可转化为脱镁代谢物质(Vicentini
等 1995)。不同植物来源的MDCase对叶绿酸的亲
和力差异较大,如草莓MDCase对叶绿酸的Km为
81 nmol·L-1和 116 nmol·L-1、藜属植物为 95 nmol·L-1、
油菜为 17 nmol·L-1 (Costa等 2002;Suzuki和 Shioi
图 2 大蕉果皮的MDCase对叶绿酸的动力学参数
Fig.2 Lineweaver-Burk plot of the MDCase on Chlin
conversion
2001;Vicentini等 1995)。用 Lineweaver-Burk作
图(图 2)表明,在 37 ℃和 pH 8.8的条件下,大蕉
果皮MDCase对叶绿酸的Km为 13.47 nmol·L-1,比
其他来源的MDCase的Km值更低,表明大蕉果皮
MDCase对叶绿酸具有较高的亲和力。
4 MDCase的热稳定性
取等量酶液分别在30~100 ℃下保温40 min并
于冰浴中冷却后,立即检测MDCase活性的结果
(图 3)表明,MDCase在 30~70 ℃温度范围内活性
比较稳定;但 60 ℃下酶活性似乎有一定程度的激
活。Shioi等(1996)发现,95 ℃水浴处理 5 min即
能使藜属植物MDCase粗酶液完全失活。但我们
的结果表明,随着温度再提高,虽然酶活性急剧
下降,但在 100 ℃下能保持约 50%的活性。酶提
取液中似乎有某种具有脱镁离子作用的热稳定性物
质。由于 100 ℃ 40 min足以使蛋白质变性,因
此推测此物质可能与蛋白无关。此外,虽然有人
在草莓果实MDCase提取液中也发现有某种具有脱
镁离子作用的热稳定性物质,称为脱镁螯合物质
(Mg-dechelating substance, MDS),但其结构与性
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质仍不清楚(Kunieda等 2005;Suzuki等 2005)。
Matile等(1996)推测,MDS可能仅仅是MDCase的
一类辅因子,容易与MDCase分离,且其自身也
具有脱镁离子的作用。
5 MDCase催化反应的最适温度和最适反pH值
(1)在 30~50 ℃温度范围内,酶活性随着温度
的升高而升高,温度超过 50 ℃时,MDCase活性
骤然下降(图 4-a),可知大蕉MDCase最适反应温
度为 50 ℃。不同来源MDCase的最适反应温度比
较接近。Costa等(2002)报道,在 30~50 ℃范围
内,温度越高,草莓MDCase活性越大,50 ℃
时活性最高,我们的结果与其类似。
(2)在Tris-三胺缓冲液pH 6.5~9.5范围内,随
着 pH值的提高,MDCase活性逐渐增大。pH降
低到 6.5时,MDCase完全丧失活性(图 4-b)。可
见,大蕉MDCase在碱性环境中活性较高,这与
前人的结果(Costa等 2002;Suzuki和 Shioi 2001;
Vicentini等 1995)类似。
6 金属离子和某些化合物对大蕉果皮中MDCase
活性的影响
如表 2所示,Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+和 K+
对大蕉果皮中MDCase活性有不同程度的抑制作
用,特别是浓度高时抑制作用更明显。但Na+和
Mg2+对MDCase活性的影响不明显。β-巯基乙
图 3 大蕉果皮的MDCase的热稳定性
Fig.3 Thermo-stability of MDCase in plantain peel
图 4 大蕉果皮MDCase催化反应的最适温度和最适 pH
Fig.4 The optimum temperature and the optimum pH of MDCase in plantain peel
表 2 多种金属离子和一些化学物质对大蕉MDCase活性
的影响
Table 2 Effects of some metal ions and chemical compounds
on MDCase activity

化学物质
MDCase相对活性 /%
0.1 mmol·L-1 1 mmol·L-1
对照   100   100
CuSO4 9.5±1.11   未测
ZnSO4 33.3±9.94 40.5±6.59
FeSO4 83.3±2.33 59.5±4.44
CaCl2 88.1±0.56 50.0±8.7
KCl 81.0±4.75 81.0±4.66
NaCl 95.2±0.05 102.4±2.4
MgCl2 109.5±0.98 100.0±8.21
Na2SO3 83.3±1.02 52.3±1.83
β-巯基乙醇 16.7±13.42   未测
二硫苏糖醇 145.2±6.66 2.4±1.99
还原型谷胱甘肽 78.6±2.41 40.5±1.69
抗坏血酸 11.9±4.91   未测
H2O2 119.0±1.11 138.1±0.47
EDTA 2.4±5.77 11.9±5.45
柠檬酸 90.5±9.44 111.9±0.7
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醇、二硫苏糖醇、抗坏血酸、Na2SO3 (SO2)、还
原型谷胱甘肽和EDTA对MDCase活性都有抑制作
用,柠檬酸对酶活性影响不大,而H2O2对MDCase
活性有促进作用。
参考文献
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