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一种具有热滞活性的女贞叶质外体过氧化物酶



全 文 :植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 2 0 0 8 年 2 月
一种具有热滞活性的女贞叶质外体过氧化物酶
张峰’, 蔡宇杰 ‘, 廖祥儒 ’, ’ , 刘尚 ‘, 王臻 ’, 张大兵’
, 工业生物技术教育部重点实验室 , 江南大学生物工程学院 , 江苏无锡 2 14 12 2 ; 2 江苏汉邦科技有限公司 , 江苏淮安
2 23 00 1
提要 : 采用浸 出离心法从女贞叶 中分离的质外体蛋白 , 约占叶片可溶蛋白的 1 . 63 % , 其中的质外体过氧化物酶 占叶过氧
化物酶(P O D) 总酶活性的3 . 14 % 。 以凝胶过滤和离子交换层析分离纯化得到一分子量为 62 kD a的质外体过氧化物酶 , 其
衬 H ZO Z 的表观Km 值为 1 . 3 ~ 。卜L
一’, 表观味、值为 189 . 3 u. m g , (蛋白); 对愈创木酚的表观Km 值为 1 . 78 ~ ol. L

, , 表观
味 :值为 21 5 . 26 U. m g 一 ‘(蛋白 )。 在蛋白质浓度为 10 m g m L 一 ,时 , 其热滞活性为 0 , 3犯 ℃ 。 此种蛋白的酸性氨基酸含量和亲
水性氨基酸含量较高 , 类似于沙冬青和黑麦的抗冻蛋白 。
关键词 : 过氧化物酶 ; 抗冻蛋白 ; 质外体 ; 女贞
A n A PoPla sti e Pe r o对d a se w ith T h e r m a lH yste re ti c A c ti 城ty P u r ifi ed fr o m L e a v es
o f L ig u s tr u m lu c id比m A it .
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2 1 4 122
,
Ch i
n a ; :Ji a娜 u Ha n b o n sc ien e e & Te e hn o l。邵 , Co . Ltd, Hu a i ’a n , Jia n岁u 22 J0 01 , Ch in a
A b str a c t : An
aPo Pla stic Pr o tein w a s iso la te d b y so a ki n g a n d e en tr ifu g a tio n
,
its e o n te ni w a s ab o ut 1
.
6% o f the
to ta lle af Pr o te in
.
T h e a c tiv ity o f the aP o Pla stie Pe ro
x id a se w a s a bout 3
.
14% o f the tot a l le a fPer o x id a se
.
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.
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Pr o tein s in A m m op iPta
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e a le e e re a le
.
K ey wo
r d s : Per o x ida se ; a ni ifr e ez e Pr o te i
n : aPo Pla st : Lig us tr
u m lu c idu m
植物的质外体由细胞壁及其间隙中的液相和
气相空间组成 , 细胞壁是其主要组成部分(Al be rts
等 1 9 83 )。 因此 , 人们一般将质外体视为一种刚
性的 、 无生命活力的结构 , 其功能是保持细胞形
状 、 进行水分等物质运输 、 防御病原侵入等 。 近
年来 , 随着质外体物质分离技术和质外体研究方
法的建立和发展(王震宇等 19 99) , 已在质外体中
分离得到许多酶和蛋白质 , 同时质外体在植物生
长发育中的更多作用也逐步得到阐明(Li 等 19 89 ;
C 6 rd o b a

Pe d re g o sa 等 19 96 : 孙大业 2 0 0 0 ; St6 hr
和 U llrie h 2 0 0 2 ; D e Pin to 和 o e G a r a 2 0 0 4 )。
植物的抗冻性机制有多种 , 其中抗冻蛋白的
作用很重要 。 目前已从一些越冬草本植物质外体
中分离得到不少抗冻蛋白(A n tik a in e n 等 1 9 9 6 ;
Pud ne y等 2 003 ) , 这些蛋白能改变冰晶正常生长
的模式和降低溶液结冰温度(Pu dn ey 等 2 0 0 3) 。 费
云标等(1994) 也从木本植物沙冬青中分离得到抗冻
蛋白 , 并明确其有降低冰点的作用 。 A nt ikai ne n
等(1 99 6) 在冬黑麦的叶片质外体中发现 7 种多肤 ,
其中有6种从S D S聚丙烯酞胺凝胶中洗出后表现出
高的抗冻活性 。 用氨基末端序列比较 、 免疫交叉
反应 、 酶活性分析发现 , 这些多肤与 3 类病原相
关蛋白(内几丁质酶 、 葡聚糖酶和类似 th a~ tin 的蛋白)相似(H on 等 1 9 95) 。 这些多肤的氨基酸组成
也很相似 , 均富含 A spzA sn 、 G I川G ln 、 s er 、 T hr 、
G ly 和 A la 。 这些现象都说明质外体的一些蛋白可
能具有 2 种或 2 种以上的生物学功能 。
收稿
资助
2 0 0 7

0 9

3 0 修定 2 0 0 8 一0 1 一0 3
江南大学人才引进基金(0 。6 6 2 6 ) 。
通讯作者(E 一m a il : li a o x i a n g r u @ 1 6 3 . e o m ; T e l :
1 3 7 7 1 1 0 4 5 9 6 )

植物生理学通讯 第 4 卷 第 1 期 , 20 08 年 2 月
过氧化物酶印er ox ida se , POD )分布于植物细
胞的叶绿体 、 液泡 、 过氧化物酶体 、 质外体等
不同亚细胞结构中 , 并有不尽相同的生物学功
能 , 其中叶绿体过氧化物酶能够清除Mehi er 反应
产生的过氧化氢(A sa da 和 T a k ahe shi 1987 ); PO D
对底物的专一性也因其种类不同而有所不同 , 一
般可分为卤素 PO D 、 愈创木酚 P O D 、 木质素
PO D
、 锰 PO D 和抗坏血酸 PO D 等 , 如在液泡中
就有一种以抗坏血酸为专一性底物清除过氧化氢的
p O D (R o s

B a re e l6 等 1 9 9 1 ; p a ris h 1 9 7 5 ;
T a ka h
am 和 E g
a shir a 199 0
,
199 1)
。 质外体 PO D
一般 以过氧化氢和酚类物质为底物(P fa n z 等
199 0 ; M ar e
mow
ski 和 G riseb a ch 1 9 7 5)属于愈创木
酚 Po D 类(e a stillo 和 G re p p in 19 86 ; C a stillo 等
1 9 5 4 ; Pe te rs 等 1 9 8 9 ; S e hlo p 等 19 8 7 ; Z h e n g
和 v a n H u ys te e 1 9 9 1), 有些研究者认为质外体
Po D 也能催化抗坏血酸氧化(D e p in to 和 D e G a ra
20 04 )
, 抗坏血酸可能参与使该酶催化反应的产物
还原而影响其催化反应 , 它们均参与催化细胞壁
组分交联 , 因而认为与植物细胞壁的形成和木质
化有关(B o lw ell 1 9 85 ; F叮 19 8 6)。 在研究女贞抗
冻蛋白过程中 , 我们从女贞叶中分离得到一种具
有热滞活性的质外体 PO D , 暗示植物质外体 POD
也具有抗冻蛋白质特征 。
材料与方法
6
.
5) 溶解质外体蛋白冻干粉 , 上 S e p h a d e x G -
10 0FF凝胶柱(1 . 6 e m x 60 em) , 用凝胶柱平衡液
洗脱 , 流速为 I ln L . m in 一 , , 收集速度为 3 管 · h‘’。
取具有 PO D 活性的部分 , 对 D EA E 一D E 52 阴离子
交换柱平衡斌20 n l r OI.L ‘Tri s一HC I缓冲液 , PH 8 . 0)
透析过夜后上 D E A E 一D E 5 2 阴离子交换柱(2 . 0
cm ‘20 c m)
, 再用 D EAE 一D E 52 阴离子交换柱平衡
液洗去未结合蛋白质 , 用 O一 1 m ol ·L 一 , N aCI 梯度
洗脱(流速为 1 m L m in 一 , , 收集速度为 3 管 · h一 , ) 。
POD 活性用用愈创木酚法(A且坦幼等 19 94) 测
定 , 反应温度为 30 ℃ , 将每而n 催化产生 1 林Ino l
产物的酶量定义为 1个酶活单位(U )。 同工酶用 7%
聚丙烯酞胺凝胶进行凝胶电泳 , 电泳条件及 PO D
活性染色同文献(廖祥儒等 199 9) 。 蛋白质含量测
定按 B r a d fo r d (1 9 7 6 )方法 , 采用 12 % Sn S -
PA G E
、 考马斯亮蓝 R 一2 50 染色 , 以 Fen n e n ta s 生
产的标准蛋白鉴定蛋白质分子量(汪家政和范明
2 0 0 0 ; 李志强等 2 0 0 7 ) 。
蛋白质热滞活性(th e rm a l hyste re tie a e tiv ity ,
T HA )的测定参考刘尚等(2 00 7) 文中的方法 。 提纯
的蛋白质委托江南大学分析测试中心测定氨基酸组
成 , 用 日立 8 3 5 一 5 0 氨基酸 自动分析仪分析 。
所有数据均来自 3 次独立实验 , 并各重复 4
次 。 采用 S PS S H . 5 进行数据分析 。
实验结果
女贞(L lg u s如m lu c idu m A it. )树叶采自江南大
学校园 , 自来水洗净后用打孔器将叶片打成直径
为 1 c m 的圆片 。 再用重蒸水清洗叶圆片 6 次 , 以
去除因细胞破损而泄漏的胞内蛋白。 将洗好的叶
片浸泡于含有20
~
卜L , 抗坏血酸和 20
~
l. L

,
c aCI
: 的溶液中用循环水真空泵抽气 30 ~
, 以排
出质外体中的空气 , 使溶液充满质外体空间 。 将
叶片取出 , 用滤纸吸干表面水分后装入大小适宜
的塑料注射器中 , 小口朝下放入 5 0 m L 离心管
内, 在 2 5 oC 下 , 以 3 so o x g 离心 2 0 m in 。 收集
流出的液体即为质外体蛋白粗提液 , 经透析后冻
干备用(T a ; g in 等 2 0 0 6) 。
纯化质外体 PO D 时 , 先用 SeP ha de x G 一 10 FF
凝胶柱平衡液(2 0
~
卜L 一 , Tr is 一H cl 缓冲液 , pH
1 女贞叶质外体蛋白含量及 PO D 活性
女贞叶质外体蛋白质含量为29 . 8 林9 9 , (Fw ),
其 Po D 活性为 o . 1 2 2 U · g 一 , (Fw ); 其中质外体蛋
白占叶片总蛋白的 1 . 63 % , PO D 活性占叶片总酶
活性的 3 . 15% (表 l)。
2 女贞叶质外体 PO D 的纯化
冻干的质外体蛋 白以柱平衡液溶解后过
表 l 女贞叶质外体 PO D 的蛋白含量和活性
T a ble 1 A e tivity a n d Pr o te in e o n te n t o fap op la sti e
PO D in le洲e s o f L . lu e id u m
材料 蛋白质含量枢g ·g 一 , (FW ) p o D 活性用侣‘ , (FW )
叶片
质外体
1 8 2 6士 3 4 5
2 9
.
8士 5 3
3
.
8 7 1士 0 . 7 2 6
0
.
1 2 2土 0 . 0 2 5
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 1 期 , 2 0 0 8 年 2 月
seP ha de x G

lo 0F F 凝胶柱 , 可使蛋白质分为三个
部分(图 l) 。 经检测 , 蛋白质峰 2 具有 PO D 活性 ,
因此可应用离子交换树脂进一步纯化 。
通幽 一
醉活 .
子量约为 62 kD a , 非变性 PA G E 电泳同工酶染
色 , 显示其也有 PO D 活性(图 3 )。 这说明经过凝
胶柱层析一步分离 , 即可得到女贞叶质外体蛋白
中的单一的PO D 蛋白 , 纯化倍数可达 4 . 3 倍 , 回
收率为 5 7 . 1% (表 2) 。
灵坦鹉住604D
寻 0 · 0 8
0 如. ‘ . 口五es se ~ es 习. . . . . . . - 司 0
0 10 2 0 30 4 0
收集管号
图 1 女贞叶质外体 PO D 凝胶过滤图谱
Fig
.
1 G el fi itra tio n eh ro m a to gr aPhy o f aPo Pla stie PO D
in leav e s o f L
.
lu e id u m
经过 D EA E 一D E 52 阴离子交换柱分离 , 该部
分蛋白质只有一个峰(图 2) , 说明这个部分的蛋白
质可能只有一个 。 SD S PA G E 分析显示该蛋白分
曰·工昌\侧说嘴Z0”匕,山⋯n‘, .人‘.
0
· ’2
{溉‘二
图 3 女贞叶质外体 PO D 电泳图谱
Fig 3 D iag ra m o f PA G E o f aPo Pla stic PO D
in le a v e s o f L
.
lu c id u m
a : S D S

P A G E
, 考马斯亮蓝染色 , 箭头所指为质外体
PO D ; b : 非变性 PA G E , 质外体 PO D 过氧化物酶活性染色。
.沪尸尸 10
.
5
0
.
4
0
0 2 0 4 0 6 0 8 0
收集管号
10 0 1 2 0 1 40
图2 女贞叶质外体 PO D 离子交换层析图谱
Fig
.
2 Io n e x e ha n g e e h ro m a to g raPhy o f aPo Pla s tie PO D
in leav e s o f L
.
lu c id u m
3 女贞叶质外体 PO D 的部分性质
以不同浓度的过氧化氢和愈创木酚为底物 ,
在 p H 7 . 0 、 3 0 ℃条件下测定女贞叶质外体 PO D
活性 , 用双倒数作图法求得该酶对 H ZO : 的表观Km
值为 1 . 3 ~ ol
·
L
一 ’, 表观 Vm a 、 值为 189 . 3 U. m g 一’
(蛋白) (护= 0 . 9 994) 。 采用相同方法测定底物愈创
木酚的表观Km 值为 1 . 78 ~ ol. L

, , 表观嵘 、值为
表 2 女贞叶质外体 PO D 的分离纯化
T a b le 2 P u ri fi e a tio n o f ap o Pla st ie p O D in leav e s o f L
.
lu c id u m
处理 总蛋白含量 / m g 总酶活性 /U 比活力 /U ·m g 一 , (蛋白) 纯化倍数 回收率 /%
粗酶液
s e p ha d e x o

1 ooFF凝胶过滤
6 6 5
3 8 0
4 2
1 8 1
1 0 0
.
0
5 7
.
1
2 15
.
2 6 U
·哩一’(蛋白) (R Z = 0 . 9 9 9 3 ) 。
将质外体 Po D 配制成 10 mg ·mL
一’的酶液 , 用
热差分析仪检测分析 (表 3) 可见 , 随着停留温度
(T h) 的升高 , 起始温度 (T o) 也升高 , 但溶液的冰
晶含量明显降低 , 而 TH A 则在 Th 小于 一0. 2 ℃时
无明显变化 , 达到 一 0 . 2 ℃ 时明显增加 , 暗示其
T H A 值应在 0 . 332 ℃左右 。
质外体 PO D 经酸水解后 , 用 日立 8 3 5 一50 氨
植物生理学通讯 第 44 卷 第 1 期 , 20 08 年 2 月
表 3 部分熔融重冻结条件下女贞叶质外体PO D
的 T o 、 T h 、 冰晶含量和 T H A
Tab le 3 T o
,
Th
,
ie e e o n tent c ry stal
,
an d TH A o f aP o Pla stic
PO D in le a ve s o fL lu c idu m u n d e r d ifl飞re n t th aw in g a n d
re fr e e Z in g e o n di ti o n s
T hl℃ T o/ ℃ 冰晶含量 /% T H A / ℃
一 0
.
5 一 0
.
6 1 2 3 9 0
.
1 12
一 0
.
4 一 0
.
5 3 8 2 8 0
.
1 3 8
一 0
.
3 一 0
.
4 2 1 2 2 0
.
1 2 1
一 0
.
2

0
.
5 3 2 1 3 0
.
3 3 2
一 0
.
1 一 0
.
4 7 9 7 0
.
3 7 9
基酸自动分析仪分析可以看出(表4) , 其A sP 和G fu
等酸性氨基酸含量明显高于碱性氨基酸 A rg 、 Ly s
和 H is , 暗示其等电点为弱酸性 。 此蛋白中亲水
性氨基酸总量也明显高于疏水性氨基酸 , 说明其
亲水性强 。 这些特点均较接近沙冬青抗冻蛋白
a rn A FPZs (王维香等 2 00 7)和 a m A Fp 40 (魏令波等
19 9 9) 以及冬黑麦质外体抗冻多肤(G r if ith 等
19 9 7)
。 但从这几种蛋白的氨基酸具体组成来看 ,
女贞质外体 PO D 中的A sP 、 H is 和 Leu 明显较其
他两种蛋白的高 , 而 S e r 含量较低 。
表 4 女贞叶质外休 PO D 的氨基酸组成
T ab le 4 M o lar e o m po sitio n o fam in
o a e id o f th e aP o Plas tic PO D in le av e s o f L
.
lu e才d u m
m olo/
沙冬青抗冻蛋白 黑麦质外体抗冻蛋白
氨基酸残基 女贞质外体 PO D
am AFP2 8 3 6 kD a 3 4 kD a 3 2 k D a
2 2 2 0
8
.
8 3
3
.
4 2
3
.
0 0
9
.
2 8
3
.
1 1
3
.
2 1
8
.
1 1
1
.
0 3
0
.
3 2
4
.
4 1
2
.
1 3
5
.
4 6
4
.
8 1
1 1
.
9 0
2
.
8 7
4
.
9 1
13
.
8 0 1 0
.
6 6
8
.
3 5 7
.
4 0
1 1
.
7 0 8
.
2 0
0 1
.
8 9
9
.
9 0 1 0
.
0 1
5
.
9 0 9
.
0 5
0 8 3 1
10
.
1 0 9
,
3 1
1
.
0 0 2
.
9 7
一 1 . 6 7
8
.
5 0 4
.
7 4
0 1
.
0 4
5
.
3 0 3
.
3 3
6
.
3 0 3
.
1 3
6
.
4 0 4
.
14
2
.
6 0 4
.
3 6
6
.
0 0 3
.
1 5
1 2 2 5
8 30
9 6 1
0
1 2
.
5 9
7
.
17
5
.
3 3
1 0
.
0 7
4
.
8 0
1 4
.
5 9
7
.
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8
.
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6
.
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.
5 6
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.
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12
.
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.
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12
.
3 0
3
.
8 0
5
.
2 6
0
.
7 5
3
.
8 2
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.
10
5
.
12
5
.
3 0
2
.
2 3
3
.
8 6
3
.
6 0
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.
5 5
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2 8
1
.
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3
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.
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.
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.
5 5
7
.
5 7
2 0 5
6
.
7 0
S
AsPGluerHiyThrgaCy-V湘eIleLvo
讨 论
质外体多肤及蛋白除参与植物生长发育外 ,
其在植物胁迫反应中的功能也越来越受到重视 。
植物质外体的一些蛋白参与植物抗病反应(T o de l
等 19 9 8 ; S e litr e n n ik o f 2 0 0 1)和非生物逆境的反
应 , 在逆境胁迫下植物的许多质外体多肤的基因
表达明显均受到影响 , 其中的一些蛋白既有葡聚
糖水解酶等酶 的活性 , 也有抗冻蛋 白的特 征
(Y a ish 等 2 0 0 6 )。
从女贞叶质外体 PO D 几有热滞活性来看 , 质
外体 PO D 可能不仅参与植物细胞壁的建成过程与
抗氧化胁迫 , 还具有抗冻作用 。 尽管这种 PO D 的
分子量(6 2 kD a) 大于一般的抗冻蛋白, 但其氨基
酸组成比较接近植物抗冻蛋白。 其中含大量的亲
水性氨基酸和较高的 G ly 、 A la 。 高度的亲水性的
细胞可以获得充足的水分 , 从而可有效地阻止由
于冰冻或是水胁迫引起的局部缺水 。 而 G ly 和Al a
空间位阻较小 , 因而蛋白具有高度柔性 , 可保护
植物生理学通讯 第4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月 4 9
大分子或细胞结构免受冰冻或是严重脱水的伤害 。
但其分子结构特征和作用机制还待研究 。
参考文献
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