全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 399
油菜素内酯合成酶(Steroid 5α-Reductase)基因的超量表达对毛白杨生长的
影响
邓伟 1,2,*，吕立堂 2,4，罗克明 3，李义 2
1重庆大学生物工程学院基因工程中心，重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室，重庆 400044；2美国康涅狄格大
学植物科学系，美国 06269；3西南大学生命科学学院，重庆 400716；4贵州大学农业生物工程重点实验室，贵阳 550025
提要：将棉花 Steroid 5α-reductase基因(DET2)超量表达载体导入毛白杨中，观察其对毛白杨生长和芽休眠的影响。结果
表明，超量表达DET2基因的毛白杨茎高度、直径生长和不定根的生长增强，芽的休眠破除提前。
关键词：杨树；超量表达；油菜素内酯合成酶基因(DET2)
Effect of Overexpression of Steroid 5α-Reductase Gene on Growth of Populus
tomentosa Carr.
DENG Wei1,2,*, LÜ Li-Tang2,4, LUO Ke-Ming3, LI Yi2
1Key Laboratory of Functional Gene and Regulation Technologies under Chongqing Municipal Education Commission, Genetic
Engineering Research Center, Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400044, China; 2Department of Plant
Science, University of Connecticut, CT 06269, USA; 3School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 4Key
Laboratory of Agricultural Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: Plant expression vector containing cotton steroid 5α-reductase gene (DET2) was transferred to
Populus tomentosa and the growth of transgenic plants were measured. Overexpression of DET2 gene improve
the growth of stems and roots in Populus tomentosa. DET2 gene also promote the dormancy break of transgenic
plants.
Key words: Populus tomentosa; overexpression; steroid 5α-reductase gene (DET2)
收稿 2007-12-17 修定 2008-05-06
* E-mail：denwei0718@163.com；Tel：023-65120485
油菜素内酯(brassinosteroid，BR)在植物茎秆
伸长、花粉管生长、叶伸展、维管细胞的分化、
细胞伸长、细胞分裂以及逆境胁迫适应能力都具
有重要调节作用(Yamamoto等 1997)。近年来，人
们通过甲基磺酸乙酯(EMS)和 T-DNA插入以及转
座子插入等方法获得了一系列与油菜素内酯生物合
成有关的突变体，基本上弄清了植物体内油菜素
内酯的生物合成途径。同时依据这些人工突变体
鉴定了多个油菜素内酯生物合成酶基因，如
DET2 (Li等 1996；Noguchi等 1999)、DIM1 (Choe
等 1999)、CPD (Szekeres等 1996)、DWF4 (Choe
等 1998)、DWF5 (Choe等 2000)和DWF7 (Choe等
1999)。油菜素内酯生物合成途径研究的结果表
明，拟南芥DET2基因能催化(24R)-24-甲基 -胆
甾基 -4-烯 -3-酮到(24R)-24-甲基 -5α-胆甾烷 -3-
酮的 5α还原反应，是 BR生物合成途径的重要限
速酶(Li等 l996；Noguchi等 l999)。Chory和 Li
(1997)报道，将DET2基因在拟南芥中超量表达后
其转基因植株的生长量显著提高。
杨树生长迅速，适应性强，是严格的异交树
种和植物纤维的重要来源。杨树基因组小，仅为
拟南芥基因组的 4倍，比松属植物小 40倍，与
水稻类似。杨树再生能力强，易于无性繁殖和遗
传转化，已经构建了较饱和的遗传连锁图谱，并
获得了大量的与目标性状相关的分子标记(张勇等
2006)。目前，以毛果杨为材料的杨树基因组计
划已经完成。杨树因这些特性已成为研究多年生
植物生长和基因功能研究的模式植物(Brunner等
2004)。为了研究 DET2基因在杨树生长中的功
能，本文将棉花DET2基因超量表达载体导入毛
白杨，研究其转基因植株根和茎的生长以及休眠
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月400
的破除。
材料与方法
杨树(Populus tomentosa Carr.)品种为‘741
毛白杨’。根癌农杆菌菌株 LBA4404 (SMr)由本
实验室保存。棉花DET2基因超量表达载体 pSH-
DET2由西南大学罗明先生提供(图 1)。
Pharmacia Biotech公司。
总 RNA提取用 TRIzol试剂(Promaga USA)按
说明操作进行。以反转录产物为模板进行 R T -
PCR，以杨树肌动蛋白 Actin基因为内标，扩增
D E T 2 基因。引物序列分别为 A c t i n：A1，5
GAACTACGAGCTTCCTGATG 3；A2，5 AT-
AGTGGAACCACCACTGAG 3。DET2：D1，5
GGTTTTCCAGTGAGTGTAGC 3 ；D2，5
CAGTCCCACCAACACTTTAT 3。
反应条件为 94 ℃，5 min，l个循环；94 ℃，
30 min，60 ℃，30 s，72 ℃，30 min，40个循环；
72 ℃，10 min。
将扦插苗移栽到温室土壤中，第70天时测量
杨树茎高度、节间数量和茎的直径，茎的直径以
1/2高度处的节间直径为依据进行测量。同时测定
转基因植株的生物量，先测定转基因植株的根、
茎(包括叶)的鲜重，然后将植物的根、茎(包括
叶)放置于 80 ℃干燥箱中干燥 48~72 h，当恒重
时，测定根和茎的干重。观察转基因植株休眠的
情况，先于 2005年 9月将生长在温室中的转基因
杨树植入大田(美国康涅狄格大学试验田)，每个
转基因株系均取 4~5个植株，过冬后于 2006年 4
月观察，照相。
结果与讨论
1 转基因杨树的获得
用含有 pSH-DET2质粒的农杆菌菌液浸染毛
白杨叶盘，通过卡那霉素筛选获得卡那抗性植株
49株，移栽到温室土壤中，经过 30 d的生长，
一些抗卡那霉素的植株表现出了比非转基因对照更
良好的生长趋势，选取有代表性的 4株植物，进
行分子表达分析，以确定是否为转基因株系。我
们进行了基因组 Southern杂交，结果表明 4株转
化植株都有杂交条带，而非转化植株没有杂交条
带，表明DET2基因已经整合到杨树基因组上(图
2-a)。转基因植株 D-4和D-15有 1条杂交条带，
D-5和D-10株系有 3条杂交带，因为DET2基因
序列没有HindIII酶切位点，所以初步证明植株D-
4和D-15为单拷贝，D-5和D-10株系为 3个拷贝。
为了进一步验证外源基因DET2的表达情况，我
们又进行了RT-PCR，结果DET2基因在转基因植
物中都有不同程度的表达，而非转基因植物则否
(图 2-b)。这些表明外源基因DET2已整合到植物
将-80 ℃下保存的含 pSH-DET2质粒的农杆
菌菌株 LBA4404接种到附加 50 mg·L-1卡那霉素
( k a n a m y c i n，K m )和 1 2 5 m g · L - 1 链霉素
(streptomycin，SM)的YEB培养基平板上，于 28
℃条件下培养 2 d后挑取农杆菌单菌落，接种于
含相应浓度抗生素的5 mL YEB液体培养基中，28
℃下振荡培养过夜。次日取培养过夜的农杆菌菌
液按1:50的比例转接到50 mL不含抗生素但添加乙
酰丁香酮(acetosyringone，AS)的液体YEB培养基
中，继续培养 3~5 h，OD600值达到 0.8时取出备
用。
取温室中生长的毛白杨枝条顶端叶片，先用
去离子水冲洗干净，放入 2%次氯酸钠溶液浸泡
消毒 10 min，无菌水清洗 3次。转化按照Dai等
(2003)方法进行。选取根系生长良好，长约 6 cm
的小苗，幼苗根部培养基清洗干净后，移栽到温
室土壤中培养。所有植物培养均在 24~26 ℃，16 h
光照 / 8 h 黑暗光周期，光照强度为 2 0 0 ~ 3 0 0
µmol·m-2·s-1中进行。
转基因植物基因组DNA提取根据改良CTAB
法进行(Stewart和Via 1993)。Southern杂交分析
按照 Sambrook等(1989)方法进行。将提取的基因
组DNA用HindIII酶切，酶切产物经 1%琼脂糖
电泳分离后转移至尼龙膜上，用探针制备试剂盒
标记DET2基因 cDNA为探针，进行杂交。杂交
用尼龙膜和探针制备试剂盒购自 A m e r s h a m
图 1 植物表达载体 pSH-DET2
Fig.1 Construct for plant transformation of pSH-DET2
超量表达载体 pSH-D ET 2 的 T-D NA区域。35 S：来源于
花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；N O S：冠瘿碱合成酶
基因终止子；G US: :N PTI I：新霉素磷酸转移酶基因和葡萄糖
酸苷酶基因的融合基因。
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 401
基因组中并能表达，显示筛选的 4株植物是过量
表达 DET2的转基因株系。
从图 2-a可以看出，4个转基因株系DET2表
达水平有明显的差别。前人的研究表明，外源基
因在受体植物的基因组内的插入位点不同会造成转
录活性的差异(Gelvin 1998)。此外，外源基因在
受体植物基因组中的拷贝数也会对基因表达水平产
生影响。如图 2-b所示，D-10和D-5有 3个拷贝
数，D-15和D-4有 1个拷贝数。株系D-10和D-
5外源基因的表达水平比D-15和D-4高。
2 表达DET2基因对杨树生长的影响
从表达 35S::DET2的转基因植株中选取株系
D-4、D-5、D-10和 D-15，扦插扩繁，扦插苗
生根以后，移入温室土壤中培养，70 d后测定转
基因植株茎高度、节间数量和直径的结果表明，
转基因株系的高度和直径生长明显优于非转基因植
株(图 3、表 1)。转基因植物节间数量明显增多(表
1)，表明植株高度的增长主要是由于节间数量增
加造成。此外，转基因植株的不定根系也表现出
较强的生长能力，根系发达，数量多，说明表
表 1 转基因和非转基因毛白杨生长和干鲜重的比较
Table 1 Comparisons on growth and fresh and dry weights of transgenic and nontransgenic P. tomentosa

株系 茎高度 /cm 茎直径 /mm 节间数量
　 鲜重 /g 干重 /g
茎　　　 根 茎　　　 根
WT 64±3.2 4.6±0.1 23±3 23.5±2.3 20.7±1.4 4.1±0.3 3.5±0.4
D-4 68±2.3 4.8±0.3 26±3 28.1±3.2 24.2±2.0 4.4±0.2 3.9±0.3
D-5 75±3.5** 5.5±0.2** 35±4** 33.7±3.6** 31.6±0.5** 5.7±0.6* 5.2±0.5**
D-10 72±4.0* 5.1±0.3 33±2** 31.1±4.1* 29.1±1.9** 5.2±0.9* 4.8±0.4**
D-15 67±1.9 4.9±0.2 27±3 27.4±2.6 25.0±1.7 4.6±0.5 4.0±0.4
　　数据为 3 个转基因植株的平均值 ±SD。*代表转基因与非转基因杨树之间的 t检验差异显著(P<0.05) ；**代表差异极显著(P<
0 . 0 1 )。
图 2 转基因植株的分子验证
Fig.2 Molecular analysis of transgenic plants
a：转基因植株的 Sou ther n b l o t t i ng 检测。D-4、D-5、
D-10和 D-15 分别表示转基因株系 D-4、D-5、D-10 和 D-15；
阳性对照为 pSH-DET2质粒；WT 表示非转基因植株。b：RT-
PCR 检测 DET2 基因表达情况。杨树肌动蛋白 Act in 基因作为
RT -P CR 反应的内标。
图 3 转基因和非转基因毛白杨生长的比较
Fig.3 Comparison on growth of transgenic
and nontransgenic P. tomentosa
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月402
达DET2基因可促进不定根的生长。RT-PCR检测
发现 4株转基因植株中D-10和D-5外源DET2基
因的表达水平较高，D-4和D-15较低。如表 1所
示，株系 D-10和 D-5在茎高度、直径以及根系
生长上都优于株系D-4和D-15，表明外源DET2
基因表达水平与转基因植株生长具有一定正相关
性。在以后的实验中需要分析更多转基因株系表
型变化和DET2基因表达水平，以验证这一结论。
前人的研究表明，外施 BR可以促进幼苗的
茎、豌豆和绿豆的上胚轴、黄瓜下胚轴、单子叶
植物的胚芽鞘和中胚轴等的伸长(Mandava1988)。
在拟南芥中超量表达 BR生物合成的一个关键酶
D W AR F 4 基因，促进了植株的生长( C h oe 等
2001)。Chory和 Li (1997)在拟南芥中超量表达
DET2基因，显著提高了转基因植株茎生长。BR
不仅可以促进植株节间的伸长，也可以促进茎节
间的分裂，提高节间数量(Grove等 1979)。我们
的结果也表明内源表达DET2基因促进了转基因植
株的节间数量的增加。
B R 对植株根系的影响与剂量有关。0 . 1
µmol·L-1 表油菜素内酯(eBL)抑制了拟南芥和番茄幼
苗根系的生长(Clouse等 1993)。更低浓度 eBL的
应用却促进了根系的生长(Müssig等 2003)。在植
物根系的起始和生长中，生长素发挥了重要的作
用(Laskowski等 1995)。IAA通过极性运输从植物
的茎转移到根部，促进了根原基的发生和侧根的
形成(Bhalerao等 2002)。BR可以调控负责生长素
极性运输相关基因的表达(Li等 2005)。Bao等
(2004)研究发现，在根中BR促进了生长素向根尖
运输，BR和生长素协同促进了拟南芥侧根的形
成。我们的研究发现表达DET2基因促进毛白杨
不定根的生长。表明内源表达DET2基因可能提
高了植物体内 BR的浓度，BR和生长素协同作用
促进了根系的生长。
进一步测定转基因植株根和茎干鲜重的结果
(表 1)表明，超量表达DET2基因的转基因植株茎
和根的干鲜重均比非转基因植株的有明显提高。
这些说明DET2基因表达可以促进转基因杨树茎和
不定根系的生长。
3 DET2基因表达对破除芽休眠的影响
转基因毛白杨植株上的芽在大田中经过 1个
冬天的休眠后，于 2006年 4月 3日开始萌发第 1
个腋芽。而非转基因植株在 4月 9日才开始萌发
第 1个腋芽。非转基因植株茎基部萌发出 5~6个
腋芽，每个芽大约形成 2~4片刚展开的幼叶时，
转基因植株的全株的芽均已萌发，且芽的叶片已
经充分展开，比非转基因植株明显增大(图 4)。
植物在冷、热、干、湿季节变化很大的气
候条件下，种子或芽会进入休眠状态。脱落酸
(ABA)普遍认为是主要的植物休眠促进物和发芽
抑制物(Piola等 1998)。Steber和McCourt (2001)
报道外源施加 BR可以解除拟南芥种子休眠，促
进种子萌发，BR还可以缓解脱落酸对种子萌发
的抑制作用。我们的研究表明，超量表达 BR合
成基因 DET2可促进毛白杨芽休眠的打破，其原
图 4 转基因与非转基因植株上腋芽萌发的比较
Fig.4 Comparison on germination of axillary buds in transgenic and nontransgenic plants
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 403
因可能与超量表达 DET2基因可缓解脱落酸对芽
萌发的抑制作用有关。对此，今后尚须进一步
对转基因植株芽中脱落酸和 BR的含量进行测定
和研究。
参考文献
张勇, 张守攻, 齐力旺, 陈小强, 陈瑞阳, 宋文芹(2006). 杨树——
林木基因组学研究的模式物种. 植物学通报, 23: 286~293
Bao F, Shen J, Brady SR, Muday GK, Asami T, Yang Z (2004).
Brassinosteroids interact with auxin to promote lateral root
signaling and lateral root development in Arabidopsis. Plant
Physiol, 134: 1624~1631
Bhalerao RP, Eklöf J, Ljung K, Marchant A, Bennett M, Sandberg
G (2002). Shoot-derived auxin is essential for early lateral
root emergence in Arabidopsis seedlings. Plant J, 29: 325~
332
Brunner AM, Busov VB, Strauss SH (2004). Poplar genome
sequence: functional genomics in an ecologically dominant
plant species. Trends Plant Sci, 9: 49~56
Choe S, Dilkes BP, Fujioka S, Takatsuto S, Sakurai A, Feldmann
KA (1998). The DWF4 gene of Arabidopsis encodes a cyto-
chrome P450 that mediates multiple 22 alpha-hydroxyla-
tion stepsin brassinosteroid biosynthesis. Plant Cell, 10:
231~243
Choe S, Fujioka S, Noguchi T, Takatsuto S, Yoshida S, Feldmann
K A ( 2 0 0 1 ) . O v e r e x p r e ss i o n o f D W A R F 4 i n t h e
brassinosteroid biosynthetic pathway results in increased
vegetative growth and seed yield in Arabidopsis. Plant J, 26:
573~582
Choe S, Noguchi T, Fujioka S, Takatsuto S, Tissier CP, Gregory
BD, Ross AS, Tanaka A, Yoshida S, Tax FE et al (1999). The
Arabidopsis dwf7/ste1 mutant is defective in the ∆7 sterol C-
5 desaturation step leading to brassinosteroid biosynthesis.
Plant Cell, 11: 207~221
Choe S, Tanaka A, Noguchi T, Fujioka S, Takatsuto S, Ross AS,
Tax FE, Yoshida S, Feldmann KA (2000). Lesions in the
sterol ∆7 reductase gene of Arabidopsis cause dwarfism due to
a block in brassinosteroid biosynthesis. Plant J, 21: 431~443
Chory J, Li J (1997). Plant steroid 5 alpha-reductase, det2. United
States Patent 6352846
Clouse SD, Hall AF, Langford M, McMorris TC, Baker ME (1993).
Physiological and molecular effects of brassinosteroids on
Arabidopsis thaliana. J Plant Growth Regul, 12: 61~66
Dai WH, Cheng ZM, Sargent W (2003). Plant regeneration and
Agrobacterium-mediated transformation of two elite aspen
hybrid clones from in vitro leaf tissues. In Vitro Cell Dev Biol
Plant, 39: 6~11
Gelvin SB (1998). The introduction and expression of transgenes
in plants. Curr Opin Biotechnol, 9: 227~232
Grove MD, Spencer GF, Rohwedder WK, Mandava NB, Worley
JF, Warthen JD, Steffens GL, Flippen-Anderson JL, Jr Cook
J C (1 97 9 ) . Brassinol ide , a p lant growth-promoting
steroidisolated from Brassica napus pollen. Nature, 281:
216~217
Laskowski MJ, Williams ME, Nusbaum HC, Sussex IM (1995).
Formation of lateral root meristems is a two-stage process.
Development, 121: 3303~3310
Li J, Nagpal P, Vatart V, McMorris TC, Chory J (1996). A role for
bra ssinosteroids in l ight -dependent development of
Arabidopsis. Science, 272: 398~401
Li L, Xu J, Xu ZH, Xue HW (2005). Brassinosteroids stimulate
plant tropisms through modulation of polar auxin transport
in Brassica and Arabidopsis. Plant Cell, 17: 2738~2753
Mandava NB (1988). Plant growth-promoting brassinosteroids.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 39: 23~52
Müssig C, Shin GH, Altmann T (2003). Brassinosteroids promote
root growth in Arabidopsis . Plant Physiol, 133: 1261~
1271
Noguchi T, Fujioka S, Takatsuto S, Sakurai A, Yoshida S, Li J,
Chory J (1999). Arabidopsis det2 is defective in the conver-
sion of (24R)-24 methylcholest-4-en-3-one to (24R)-24-
methyl-5α-cholestan-3-one in brassinosteroid biosynthesis.
Plant Physiol, 120: 833~840
Piola F, Label P, Vergne P, von Aderkas P, Rohr R (1998). Ef-
fects of endogenous ABA levels and temperature on cedar
(Cedrus libani Loudon) bud dormancy in vitro. Plant Cell Rep,
18: 279~283
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press
Steber CM, McCourt P (2001). A role for brassinosteroids in
germination in Arabidopsis . Plant Physiol, 125: 763~
769
Stewart CN Jr, Via LE (1993). A rapid CTAB DNA isolation tech-
nique useful for RAPD fingerprinting and other PCR
applications. Biotechniques, 14: 748~750
Szekeres M, Németh K, Koncz-Kálmán Z, Mathur J, Kan-chmann
A, Altmann J, Rédei GP, Nagy F, Schell J, Koncz C (1996).
Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90, a cyto-
chrome P450 controlling cell elongation and de-etiolation
in Arabidopsis. Cell, 85: 171~182
Yamamoto R, Demura T, Fukuda H (1997). Brassinosteroids in-
duce entry into the final stage of tracheary element differ-
entiation in cultured Zinnia cells. Plant Cell Physiol, 38:
980~983