全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 31
活性氧不敏感型拟南芥的突变体对H2O2 的响应
何金环1，李利红1，宋纯鹏2,*
1 郑州牧业工程高等专科学校生物工程系，郑州 450011；2 河南大学生命科学学院，河南开封 475001
提要：检测拟南芥ros突变株对H2O2响应的结果表明，此种突变体对H2O2有较强的耐受性，表现为气孔开度对H2O2不
敏感和H2O2胁迫时的膜脂过氧化水平较低。采用激光扫描共聚焦显微术(LSCM)并结合H2O2荧光探针H2DCFDA检测外
源ABA诱导保卫细胞的结果显示，突变体内荧光强度比野生型拟南芥低，暗示此种突变体消除H2O2的能力可能有提高，
从而可增强植株抗氧化胁迫的能力。
关键词：拟南芥；突变体；过氧化氢；激光扫描共聚焦显微术
Response of Reactive Oxygen Intermediates-insensitive Mutant Seedlings in
Arabidopsis thaliana to Hydrogen Peroxide
HE Jin-Huan1, LI Li-Hong1, SONG Chun-Peng2,*
1Department of Bioengineering, Zhengzhou College of Animal Husbandry and Engineering, Zhengzhou 450011, China; 2College
of Life Sciences, Henan University, Kaifeng, Henan 475001, China
Abstract: The result showed that the mutants had stronger resistance to H2O2, the stomatal aperture was not
sensitive to H2O2 and had a lower level of peroxidation of membrane-lipid under the H2O2 stress. Using of the
laser scanning confocal microscopy technique and combining the H2O2 fluorescence probe H2DCFDA to exam-
ine the production H2O2 in guard cell by exogenous ABA, it showed that the fluorescence intensity in the mutant
seedlings was lower than that in wild-type ones. It suggested that the ability of clearing H2O2 of mutant seed-
lings raised, thus the resistance of seedlings to oxygen stress maybe increased.
Key words: Arabidopsis thaliana; mutant; hydrogen peroxide; laser scanning confocal microscopy
收稿 2006-09-04 修定 　2006-12-26
资助 国家自然科学基金(G1999011700)。
*通讯作者(E-mail：songcp@henu.edu.cn；Tel：0378-
2855010)。
活性氧作为植物“第二信使”(Allan和Fluhr
1997；Neuenschwander 等 1995)的研究已成为逆
境生物学研究领域的一个重大理论课题。而作为
信号分子的H2O2 (刘新等2001)在植物细胞中的转
导细节及其与胞内其他信号分子的时空关系还知之
甚少，尤其是 H 2O 2 受体的研究目前仍是空白。
突变体分析是剖析复杂生物学过程的有力工
具，包括拟南芥在内的一些植物突变体已广泛用
于植物发育和代谢途径的研究。用激素突变体研
究激素代谢及其分子机制已有不少成功的例子[如
生长素(Estelle和Somerville 1987)和脱落酸(Hobbie
和Estelle 1994; Ishitani等1997)等的突变体]。同
样，活性氧突变体也可以用于分析氧化信号转导
中各个成分的作用，并进行有关基因表达和调控
的分子遗传学分析，从而为识别和克隆 H2O2 调节
基因以及研究逆境条件下植物生长的调控机制(王
学臣和任海云 1992)提供新的手段。
我们实验室曾采用甲基磺酸乙酯( e t h y l
methanesulfonate, EMS)化学诱变方法和氧化胁迫
(0.1 mmol·L-1 H2O2)选择技术，以重力作用下的弯
曲生长为指标，筛选得到了活性氧不敏感突变体
(reactive oxygen intermediates-insensitive mutant,
ros)。本文进一步分析这一突变体对 H2O 2 的响
应，以期为探讨 H2O2 这一信号分子的代谢途径及
其在信号转导途径中的作用提供直接的实验材料。
材料与方法
野生型拟南芥种子(Arabidopsis thaliana)由美
国亚利桑那大学朱健康教授提供，并从中筛选得
到 ros突变体M3 代种子。种子以75%乙醇表面消
毒 30 s，再以 0.1% 升汞表面消毒 3 min，并用
无菌水冲洗 3 ~ 5 次后，播种于 M S 固体培养基
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(MS+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH 5.7)上，再置于4 ℃
下 48 h，放入培养间[温度为(23±2) ℃，日光灯
光强200 µmol·m-2·s-1，每天16 h光照和8 h黑暗，
相对湿度为 70%]培养。种子萌发 3~5 d 后，对
其幼苗喷洒0.1 mmol·L-1浓度的H2O2。暗处理2~4 h
后，放回培养间。2~3 d 后观察和测定根长，计
算各个培养皿中根长的平均值和标准误。根据实
验方案，取生长 2 周左右、中部完全展开的叶
片，用蒸馏水洗净，撕取下表皮，叶肉细胞培
养在基本缓冲液(50 mmol·L-1 KCl，0.05 mmol·L-1
CaCl2，用 Mes 调 pH 值至 6.3)中，在 23 ℃和光
照下气孔完全张开。然后从基本缓冲液中取出表
皮条，放入不同的处理液[0.1 mmol·L-1 H2O2、100
µmol·L-1脱落酸(abscisic acid, ABA)、100 U·mL-1
过氧化氢酶(catalase, CAT)、100 µmol·L-1 ABA+100
U·mL-1 CAT]中处理。每隔一定的时间检测气孔开
度的变化。气孔开度在 10×40 倍的光学显微镜下
以测微尺测定。每个处理取 3 个表皮条，每个表
皮条取 3 个视野，测 8~10 气孔开度，每个处理
重复 4~6 次，统计其气孔开度的平均值和平行实
验间的方差。叶中丙二醛(malondialdehyde, MDA)
含量测定参照林植芳和李双顺(1984)文中的方法并
略有改动。
测定气孔保卫细胞内H2O2含量时，取生长12
d的拟南芥野生型及其突变体叶片较绿的完全展开
叶片，作以下分析检测：( 1 ) 荧光探针的负载
(Doke 1997; Pei等2000)。事先将2,7-二氯氢化
荧光素乙酰乙酸盐(2,7-dichlorofluorescin diacetate,
H2DCFDA)配成 50 mmol·L-1 的二甲亚砜(dimethyl
sulfoxide, DMSO)溶液，分成小包装冷冻保存。
将去叶肉细胞的表皮条培养在5 mL负载缓冲液(10
mmol·L-1 Tris-HCl、50 mmol·L-1 KCl, pH 7.2)中，
然后从预先配好的含有 H2DCFDA 的 DMSO 溶液中
取5 mL 加入盛有表皮条的负载缓冲液中，混匀，
避光负载15~30 min。(2)荧光图像的记录。将负
载H2DCFDA的表皮条用新鲜的pH 7.2的负载缓冲
液漂洗 2 次，以洗去细胞表层的多余探针，然后
用盖玻片迅速将表皮条固定在显微镜载物台上，
用激光共聚焦扫描显微镜观察。根据实验方案，
取终浓度为100 µmol·L-1的ABA刺激保卫细胞。在
研究保卫细胞的吸收速率时，事先在与投射光图
像相对应的荧光图像中选定不同的区域。激光扫
描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy,
LSCM)的工作条件为：激发光波长(Ex)=488 nm，
采集荧光波长(Em)=525 nm，激光功率(Power)
3%，放大倍数(Zoom) 3，中速扫描，采集分辨
率(Frame) 512×512。软件为Time-Course。为确
保结果的可比性，荧光图像在相同的设置[即通过
人工将仪器中相关参数如采集荧光的孔径相对大小
(Iris)、光电倍增管增益(Gain)、光电倍增管电压
(Offset)等设置为固定值]下获得。每个实验至少
重复 3 次，取有代表性的结果进行分析。
结果与讨论
1 H2O2对野生型拟南芥及其突变体幼苗根生长的
影响
用0.1 mmol·L-1 H2O2喷洒生长3~5 d的野生型
拟南芥及其突变体幼苗后，2~3 d测定根长的结果
表明，野生型植株根生长受抑，其根长明显短于
突变体(图 1)。由此可以看出，拟南芥突变体对
外源H2O2 (0.1 mmol·L-1)有很强的耐受性。
2 H2O2对野生型拟南芥及其突变体叶片气孔开度
的影响
用0.1 mmol·L-1 H2O2 处理野生型拟南芥及其
突变体的表皮条后的结果显示，H2O2 处理的野生
型拟南芥气孔关闭明显，而拟南芥突变体的气孔
图1 H2O2对野生型拟南芥及其突变体幼苗根生长的影响
Fig.1 Effect of H2O2 on root growth of A. thaliana
and its mutant seedlings
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变化不明显，气孔没有关闭(图 2)。说明突变体
对外源 H2O 2 不敏感。
无变化。说明突变体内有较高的活性氧清除系
统 。
4 ABA和 CAT 对野生型拟南芥叶片气孔开度的影
响
将气孔完全开放的野生型拟南芥的表皮条分
别置于100 µmol·L-1 ABA、100 U·mL-1 CAT和100
µmol·L-1 ABA+100 U·mL-1 CAT 以及不加 ABA 和
CAT 的缓冲液中，以后每 0.5 h 检测 1 次气孔开
度的结果表明，ABA 浓度升高，气孔开度下降，
并且随着 ABA 处理时间的延长，气孔开度逐渐下
降 ；100 U·mL-1 的 CAT 可部分逆转 ABA 所诱导
的气孔关闭(图 4)。这些结果表明，H2O2 可能参
与 AB A 诱导的气孔关闭过程。
图3 H2O2对野生型拟南芥及其突变体
叶中 M D A 含量的影响
Fig.3 Effect of H2O2 on MDA content in leaves
of A. thaliana and its mutant seedings
图 4 ABA 和 CAT 对野生型拟南芥
叶片气孔开度的影响
Fig.4 Effects of ABA and CAT on stomatal aperture in
leaves of A. thaliana seedlings
图2 H2O2对野生型拟南芥及其突变体
叶片气孔开度的影响
Fig.2 Effect of H2O2 on stomatal aperture in leaves
of A. thaliana and its mutant seedings
3 H2O2 对野生型拟南芥及其突变体叶中MDA含量
的影响
图 3 显示，低浓度 H 2O 2 处理的野生型拟南
芥，其 MDA 含量增加不明显，受 H2O 2 胁迫的野
生型拟南芥 MDA 含量高于突变体，随着 H2O 2 浓
度的升高，前者 M D A 含量升高，而后者基本上
5 外源ABA诱导的野生型拟南芥及其突变体气孔
保卫细胞 H2O2 的产生
基于上述结果，我们进一步用 LSCM 技术检
测外源 ABA 诱导的 H2O2 产生及气孔关闭过程。从
图5可以看出，细胞内区域①和② (可能是叶绿体
区和质膜附近区域) H2O2 荧光强度最先增强，随
后在区域③和④ (可能是胞质区域)也表现出H2O2
荧光增强，并随着时间的延长(10~200 s)， H2O2
荧光逐步遍布整个保卫细胞，野生型拟南芥保卫
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月34
细胞内荧光从局部的亮斑逐渐扩展。叶绿体区域
的荧光增强尤为明显，短时间内荧光即增加，说
明外源 ABA 确实能诱导胞内 H2O2 的产生。而在突
变体胞内的荧光强度增加不明显，H2O2 荧光强度
保持较低的水平。
总之，突变体对 H 2O 2 的响应有了改变，其
对H2O2 的耐受性较强。可能是在H2O2 的正常代谢
中，细胞内消除H2O2的某一酶基因发生了突变(如
过氧化氢酶或抗坏血酸过氧化物酶)，或它们的过
量表达及时消除了体内多余的 H2O2，从而可避免
细胞受到毒害。另外，以 H2O2 荧光探针 H2DCFDA
结合 LSCM 可以直接检测外源 ABA 诱导拟南芥保
卫细胞内 H2O2 的产生，实验中观察到野生型拟南
芥胞内 H2O2 荧光强度比突变体拟南芥高，暗示突
变体拟南芥 H2O2 产量低可能是其体内 ABA 诱导产
生的 H2O 2 及时被消除或者产生 H2O 2 的途径被阻
断。
图5 外源 ABA 诱导保卫细胞H2O2 的产生
Fig.5 Generation of H2O2 in guard cells induced by exogenous ABA
　　a、a-1、a-2 和 b、b-1、b-2 分别显示野生型拟南芥及其突变体在 100 µmol·L-1 ABA 处理后 10、100、200 s 时的荧光强
度。细胞内区域①和②可能是叶绿体区和质膜附近区域，③和④可能是胞质区域，B G 显示细胞内部背景荧光亮度。
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