全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 529
植物4-香豆酸:辅酶A连接酶
赵淑娟 刘涤 胡之璧*
上海中医药大学中药研究所，上海201203
4-Coumarate:Coenzyme A Ligase in Plant
ZHAO Shu-Juan, LIU Di, HU Zhi-Bi*
Institute of Traditional Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
提要 就植物中4-香豆酸:辅酶A连接酶的基因表达调控和底物结合功能域及其与木质素的关系以及其基因家族的进化的
研究进展做了介绍。
关键词 4- 香豆酸:辅酶 A 连接酶，苯丙烷类化合物生物代谢
收稿 2006-03-02 修定 　2006-04-29
资助 国家自然科学基金(30300447)。
*通讯作者(E-mail: huzhibi@hotmail.com, Tel: 021-
51322509)。
苯丙烷类化合物生物代谢途径是与碳循环有
关的最主要的次生代谢途径之一。植物细胞中
20% 的次生代谢产物经由这一途径产生。植物的
许多天然产物如黄酮、类黄酮、木质素、色素、
茋类及其它酚酸类化合物等，都是由来源于苯丙
烷类化合物生物代谢途径的各种分支途径产生
(Grand等1983; Wallis和Rhodes 1977)。这些物
质在不同细胞、组织和器官中均起着重要作用，
如木质素是木质部结构组成的主要成分，黄酮可
作为叶表皮细胞防止紫外损伤的保护剂或者作为花
粉发育和植物与微生物相互作用的信号分子，茋
类可以保护植物细胞抗病虫侵袭等等(Douglas等
1987; Dixon和Paiva 1995; Grand 等1983; Hahlbrock
和Scheel 1989; Lozoya等1988)。从经济学的角
度来说，这一类次生代谢产物蕴藏着巨大的应用
价值，如作为药物、食品添加剂、芳香剂、染
料等等。正因为如此，人们对苯丙烷类化合物的
生物代谢途径进行了一系列的研究，其内容涉及
植物化学、酶学、遗传学和分子生物学等等。作
为该途径中关键限速酶之一的4-香豆酸:辅酶A连
接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL; EC 6.2.1.
12)自然也引起了人们的关注。4CL处在总途径向
分支途径的转折点，控制着苯丙烷类化合物生物
代谢向不同方向进行，在植物与环境的相互作用
中起必不可少的作用。
4-香豆酸:辅酶A连接酶，又称4-香豆酰:CoA
合成酶、p- 羟基肉桂酸:CoA 连接酶，是苯丙烷
类化合物生物代谢总途径中的最后一个酶，它通
过两步反应(4CL+ 香豆酸 +ATP → 4CL:香豆酰
~p A + P P i；4C L :香豆酰 ~p A + C o A →香豆酰 -
CoA+AMP+4CL)催化 4- 香豆酸及其羟基和甲羟基
衍生物生成各自活性形式的硫酯酰 CoA，而这些
活性形式的硫酯酰 CoA 是后续各分支途径的直接
前体分子(图1) (Allina等1998; An等1999; Brodelius
和 Xue 1997; Graham和 Graham 1991)。
图1 苯丙烷类化合物生物代谢总途径(Allina等1998；
An等 1999；Brodelius和 Xue 1997；
Graham 和 Graham 1991)
　　P A L：苯丙氨酸氨裂解酶；C 4 H：肉桂酸 4 - 羟基化酶；
C3H：肉桂酸 3- 羟基化酶；CO M T：咖啡酸 O- 甲基转移酶；
F5 H：阿魏酸 5 - 羟基化酶；CC o 3 H：香豆酰 C o A 3 - 羟基化
酶；C C o M T：咖啡酰 C o A 3 - O - 甲基转移酶。？表示可能存
在的生物转化过程。
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1 4CL同工酶的生化特性和催化活性
早在20世纪70年代初有关4CL的研究就已进
行，初期的工作主要集中在从植物中分离纯化
4CL蛋白酶并对其生化特性进行研究。如Ranjeva
等(1976)从矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)中分离到
3个 4CL同工酶 Ia、Ib和 Ic。三者相互间不能转
化，虽都能以p-香豆酸(4- 香豆酸)为有效底物，
但对其它 C6-C3 单体化合物却表现出明显的底物
特异性，Ia的最适底物为咖啡酸，称之为咖啡酸:
CoA 连接酶，Ib 的最适底物为芥子酸，称之为芥
子酸:CoA 连接酶，Ic 的最适底物为阿魏酸，称
之为阿魏酸:CoA 连接酶。这3个同工酶的热稳定
性和对酚酸类化合物的敏感性也不同，Ia能为p-
香豆酰酯和咖啡酰奎宁酸酯所抑制，对p-香豆酰
葡萄糖和一些类黄酮不敏感；Ic 能特异地为柚皮
素(naringenin)所抑制；而实验所选的化合物均不
能抑制Ib即芥子酸:CoA连接酶的活性。他们还发
现这些抑制反应均为非竞争性抑制，说明底物与
抑制剂在酶分子上可能有不同的结合位点。这些
结果表明矮牵牛中不同 4CL 同工酶可能在苯丙烷
类代谢不同分支代谢途径中起作用。大豆(Glycine
max L., Knobloch和Hahlbrock 1975)、豌豆(Pisum
sativum L., Wallis 和 Rhode 1977)和欧美杨
(Populus×euramericana, Grand等1983)等的4CL同
工酶研究也发现，这些酶都是单链多肽组成的单
体酶，底物为4-香豆酸及其苯环上的羟基或甲羟
基衍生物如咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等，最适
pH 一般在 7.0 左右，粗略的估价分子量在 55~67
k D a 之间。
人们对 4CL 有较为明确的认识始于 4CL 基因
的克隆。迄今已从多种植物中分离到编码 4CL 的
基因，如欧芹(Petroselinum crispum, Douglas等
1987; Hauffe等1991; Lozoya 等1988; Neutaedter
等1999)、马铃薯(Solanum tuberosum L., Becker-
André等1991)、火炬松(Pinus taeda L., Voo等
1995; Zhang和 Chiang 1997)、烟草(Nicotiana
tabacum L., Lee和Douglas 1996)、大豆(Glycine
max L., Lindermayr等2002; Uhlmann和Ebel 1993)、
杂交杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray×P.
deltoides Marsh, Allina 等 1998)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana, Ehlting等1999; Hamberger
和Hahlbrock 2004; Lee等1995, 1997)等。这些植
物基因组中 4CL 基因以小的基因家族形式存在，
一般有2~4个成员(Douglas 1996)。有些植物如马
铃薯(Becker-André等1991)、欧芹(Douglas等1987;
Lozoya等1988)和烟草(Lee和Douglas 1996)中4CL
同工酶具有相似的分子特性，对4-香豆酸及其羟
基和甲羟基衍生物(图2)表现出相同或近乎相同的
底物特异性；而已研究的大多数植物如拟南芥
(Ehlting等1999; Hamberger和Hahlbrock 2004)、
大豆(Knobloch和Hahlbrock 1975; Lindermayr等
2002)、颤杨(Populus tremuloides Michx., Hu等
1998)、覆盆子(Rubus idaeus L., Kumer和Ellis
2003)等等，其4CL基因家族具有结构和功能完全
不同的成员，各成员对几种常用底物表现出不同
的亲和催化活性(表1)，预示着不同成员可能在苯
丙烷类生物代谢不同的分支途径中起作用。
大豆的重组蛋白 Gm4CL1 对阿魏酸盐、芥子
酸盐、4-香豆酸盐、咖啡酸盐和3,4-二甲羟基肉
桂酸盐表现出较强的催化活性，Gm4CL2 也能催
化咖啡酸盐、4- 香豆酸盐、阿魏酸盐和肉桂酸，
但不能催化芥子酸盐和 3,4- 二甲羟基肉桂酸盐。
由于这些底物相应的 CoA 酯是木质素和其它酚酸
类化合物的前体分子，因此推测 G m 4 C L 1 和
Gm4CL2可能参与木质素和其它酚酸类化合物的生
物合成(Lindermayr 等 2002)。Gm4CL3 与 Gm4CL4
具有很强的相似性，它们都能高效率地转化4-香
豆酸盐和咖啡酸盐，也能转化肉桂酸盐和阿魏酸
盐，但不能催化芥子酸盐和3,4-二甲羟基肉桂酸
盐；结合它们对来自于疫霉(Phytophthora sojae)
及其游走孢子的 b - 葡聚糖诱导子的上调特性
图2 4CL常用底物分子结构
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表1 部分4CL同工酶的底物结合特异性

植物种 同工酶 酶来源
底物结合特异性
最适底物 底物(亲和性由高到低)
欧芹(Petroselinum crispum) Pc4CL-1 细胞培养物纯化 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，异阿魏酸盐，肉桂酸盐，咖啡酸盐，
芥子酸盐
Pc4CL-2 细胞培养物纯化 4-香豆酸盐 I s o 阿魏酸盐，阿魏酸盐，咖啡酸盐，肉桂酸盐，
芥子酸盐
烟草(Nicotiana tabacum L. Nt4CL-1 重组蛋白 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，咖啡酸盐，芥子酸盐
cv.Xanthi SR1) Nt4CL-2 重组蛋白 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，肉桂酸盐，咖啡酸盐
颤杨(Populus tremuloides Pt4CL1 重组蛋白 4-香豆酸 阿魏酸，咖啡酸，5 - 羟基阿魏酸
Michx.) Pt4CL2 重组蛋白 4-香豆酸 咖啡酸，阿魏酸
杂交杨(Populus trichocarpa 4CL-9 重组蛋白 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，咖啡酸盐，肉桂酸盐，5 - 羟基阿
Torr. & Gray×P. deltoides 魏酸盐
Marsh) 4CL-216 重组蛋白 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，咖啡酸盐，肉桂酸盐，5- 羟基阿魏酸盐
Ptd4CL3 重组蛋白(部分纯化) 4-香豆酸 阿魏酸，咖啡酸，肉桂酸
拟南芥(Arabidopsis thaliana) At4CL1 重组蛋白 4-香豆酸盐 咖啡酸盐，阿魏酸盐，肉桂酸盐
At4CL2 重组蛋白 咖啡酸盐 4- 香豆酸盐，肉桂酸盐
At4CL3 重组蛋白 4-香豆酸盐 阿魏酸盐，咖啡酸盐，肉桂酸盐
At4CL4 重组蛋白 芥子酸盐 咖啡酸盐，4- 香豆酸盐
大豆(Glycine max L. cv. G m 4 C L 1 重组蛋白 阿魏酸盐 4- 香豆酸盐，芥子酸盐，咖啡酸盐，3,4- 二甲羟
Harosoy 63) 基肉桂酸盐，肉桂酸盐
Gm 4 C L 2 重组蛋白 咖啡酸盐 4-香豆酸盐，阿魏酸盐, 肉桂酸盐
G m 4 C L 3 重组蛋白 4-香豆酸盐 咖啡酸盐，肉桂酸盐，阿魏酸盐
Gm 4 C L 4 重组蛋白 4-香豆酸盐 咖啡酸盐，肉桂酸盐，阿魏酸盐
(Graham 和 Graham 1994)，推测 Gm4CL3/4 可能
与防御有关的代谢如黄酮和异黄酮、细胞壁内酚
酸类或其它水溶性的苯丙烷类化合物的生物合成有
关(Lindermayr等2002)。
Ehlting等(1999)在对拟南芥4CL重组蛋白的体
外实验观察到，At4CL1 对 4- 香豆酸盐、咖啡酸
盐、阿魏酸盐的催化活性由强到弱依次递减，但
三者差别不大，表明At4CL1对这几种底物都具有
亲和活性；At4CL1 是 4个成员中在成熟拟南芥木
质化茎部转录表达量最多的基因，在幼苗和子叶
木质素开始积累的地方也有表达。At4CL2对咖啡
酸盐和4-香豆酸盐也表现出强烈的催化活性，但
不能以阿魏酸盐为底物；其 mRNA 表达量在幼苗
中较高，而在其它器官表达量却很低。At4CL4是
该基因家族中唯一能以芥子酸盐为底物而且是最适
底物的成员，它也能催化咖啡酸盐和4-香豆酸盐
(Hamberger 和 Hahlbrock 2004)。另一方面，
At4CL3重组蛋白对4-香豆酸盐的催化活性远远大
于阿魏酸盐、咖啡酸盐和肉桂酸盐，而其在花器
官中 mR N A 表达量也远远高于其它木质化器官。
由此推测：At4CL1、At4CL2 和 At4CL4 可能参与
了拟南芥木质素、细胞壁内酚酸类化合物和其它
苯丙烷类衍生物的生物代谢途径(Ehlting等1999;
Hamberger和Hahlbrock 2004)，而At4CL3可能主
要参与黄酮类化合物的生物合成途径(Ehlting等
1999)。
2 4CL基因的表达与调控
与植物次生代谢途径中的大多数酶类一样，
4CL基因也属于调控基因(Becker-André 等 1991;
Lee 等 1995)，许多环境因子诸如病虫害、伤害、
紫外线等都会影响到 4CL 基因家族不同成员在植
物特定组织器官中的表达情况。Ehlting等(1999)
用植物霜霉病的致病寄生真菌(Pe r o n o s p o r a
parasitica)的孢子感染拟南芥子叶，发现该致病因
素强烈诱导 At4CL1 和 At4CL2 mRNA 的表达，其
开始表达时间分别是感染后12和24 h；而At4CL3
m R N A 则不被诱导。另一与抗病有关的基因
AtPOX的 mRNA最高表达水平则在4 d 后出现。非
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生物因素如伤害诱导At4CL1和 At4CL2瞬间表达，
只是 At4CL2 的最高表达水平比 At4CL1 低，而
A t 4 C L 3 不受伤害的诱导；紫外线也能诱导的
At4CL1 和 At4CL2 瞬间表达，紫外线照射 6 h 后
其 mRNA 表达量最高；At4CL3 也被紫外线所诱
导，其 mRNA 表达的量相对较低，最高表达水平
也在6 h后出现，一直持续到24 h。这些结果表
明At4CL1和At4CL2可能主要参与抗性有关化合物
如木质素和细胞壁内酚酸类化合物等的生物代谢途
径，而At4CL3可能与光照有关的黄酮和异黄酮类
化合物的生物合成有关。
4 C L 是组织特异性表达基因，同一物种中
4CL 基因家族中不同成员 mRNA 的表达表现出器
官、组织和细胞的特异性，这可能与不同成员参
与不同的分支途径有关。Hu等(1998)在研究颤杨
Pt4CL 基因中发现，Pt4CL1 mRNA 特异性地在木
质化的木质部组织中表达，而Pt4CL2则特异地在
茎和叶的表皮层中表达。这一结果也与Pt4CL1和
Pt4CL2启动子驱动的GUS 基因分别只在转基因烟
草的木质部和表皮中表达的结果相一致( H u 等
1998, 1999)。结合对两个基因体外功能的研究(表
1)，他们推测基因的特异性表达可能与Pt4CL1主
要参与木质素的生物代谢，而Pt4CL2主要参与黄
酮类物质代谢有关。拟南芥中 At4CL1、At4CL2
和At4CL3的组织特异性表达(Ehlting等1999)与重
组蛋白底物特异性相结合，也反映出植物体内
4CL 家族各成员可能参与了不同的生物代谢途径
(见上一节)。
4CL基因还与苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine
ammonia lyase, PAL)和肉桂酸 4- 羟基化酶
(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)基因的表达存在明
显的相关性(Dixon和 Paiva 1995; Ragg等 1981;
Weisshaar和Jenkin 1998)。Northern杂交结果显
示真菌诱导子和紫外线信号刺激后 4CL 和 PAL 基
因mRNA表达量变化表现出一致性(Lois等 1989)。
拟南芥的致病性实验中也发现 AtPAL 和 AtC4H 为
霜霉病致病真菌感染所诱导的 mRNA 表达特征与
At4CL1 和 At4CL2 非常相似(Ehlting 等 1999)。
Logemann等(1995)也发现含有紫外线的白光、真
菌诱导子和伤害都能强烈地诱导欧芹 PAL、C4H
和 4CL 基因 mRNA 的瞬时积累，并且在实验误差
允许的范围内三者 mRNA 总量的变化遵循相同的
时间程序。蛋白水平的研究也证明用诱导子处理
燕麦叶后 PAL、C4H 和 4CL 酶活性同时达到最高
水平(Ishihara 等 1999)。PAL、C4H 和 4CL 催化
相继发生的一系列生物转化，是苯丙烷类化合物
生物代谢总途径中的关键酶(图1)。以上研究结果
表明，PAL、C4H 和 4CL 基因的表达调控方式具
有协同性，其协同调控作用可能主要在转录水平
进行(Reinold等1993, 1997)。
有人研究发现，4CL、PAL 和 C4H 基因的启
动子区域有保守的“A C”富集的顺式作用元件
(Hauffe 等1991, 1993; Lois等1989; Neutaedter等
1999)，称为“AC”元件，包括 P 盒(Box P)、
A盒(Box A)、L盒(Box L)和 H盒(Box H)等，它
们的特征序列分别为
(Logemann 等 1995; Loake 等 1992)。其中 P盒、
A 盒和 L 盒是决定这些基因为诱导子、紫外线和
伤害等胁迫信号所诱导表达和组织细胞特异性表达
所必需的顺式作用元件(Douglas等1991; Logemann
等1995; Loake等1992)。研究还发现，这些保守
的区域是植物 MYB 相关的转录因子结合的特征核
苷酸序列，表明 4CL 基因在植物体内可能为 MYB
类转录因子所调控(Feldbrugge等1997; Logemann
等 199 5)。研究欧芹 4CL1 启动子的结果表明，
-210 bp (以转录起始位点为+1)的启动子片段可能
是控制欧芹4CL1基因组织细胞特异性表达的最小
启动子(Douglas等1991; Hauffe 等1991, 1993;
Neutaedter等1999)。活体DNA足迹(in vivo DNA
footprint)实验发现该区域有两个关键结构，位
于-166~-120之间的FP4 (footprint 4)带有P盒的
特征序列，是与 MYB 类转录因子直接结合的功能
域(domain); 位于-120~-78的FP56 (footprints 5 and
6 )，以重复“C”为 10 个左右的碱基所分开为
特征，这一区域与欧芹和烟草的核蛋白表现出特
异性结合，是一个独立的顺式作用元件，在 4CL
基因转录调控中起重要的作用(Douglas 等 1991;
Hauffe 等1991, 1993; Neutaedter等1999)。
4CL基因还可能存在翻译后调控过程。Lee和
Douglas (1996)在烟草4CL的研究中发现，从烟草
中提取的非纯化的 4CL 蛋白不具有催化肉桂酸的
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活性；与之不同的是，其体外重组蛋白则可以肉
桂酸为有效反应底物；而将 4CL 重组蛋白与烟草
提取物共培育后这一活性则被抑制，这一抑制现
象与提取物中具有高分子量的热不稳定性组份有
关。由此他们推测，烟草 4CL 酶可能存在翻译后
修饰或在体内有与其它蛋白质相互作用的过程。
3 4CL氨基酸序列保守的功能域
Motif I——AMP结合功能域：已知的4CL基
因推导的氨基酸序列中都存在保守的 AMP 结合功
能域(Branchini等2000; Challis等2000; Gocht和
Marahiel 1994; Stachelhaus 等 1999)——
“S S G T T G L P K G”。这一区域不仅在 4 C L 中保
守，而且是所有腺苷酸形成酶如荧光素酶、乙酰
辅酶A合成酶、脂酰辅酶A合成酶等的共有特征，
是这类酶催化底物形成腺苷酸中间产物所必需的氨
基酸序列，也是这一超基因家族(superfamily)的分
类依据之一(Stuible等2000; Stuible和Kombrink
2001)。
Motif II——“GEICIRG”：Motif II (又称
Box II) “GEICIRG”是 4CL 中另一绝对保守的
区域(Stuible和Kombrink 2001; Zhang和Chiang
1997)。已知的4CL氨基酸序列中只有大豆Gm4CL1
在该区域有轻微的不同，为“GEICIIG”。曾推
测Motif II直接参与4CL的催化反应，其中间的
半胱氨酸残基(Cys)侧链可能是参与催化反应的基
团。这一假说是在抑制实验和 Cys 在腺苷酸形成
酶中的高度保守性基础提出的。最近的研究发
现，该位Cys突变为Ala的酶仍表现出相当的酶活
性(Stuible等2000; Stuible和Kombrink 2001); 而
Ohmiya和Tsuji (1997)的研究也表明该位Cys并非
荧火虫的荧光素酶生物发光所必需；但Motif II缺
失的 4CL 酶活性会完全丧失。因此推测这一序列
可能也与稳定蛋白质的活性空间构象有关(Stuible
等 2000)。
4 底物结合功能域sbd I和sbd II
研究的植物大多存在 2~4 个 4CL 同工酶，多
数同工酶具有底物结合特异性。S t u i b l e 和
Kombrink (2001)利用At4CL1和 At4CL2的底物特
异性结合特性，结合短杆菌肽 S 合成酶 1 苯丙氨
酸激活结构域(phenylalanine-activating domain, PheA)
的研究结果[许多腺苷酸形成酶的蛋白质立体结构
与底物识别功能域已研究得较为清晰(Broun 等
1998; Chang 等 1997; Conti 等 1996; Gocht 和
Marahiel 1994; Wang和Pichersky 1999)，结合短
杆菌肽S合成酶即为其一]，已确定了与底物特异
性结合密切相关的两个区域：sbd (substrate bind-
ing domain) I和sbd II。并推测，4CL中与PheA
相类似的功能域sbd I是决定4CL底物特异性的关
键区域，这一区域可能是底物与酶直接结合的一
个“口袋”。sbd II 则可能是通过与 sbd I 区域
氨基酸残基的相互作用改变了sbd I的结构，从而
间接地影响了酶与底物的特异性结合。sbd II区
域内 Motif II羧基端的氨基酸残基可能是限制底物
进入sbd I口袋的因素。
根据拟南芥4CL突变体的研究，人们设想sbd I
区域几个位置上氨基酸残基的空间位阻可能在4CL
底物特异性选择中起关键作用。S t u i b l e 和
Kombrink (2001)报道，At4CL1、At4CL2 和
At4CL3中唯有At4CL2不能以分子量相对较大的阿
魏酸(图2, 底物结构式)。三者氨基酸的序列比较
表明，sbd I区域存在两个关键位点的氨基酸残基
差异：At4CL2序列中Met283和 Lys320 在 At4CL1和
At4CL3中对应位置分别为空间位阻相对较小的Pro
和 Ala。进一步实验发现，At4CL2 Met283/Pro 和
Met283/Ala的突变体对阿魏酸的催化活性分别表现
出与At4CL1和At4CL2具有相似的特性；而Lys320/
Leu和Lys320/Ala的突变体对咖啡酸的酶活性也表
现出一定程度的提高。推测sbd I区Met283和Lys320
可能是位于“口袋”开口处的两个氨基酸残基，
这两个氨基酸残基的空间位阻可能是影响At4CL2
与底物特异性结合的重要因素(Stuible 等 2000;
Stuible 和Kombrink 2001)。
5 4CL基因在基因工程中的应用
如引言中所述，苯丙烷类化合物不仅对植物
本身在环境中生存具有重要意义，而且与人类日
常生活密切相关。与此代谢途径有关的基因工程
研究也随之展开(Hu等1999; Kajita等1997; Li等
2003)。4CL处在苯丙烷类化合物生物代谢中总途
径向分支途径的转折点，是这一生物合成途径中
的限速酶之一。由于在代谢途径中的特殊位置和
关键作用，所以 4CL 已成为苯丙烷类化合物生物
合成基因工程工作中的一个有力候选者。
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木质素是植物细胞壁的组成部分，对植物的
正常生长起作用，但对造纸纸浆工业来说，木质
素却是影响造纸工业中浆和纸的品质与产率的重要
因素。从植物中除去木质素的常规方法既消耗大
量化学药品和能源，又严重污染环境。而基因工
程手段调控木质素的合成可能是解决这一问题的根
本途径之一。Lee等(1997)采用反义基因抑制拟南
芥中 4CL 酶的活性，拟南芥中木质素的组成成分
即发生变化，愈疮木基丙烷(guaiacyl, G)单位含量
显著减少，而紫丁香基丙烷(syringyl, S)单位则没
有变化，转基因拟南芥中 G/S 比大大降低。G 和
S是构成木质素的不同结构单元，G/S比是反应木
质素降解难易的一个指标。类似的结果还在转反
义 4CL 基因的烟草和颤杨中得到：转基因烟草木
质素分子组成成分改变，褐化组织中木质素含量
由原先的23.4%±0.2%下降到20.3%±0.1% (Kajita
等1997); 4CL酶活性受到抑制的转基因颤杨中木
质素含量下降 45%，纤维素含量增加 15% (Hu 等
1999)。Li等(2003)将反义4CL基因和正义CAld5H
(松柏醛5-羟基化酶)基因协同转入颤杨后，木质
素的含量减低 52%，S/G 比率提高 64%，纤维素
成分增加 30%，这为人们改造植物中木质素生物
合成提供了科学依据。
黄酮是苯丙烷类化合物生物代谢中另一类重
要产物，由于其在医药和食品添加剂中的经济价
值，近些年来人们试图在微生物中构建黄酮的生
物合成途径以达到采用发酵技术生产此类化合物的
目的。4CL是构建这一途径的关键酶之一(Jiang等
2005; Kaneko等 2003)。将不同来源的PAL、4CL
和查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)转入原
核生物大肠杆菌(Escherichia coli)后表达这3个基
因的大肠杆菌即能产生两种黄烷酮(flavanone): 松
属素(pinocembrin)和柚皮素(naringenin)，产率分
别是450和 750 mg·L-1 (Kaneko等 2003)。4CL基
因与黄酮生物合成途径其它关键酶基因在大肠杆菌
中联合表达也使得大肠杆菌产生黄酮醇山奈酚
(flavonol kaempferol)和3,4 B-环羟基黄酮醇槲皮
素(3,4 B-ring hydroxylated falvonol quercetin,
Leonard 等 2005)、芹菜素(apigenin)和芫花素
(genkwanin)等化合物(Leonard等2006)。真核生物
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中转入植物来源的
PAL、4CL 和 C4H 基因后也能产生大约0.8 mg·L-1
的松属素和 7 mg·L-1 的柚皮素；该菌株还能生成
2 , 4 , 6 - 三羟基二氢查耳酮( 2 , 4 , 6 -
trihydroxydihydro-chalcone)和根皮素(phloretin)等副
产物(Jiang等2005)。
这些研究成果不仅为阐明 4CL 在苯丙烷类化
合物生物代谢中的功能提供了依据，也为应用
4CL 基因工程中的作用提供了借鉴。多个功能基
因的共转化拓宽了基因工程的思路，为改变多酶
控制的植物次生代谢途径提供了可能。
6 4CL基因家族的进化
从GenBank中提取不同植物共37种4CL基因
和蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor) ScCCL、拟
南芥At4CL-like的氨基酸序列，加上我们从丹参
(Salvia miltiorrhiza Bunge)中克隆的两个4CL基因
(Sm4CL1和 Sm4CL2)进行同源分析，以Clustal方
法建立的基因进化树(图3)中可以看出，基因进化
树中4CL聚集成两大类群——Class I和Class II，
不同 4CL 基因并不完全按照物种聚集，即同一植
物的不同 4CL 基因在进化树中关系并非最近。如
杂交杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray×P.
deltoides Marsh) Pbd4CL1、Pbd4CL2和Pbd4CL3
同属于Class I，而Pbd4CL4属于Class II；即使
同处Class I，Pbd4CL3与 Pbd4CL1、Pbd4CL2 的
进化关系也较远。由此推测，4CL 基因可能是一
个较为古老的基因，早在被子植物与裸子植物分
化之前 4CL 基因就已存在，并已在复制中发生了
变异，遂有Class I和Class II的分类(Cukovic等
2001; Ehlting等1999; Kumar和Ellis 2003)。链霉
菌中肉桂酸:辅酶A连接酶(ScCCL)的存在似乎也证
实了这一推论(Kaneko等2003)。在相对较近的年
代，Class I和Class II中4CL基因仍然发生着变
异，从而导致现代植物中 4CL 基因家族多成员的
出现。4CL 基因家族多成员的出现是植物长期适
应环境的结果，对物种的繁衍生息起着必不可少
的作用。
4CL基因进化树中Class I和Class II的形成，
可能更多地反映出4CL功能上的分类(Cukovic等
2001; Kaneko等2003; Kumar和Ellis 2003)。实验
发现，Class I中拟南芥At4CL1、At4CL2和大豆
Gm4CL1主要与黄酮的生物合成相关；Class II中
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 535
At4CL3、Gm4CL2、Gm4CL3 和 Gm4CL4 主要参
与木质素及其它苯丙烷类化合物的生物合成
(Ehlting等1999; Lindermayr等2002)。
7 结语
植物次生代谢基因工程的出现是人类对次生
代谢途径的深入了解和分子生物学向纵深发展的结
果，同时它又促进了次生代谢分子生物学的发
展。4CL 在苯丙烷类化合物生物代谢途径的关键
作用及其此类化合物对植物本身和人类的重要意
义，使得 4CL 成为植物次生代谢领域研究的重要
图3 CLUSTAL 方法建立的4CL基因进化树
　　Af：紫穗槐(Amorpha fruticosa); At：拟南芥(Arabidopsis thaliana); Ca：辣椒(Capsicum annuum); CCL：肉桂酸:辅酶 A
连接酶(cinnamate:coenzyme A ligase); Gm：大豆(Glycine max); Le：紫草(Lithospermum erythrorhizon); Lp：黑麦草(Lolium
perenne); Nt：烟草(Nicotiana tabacum); Os：水稻(Oryza sativa); Pbd：杂交杨(Populust trichocarpa×Populus deltoides); Pc：
欧芹(Petroselinum crispum); Pinus：火炬松(Pinus taeda); Pto：毛白杨(Populus tomentosa）; Pt：颤杨(Populus tremuloides);
Ri：覆盆子(Rubus idaeus); Sc：蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor); Sm：丹参(Salvia miltiorrhiza); St：马铃薯(Solanum
tuberosum); Vp：香荚兰(Vanilla planifolia)。
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月536
对象之一。
具有不同功能的4CL 同工酶的存在，为人们
有针对性地选择不同的 4CL 基因，通过基因工程
技术控制苯丙烷类化合物的物质流向提供了可能。
如Jiang等(2005)将拟南芥具有广泛底物结合特性
的At4CL1基因与 PAL和 CHS基因转入酵母菌中获
得可以产生黄酮的转基因酵母菌株。H u 等
(1998，1999)将颤杨中主要参与木质素生物合成
的Pt4CL1 反义基因与正义CAld5H 基因协同转入
颤杨后也使得木质素的含量明显降低(Li等2003)。
基因的表达调控是基因发挥其功能的根本，
基因转录水平的调控是植物次生代谢调控的主要方
式，而转录因子在此过程中起着关键作用(V o m
Endt 等 2002)。P 盒、A 盒和 L 盒等顺式元件的
存在表明 4CL 基因受 MYB 类转录因子的调控，这
种调控与苯丙烷类代谢其它关键酶具有协同性。
虽然目前尚无转录因子调控 4CL 表达的报道，但
4CL 表达调控方面的研究成果以及 Grotewold 等
(1998)和Bruce等(2000)利用转录因子调控玉米细
胞中花青素(anthocyanin)积累的研究为利用转录因
子调控此类化合物生物合成的基因工程提供了可
能。
4CL 功能域氨基酸位点的突变体结合酶的体
外功能的研究和蛋白质晶体结构模型，将为最终
阐明蛋白质特定位点氨基酸残基的功能提供依据。
这也是蛋白质组学的一个重要的研究方向 ——结
构与功能蛋白质学。关键位点影响 4CL 底物特异
性结合的研究成果，为人们通过点突变在体外构
建具有新功能的 4CL 基因提供了思路。在转基因
植物中表达这种具有新功能的基因，则可能会在
原植物中产生新的物质代谢流向。
可以预见，在前人工作基础上进一步深入展
开4CL 基因的研究，不仅能揭示 4CL 的生物学功
能，还将为 4CL 参与的生物代谢途径的改造和用
转录因子及多基因协同转化的植物次生代谢基因工
程提供依据。
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