全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 283
拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体
的构建
万小荣 1，李玲 2,*
1仲恺农业技术学院生命科学学院，广州 510225；2华南师范大学生命科学学院，广州 510631
提要：从拟南芥基因组中克隆 RD29A基因 5-侧翼 520 bp启动子区域序列，生物信息学分析表明，该启动子片段中存在
脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子
AtRD29Ap驱动花生 AhNCED1基因的植物双元表达载体 pAtRD29Ap::AhNCED1。
关键词：RD29A基因启动子；NCED基因；双元载体构建
Construction of Binary Vector Harboring Peanut AhNCED1 Gene Driven by
Drought-inducible Promoter of RD29A Gene from Arabidopsis
WAN Xiao-Rong1, LI Ling2,*
1College of Life Sciences, Zhongkai University of Agriculture and Technology, Guangzhou 510225, China; 2College of Life Science,
South China Normal University, Guangzhou 510631, China
Abstract: In this paper we report the cloning of 5-flanking promoter sequence of drought-inducible RD29A
gene from Arabidopsis and its fusion with peanut AhNCED1 gene. The 520-bp promoter sequence was ana-
lyzed bioinformatically in the database of plant cis-acting regulatory element (PlantCARE). The result showed
that there were several important cis-acting elements, including TATA-box, CAAT-box, DRE (response to
dehydration), ABRE (response to ABA), in the 520-bp promoter region. The binary vector harboring AhNCED1
gene driven by AtRD29A promoter was further constructed to be used in coming plant transgene.
Key words: RD29A gene promoter; nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) gene; binary vector con-
struction
收稿 2007-01-08 修定 2007-03-16
资助 广东省自然科学基金(0 6301 202 )、仲恺农业技术学院
博士启动基金 ( G 2 3 6 0 2 2 5 )和广东省自然科学基金
(0 6 0 25 0 4 9 )。
* 通讯作者(E-m a i l：l i l a b@scn u .edu . cn；T e l：0 2 0 -
8 5 2 1 1 3 7 8 )。
生物化学和遗传学实验的结果证明，9-顺式
紫黄质或 9-顺式新黄质裂解形成黄质醛是高等植
物脱落酸(abscisic acid，ABA)生物合成的限速步
骤，催化该反应的 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧
酶(nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)
则是调控 ABA生物合成的关键酶(Nambara 和
Marion-Poll 2005；Taylor等 2005)。自从玉米突
变体 vp14 (Tan等 1997)中克隆 ZmVP14基因(即
NCED基因)以来，已相继在番茄、菜豆(Qin和
Zeevaart 1999)、豇豆(Iuchi等 2000)、美国鳄梨、
拟南芥(Iuchi等 2001)、葡萄(Soar等 2004)、柑橘
(Rodrigo等 2006)、龙胆(Zhu等 2007)中克隆了
NCED基因。干旱胁迫诱导植物叶片中 NCED基
因表达与 ABA累积水平相一致(Qin和 Zeevaart
1999；Iuchi等 2000)。烟草中异位表达(ectopic
expression)番茄 LeNCED1基因可提高转基因植物
ABA水平(Thompson等 2000)，过表达 AtNCED3
基因则提高转基因拟南芥的内源ABA水平和抗旱
性(Iuchi等 2001)。我们从花生叶中克隆了ABA生
物合成关键酶基因——AhNCED1基因(GenBank
Accession No. AJ574819)，发现其表达受干旱胁
迫诱导，在拟南芥中异位表达AhNCED1基因可提
高转基因植物的 ABA含量和抗旱性(Wan和 Li
2005，2006)。早期的研究已查明，不同花生品
种的抗旱性与其体内ABA水平呈正相关，因此综
合适时地调控花生体内ABA水平对提高植株抗旱
性有一定意义(Li和 Pan 1996)。
本文报道从拟南芥中克隆干旱诱导基因
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RD29A启动子片段，将此序列在国际植物顺式作
用元件数据库中进行生物信息学分析鉴定，并构
建RD29A启动子驱动花生AhNCED1基因的植物双
元表达载体，为尔后用植物基因工程技术综合适
时地调控花生体内ABA水平和为花生品种改良及
抗旱育种累积了基础资料。
材料与方法
按W a n 和 L i ( 2 0 0 6 )的方法培养拟南芥
(Arabidopsis thaliana L. ecotype Columbia，Col-
0)。RD29A基因启动子片段克隆时，采用修改的
SDS (十二烷基磺酸钠)法提取拟南芥叶片基因组
DNA (Wan和 Li 2006)。根据Yamaguchi-Shinoza-
ki和 Shinozaki (1993，1994)报道的拟南芥 RD29A
基因序列(GenBank Accession No. D13044)设计一
对特异引物(P1：5 GAATTCATTCAATTT-
TAATTTTAC GTAT 3 ；P2：5 AG ATC T-
GTTTGATCCATTTTCCAAAGA 3)，用于从拟南
芥基因组中 P C R 扩增干旱诱导型启动子片段
AtRD29Ap，将 PCR产物克隆到 pMD 18-T载体
(TaKaRa)上，通过 PCR和酶切检测获得阳性克隆
(含 pMD 18-AtRD29Ap载体)后，送上海生工生物
技术有限公司测序，获得AtRD29Ap的序列。构
建 AtRD29Ap::AhNCED1融合基因时，以来源于
pCAMBIA1301的p35S::ORF为基本植物双元表达
载体，p35S::ORF载体含CaMV 35S启动子驱动的
花生 AhNCED1基因完整编码框(Wan和Li 2006)。
以引入的 EcoRI和 BglII两个限制性内切酶酶切
图 1 RD29A基因启动子驱动花生 AhNCED1基因的双元表达载体的构建
Fig.1 Construction of binary vector harboring peanut AhNCED1 gene fusioned with Arabidopsis RD29A gene promoter
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pMD 18-AtRD29Ap载体，获取 RD29A基因启动
子片段并克隆到p35S::ORF载体AhNCED1基因上
游以替换CaMV 35S启动子，构建成含AtRD29Ap::
A h N C E D 1 融合基因的植物双元表达载体
pAtRD29Ap::AhNCED1 (图 1)。
实验结果
1 RD29A基因启动子片段克隆与序列分析
以拟南芥基因组DNA为模板，P1和 P2为引
物，进行 PCR扩增，结果扩增出一约 500 bp的
DNA片段(图2)。将此片段回收后克隆到pMD 18-
T载体上，通过 PCR (以 P1和 P2为引物)和酶切
(EcoRI和 BglII双酶切)检测(图 2)，筛选并获取含
pMD 18-AtRD29Ap载体的阳性克隆，送上海生工
生物技术有限公司测序。测序结果表明 PCR产物
为一532 bp的DNA序列，BLAST分析(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)表明，该序列中 520 bp
的启动子片段(含11 bp RD29A基因编码区序列)与
Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki (1993)报道的序列
完全吻合。将这 520 bp序列在国际植物顺式作用
元件数据库PlantCARE (Lescot等2002)中进行生物
信息学分析，搜寻结果表明(图 3)，在该启动子
序列-114~-109 (RD29A基因ATG上游)处有一典
型的 TATA-box (Kurkela和 Franck 1990) ；-144~
-137处有ABA响应元件(ABA response element，
ABRE)，核心序列为 TACGTGTC；-252~-225处
为一 C-repeat/DRE元件，响应低温、脱水胁迫
(Yamaguchi-Shinozaki和 Shinozaki 1993) ；-305~
-297处有一典型的水分胁迫诱导RD29A基因表达
所必需的脱水响应元件(dehydration-responsive
el ement，DR E)，核心序列为 TACC GACAT
(Yamaguchi-Shinozaki和 Shinozaki 1994) ；-367~
- 3 6 3 处为一推测的 C AAT- box，核心序列为
CCAAT (Yamaguchi-Shinozaki和 Shinozaki 1993)。
图 2 拟南芥 RD29A基因启动子片段的克隆
Fig.2 Cloning of RD29A gene promoter
fragment from Arabidopsis
M：D L2 0 0 0 D N A ma rk er；1：以拟南芥基因组 D N A
为模板的 PCR扩增RD29A基因启动子片段；2：PCR检测 pMD 18-
AtRD29Ap载体；3：pMD 18-AtRD29Ap质粒(酶切负对照) ；
4：EcoRI 和 BglII 双酶切检测 pMD 18-AtRD29Ap载体。
图 3 PlantCARE数据库中搜寻的拟南芥 RD29A基因启动子片段
Fig.3 The 520-bp sequence of Arabidopsis RD29A gene promoter submitted to the database
of plant cis-acting regulatory element (PlantCARE)
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由此表明，所克隆的RD29A基因上游 5端序列为
包含各种顺式作用元件的启动子片段(AtRD29Ap)。
2 AtRD29Ap::AhNCED1融合基因构建
用 EcoRI和 BglII双酶切 pMD 18-AtRD29Ap
载体，回收酶切得到的 AtRD29Ap启动子片段，
连接于同样经EcoRI和BglII双酶切的植物双元表
达载体 p35S::ORF上，替换 p35S::ORF载体上驱
动 AhNCED1基因的 CaMV 35S启动子，得到含
AtRD29Ap::AhNCED1融合基因的植物双元表达载
体pAtRD29Ap::AhNCED1 (图1)。对pAtRD29Ap::
AhNCED1载体AtRD29Ap与AhNCED1基因结合区
(junction area)测序，结果表明，在 AhNCED1基
因起始密码子 ATG 之前插入了一 1 8 b p 序列
( A T G G A T C A A A C A G A T C T C，其中
ATGGATCAAAC 11 bp序列为RD29A基因编码区序
列，AGATCTC序列是根据 p35S::ORF载体设计
的 )，不会改变 A h N C E D 1 基因的读码框；
AhNCED1基因的功能保守区域在 3端，5端插入
18 bp序列后没影响到 AhNCED1基因的功能结构
域。
对构建的 pAtRD29Ap::AhNCED1载体进行
PCR和酶切检测，结果以 P1和 P2为引物可特异
地扩增出 532 bp的 PCR产物；EcoRI和 BglII双
酶切pAtRD29Ap::AhNCED1载体可切下相应大小
的DNA片段(图 4)。说明已构建了干旱诱导型启
动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双
元表达载体。
讨 论
NCED催化 9-顺式环氧类胡萝卜素裂解成为
黄质醛是高等植物 ABA 生物合成的关键步骤。
AhNCED1是干旱胁迫下花生叶片中调控ABA生物
合成的关键基因，在拟南芥中异位表达AhNCED1
基因提高了转基因植物的ABA含量和抗旱性(Wan
和 Li 2005，2006)。许多研究(刘吉升和李玲
2006；万小荣和李玲 2006)表明，不同花生品种
的抗旱性与其体内ABA水平呈正相关，干旱胁迫
下，抗旱性强的花生品种中 AhNCED1基因表达
水平高于抗旱性相对弱的品种，与ABA累积水平
一致。因而综合适时地调控花生体内ABA水平对
提高植株抗旱性有作用。
选择适宜的启动子来驱动目的基因在转基因
植物中表达已成为植物基因工程研究的热点问题之
一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动
子，从而使靶基因在特定组织或条件下表达，以
利转基因植物的正常生长发育(赵恢武等2000；刘
强等 2000)。拟南芥 RD29A基因的启动子被认为
是干旱、高盐和低温诱导型启动子，具 DRE及
ABRE，在逆境时可驱动靶基因大量表达，从而
提高转基因植物的抗逆性，因此，它已成为植物
抗逆基因工程中首选的启动子。本文克隆了拟南
芥 RD29A基因上游 5侧翼 520 bp序列，此种启
动子片段的生物信息学分析表明，其中包括分别
对脱水胁迫、ABA响应的DRE、ABRE等顺式作
用元件(图 3)。进一步构建了 RD29A基因启动子
驱动花生 Ah NC ED 1 基因的植物双元表达载体
pAtRD29Ap::AhNCED1 (图 1和图4)。干旱虽能诱
导AhNCED1基因表达，但在抗旱性弱的品种中诱
导表达量低，故我们选用拟南芥RD29A基因启动
子，构建 AtRD29Ap::AhNCED1融合基因，使转
基因植物仅在干旱条件下大量表达目的基因，以
利转基因植物的正常生长发育。我们将本文构建
的pAtRD29Ap::AhNCED1载体转入抗旱性较弱花
生品种后的结果表明，干旱胁迫下转基因花生植
图 4 pAtRD29Ap::AhNCED1载体的 PCR和酶切检测
Fig.4 PCR and double digestion check of the binary
vector of pAtRD29Ap::AhNCED1
M：D L2 0 0 0 D N A ma rk er；1：PCR 系统负对照；2：
PCR检测 pAtRD29Ap::AhNCED1载体；3：EcoRI和 BglII 双
酶切检测 pAtRD 2 9 Ap: :AhN CED 1 载体；4：pAtRD 2 9 Ap: :
AhN CED1 质粒(酶切负对照)。
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株中内源ABA累积水平明显高于野生型，抗旱性
增强；正常生长条件下，两者无显著区别(资料
未列出)。这些为采用植物基因工程综合适时地调
控花生体内ABA水平、改良花生品种和抗旱育种
奠定了基础。
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