全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1113
食用稗成熟胚的组织培养及其细胞学特性
王静, 张欢欢, 傅雪琳 *, 刘向东 *
华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室, 广州 510642
提要: 研究食用稗成熟胚培养因素的结果表明, 愈伤诱导最适培养基为 N6+3.0 mg·L-1 2,4-D。N6基本培养基上的愈伤组织
分化率较高; B5+3.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA 的愈伤组织也具有较高的分化率。分化培养基 N6+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5
mg·L-1 NAA利于绿芽分化。 茎尖部位的愈伤组织分化率比根的高。最佳生根培养基为 1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1
AC。解剖和塑料半薄切片技术观察食用稗外植体的形态学和细胞学变化显示, 胚根和胚轴主要形成非胚性愈伤组织, 茎尖部
位形成胚性愈伤组织。食用稗的器官建成途径倾向于以不定芽途径再生植株。芽原基为外起源, 而根原基为内外起源兼有。
关键词: 食用稗; 成熟胚; 组织培养; 细胞学
Mature Embryo Culture and Cytological Characteristics of Echinochloa
frumentacea L.
WANG Jing, ZHANG Huan-Huan, FU Xue-Lin*, LIU Xiang-Dong*
Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
China
Abstract: The factors of matured embryos culture in Echinochloa frumentacea were studied. It showed that
N6+3.0 mg·L-1 2,4-D was the best medium for callus induction. Calli from basic medium of N6 had the ability to
regenerate more green shoots. High differentiation rate from calli in the medium of B5+3.0 mg·L-1 2,4-D+1.0
mg·L-1 6-BA was observed. And the medium of N6+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA was the most suitable for
green shoot differentiation. The differentiation rate of calli derived from shoot tips was better than that of calli
from roots. The highest rhizogenesis rate was obtained in the medium of 1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1 AC.
Histological anatomy showed that non-embryonic calli mainly grew from radicle and hypocotyl, whereas em-
bryonic calli grew from shoot tip. The organ-built way of E. frumentacea was inclined to be the adventitious
bud formation way. And the shoot primordium originated from the surface of callus, while the root primordium
originated from both the inside and surface of callus.
Key words: Echinochloa frumentacea; mature embryo; tissue culture; cytology
收稿 2008-08-14 修定 2008-10-23
资助 国家自然科学基金(30771328)和教育部 “高等学校优秀
青年教师教学科研奖励计划 ”(2 00 23 83 )。
致谢 实验得到汤丽云先生的技术指导和俞淑红女士的协助。
* 通讯作者(E-mail: fuxuelin@scau.edu.cn, xdliu@scau.edu.
cn; Tel: 020-85280205)。
食用稗, 又称湖南稗子或小米草, 广泛栽培于
亚洲热带及非洲温暖地区, 我国河南、安徽、四
川、广西、云南和台湾等地也有引种栽培。食
用稗除具有耐遮荫和耐瘠薄土壤的特性外, 其籽粒
的蛋白质含量高, 营养价值好, 可以作为优良饲料
或粮食。研究表明, 食用稗在盐逆境下高产且抗
盐, 是生产上的高产牧草, 同时又是牧草育种的良
好原材料(万力生和耿本仁1988; 王锁民等1995), 其
地上、地下部分极其发达, 既能很好地适应水生环
境, 生长优势超过水稻, 又能在干旱高温条件下保
持极强的生长优势, 同时还是一种典型的C4光合类
型植物, 它的光合速率明显高于目前已知的几种C4
植物, 是开展高光效转基因研究的重要供体资源。
王金明等(2007)采用RT-PCR技术克隆了家稗C4光
合途径的关键酶PPDK基因, 并对其进行了序列分
析和表达研究。张彬等(2007)首次将单子叶 C4植
物野生稗草(Echinochloa crusgalli)的磷酸烯醇式丙
酮酸羧化酶基因(Ecppc)导入不同基因型小麦受体,
并得到具有潮霉素(Hyg)抗性的转化植株。但是迄
今有关食用稗组织培养的研究仅见 Sa nkhl a 等
(1992)的报道, 他们以食用稗的幼穗作为外植体, 在
添加 3~5 mg·L-1 2,4-D的MS培养基上诱导产生出
3种不同质地和结构的愈伤组织, 其中质地致密且
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透明状的愈伤组织形成体细胞胚并分化出植
株。成熟胚是诱导愈伤组织常用的外植体, 具有
出愈率较高, 分化再生所需周期较短等优点。因
此, 有必要对食用稗的组织培养特性及其相关问题
进行详细研究。本文以食用稗去稃种子为外植体,
研究其成熟胚愈伤组织的诱导和分化特性, 并通过
培养过程的解剖和塑料半薄切片观察, 观察愈伤组
织发生及植株再生的形态学和细胞学变化, 旨在弄
清食用稗成熟胚的组培特性及其机制, 供进一步研
究、开发和利用食用稗的参考。
材料与方法
材料为食用稗(Echinochloa frumentacea L.)自
然授粉获得的种子, 由吉林省农业科学院水稻研究
所张三元先生提供。
取当季收获的食用稗种子晒干, 去掉果皮及稃
皮后75%酒精浸泡30 s, 无菌水冲洗 2次, 再用0.2%
HgCl2溶液灭菌 25 min, 经无菌水冲洗 4~5次后用
无菌滤纸吸干种子表面水分, 直接种到愈伤组织诱
导培养基上。每皿15粒, 10皿为1个重复, 每个处理2
个重复。 (25±1) ℃暗中培养或光照强度36 µmol·m-2·s-1
光照 24 h·d-1培养。40 d后统计愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织的外植体数 /
接种外植体总数 ×100%。
愈伤组织诱导的基本培养基为B5、N6和MS,
分别添加 1.0~3.0 mg·L-1 2,4-D和 0~1.0 mg·L-1 6-
BA、30 g·L-1蔗糖和 8 g·L-1琼脂。具体见表 1。
植株分化培养时选择相同诱导培养基中生长
旺盛的愈伤组织, 转接到不同分化培养基(表 2)上,
每皿接20块, 10皿为一个重复, 设2个重复, (25±1) ℃,
光照强度 36 µmol·m-2·s-1, 10 h·d-1培养, 30 d后统计
分化的芽数。按公式计算分化率: 绿芽分化率(%)=
分化出绿芽数 (个 ) / 接种愈伤组织块数 (块 )×
100%。
待芽长 3~4 cm时, 将芽切下转至生根培养基
(表 3)上诱导生根, 20 d后统计生根的芽数。按公
式计算根分化率: 根分化率(%)=生根的芽数(个)/培
养的芽数(个)×100%。
统计分析用 SPSS 10.0软件进行, 平均数据以
平均数 ±标准误(S. E.)表示, 计算 S. E.时作反正弦
转换, 方差分析采用邓肯氏新复极差检验法。
愈伤组织形成的形态学观察, 取在诱导培养基
表 2 食用稗的绿芽分化培养基
Table 2 Green shoot regeneration media of E. frumentacea
培养基代号 基本培养基 NAA浓度 /mg·L-1 6-BA浓度 /mg·L-1
F1 N6 0.5 1.0
F2 N6 0.5 2.0
F3 N6 0.5 3.0
F4 N6 1.0 2.0
F5 N6 2.0 2.0
上生长 1、2、3、4、5、6、7、1 0、1 3、
16、20、24 d的外植体, 置解剖镜下进行解剖观
察, 以判断愈伤组织的形成。
愈伤组织形成与分化的塑料半薄切片观察, 取
在诱导培养基上培养 1、2、3、4、5、6、7、
10、13、16、20、24 d的外植体, 室温下用 FAA
固定 48 h, 70%酒精冲洗 3次, 依次在 70%、80%、
90%、95%系列浓度酒精脱水, 每次间隔 30 min,
然后转入中间渗透液中, 置 4 ℃冰箱中 1~2 d后,
转入纯渗透液中在室温下渗透 1~7 d, 待材料呈半
透明状时, 将其包埋切片, 切片厚度 2~3 µm。
0.1%甲苯胺蓝染色 5 min, 待片子干燥后以中性
树胶封片, 在Leica DMRXA自动显微镜下观察并
拍照。
表 3 食用稗的生根培养基
Table 3 Root regeneration media of E. frumentacea
培养基代号 基本培养基 NAA浓度 /mg·L-1 AC浓度 /g·L-1
G1 1/2MS 1.0 1.0
G2 1/2MS 1.0 0
G3 1/2MS 0.2 1.0
G4 1/2MS 0.2 0
表 1 食用稗的愈伤组织诱导培养基
Table 1 Callus induction media of E. frumentacea
培养基代号 基本培养基 2,4-D浓度 /mg·L-1 6-BA浓度 /mg·L-1
L1 N6 3.0 0
L2 MS 3.0 0
L3 B5 1.0 0
L4 B5 2.0 0
L5 B5 3.0 0
L6 B5 3.0 0.2
L7 B5 3.0 0.5
L8 B5 3.0 1.0
植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1115
实验结果
1 食用稗成熟胚愈伤组织的诱导
观察了基本培养基、外源激素配比浓度和光
照条件对食用稗成熟胚愈伤组织诱导的影响。在
基本培养基为 B5、N6及MS的 3种诱导培养基上,
当 2,4-D浓度为 3.0 mg·L-1时, N6培养基上愈伤组
织诱导率最高, 其次是B5, MS培养基上愈伤诱导
率最低, 三者之间差异达显著水平[F=13834.81,
F0.05(2,3)=9.55] (表 4)。在B5基本培养基上添加不同
浓度的 2, 4-D和 6-BA的愈伤诱导结果表明(表 5),
在 6种激素组合中, 只添加 3.0 mg·L-1 2,4-D、不
添加 6-BA的 L5培养基上愈伤组织的诱导率最高,
为91.01%, 不同激素浓度组合的培养基愈伤组织诱
导率的差异达显著水平[F=63.87, F0.05(3,4)=6.59]。
说明添加相对高浓度的2,4-D有利于食用稗胚脱分
化形成愈伤组织, 而添加6-BA则不利于食用稗胚愈
伤组织的形成。此外, 将去稃种子接种在诱导培养
基 L5上, 分别置于暗培养和光照条件下培养。结
果表明, 暗培养和光照条件下的愈伤组织诱导率分
别是91.01%和65.01%, 差异达显著水平[F=241.71,
F0.05(1,2)=18.5] , 表明暗培养条件有利于食用稗胚愈
伤组织的形成。
表 4 基本培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 4 Influence of basic media on callus induction
培养基代号 基本培养基 愈伤诱导率 /%
L1 N6 94.49±0.06a
L5 B5 91.01±0.10b
L2 MS 69.99±0.10c
　　不同字母表示差异显著。下表同此。
中, 激素配比为3.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA的
培养基上来源的愈伤组织绿芽分化率最高。在不
含 6-BA的 3种诱导培养基(L3、L4、L5)中, 含 1.0
mg·L-1 2,4-D的 L3培养基上的愈伤组织分化率最
高。表明诱导培养基的 2,4-D浓度越高, 越不利于
分化。然而在添加同样 2,4-D和 6-BA的 3种培养
基(L8、L7、L6)中, 含 1.0 mg·L-1 6-BA的 L8培养
基的分化率最高, 它与另外两种培养基的分化率之
间的差异达显著水平。表明含有较高浓度6-BA的
诱导培养基的愈伤组织分化能力强。尤其在含 3.0
mg·L-1 2,4-D的培养基中添加 1.0 mg·L-1 6-BA能显
著提高愈伤组织的分化率, 表明高浓度的6-BA能缓
解 2,4-D对分化的抑制作用。可见诱导愈伤组织
表 5 激素浓度对愈伤组织诱导的影响
Table 5 Influence of phytohormone on callus induction
培养基代号 2,4-D浓度 /mg·L-1 6-BA浓度 /mg·L-1 愈伤诱导率 /%
L5 3.0 0 91.01±0.10a
L4 2.0 0 68.76±1.25b
L3 1.0 0 65.41±2.75bc
L7 3.0 0.5 57.35±2.67cd
L6 3.0 0.2 54.48±1.15d
L8 3.0 1.0 51.71±4.30d
2 食用稗成熟胚愈伤组织的绿芽分化
2.1 不同来源愈伤组织的绿芽分化 将来源于不同
诱导培养基上的愈伤组织接种到分化培养基 F1上
进行分化培养。由表 6可见, 基本培养基不同的愈
伤组织的绿芽分化率差异显著[F=27.87, F0.05(2,3)=
9.55], 3种基本培养基中, N6培养基诱导的愈伤组
织分化率最高, 表明该愈伤组织质量最好。
诱导培养基中的激素配比对愈伤组织分化率
的影响达显著水平[F=83.77, F0.05(5,6)=4.39] (表 7)。
在基本培养基同为B5的6种激素浓度的诱导培养基
表 6 来自不同基本培养基的愈伤组织的绿芽分化
Table 6 Shoot differentiations of calli derived
from different basic media
培养基代号 基本培养基 绿芽分化率 /%
L1 N6 15.74±1.02a
L2 MS 9.42±1.02b
L5 B5 5.51±0.43c
表 7 诱导培养基不同激素配比对愈伤组织分化的影响
Table 7 Influence of different phytohormone components in
induction media on shoot differentiations of calli
培养基 基本培 2,4-D浓度 / 6-BA浓度 / 绿芽分化
代号 养基 mg·L-1 mg·L-1 率 /%
L8 B5 3.0 1.0 15.31±0.82a
L3 B5 1.0 0 15.10±0.17a
L7 B5 3.0 0.5 6.43±0.76b
L4 B5 2.0 0 5.85±0.11b
L5 B5 3.0 0 5.51±0.43b
L6 B5 3.0 0.2 3.66±0.76c
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时的基本培养基和激素配比均对所产生愈伤组织的
绿芽分化产生影响。
在成熟胚愈伤组织诱导过程中, 发现种子根和
茎尖部位都会形成愈伤组织。将在培养基 L1中种
子根和茎尖部位的愈伤组织接种在分化培养基 F1
上进行绿芽分化。结果表明, 茎尖所形成愈伤组织
的分化率(36.41%)显著高于根的(5.31%) [F=208.69,
F0.05(1,2)=18.5], 表明茎尖愈伤组织的质量比种子根的
好, 易于分化绿芽。
2.2 外源激素对愈伤组织绿芽分化的影响 将愈伤
组织接种在不同激素配比的分化培养基F1~F5上进
行绿芽分化。由表 8可见, 不同的激素配比对愈伤
组织分化率的影响达显著水平[F=122.58, F0.05(4, 5)=
5.19]。5种培养基中, 除 F4和 F1的分化率差异不
显著外, 其余分化率差异均达显著水平。F2培养基
的分化率最高, 达到 8.71%。表明当分化培养基中
激素配比为 0.5 mg·L-1 NAA+2.0 mg·L-1 6-BA时最
有利于芽的分化。
且逐渐转变成白色至浅黄色的颗粒, 最终形成质量
较差的愈伤组织。茎尖部位在10 d时开始膨大, 膨
大处有浅黄色小颗粒形成; 20 d后这些小颗粒逐渐
长大最终形成质量较好的愈伤组织(图 1-a)。
4 食用稗胚愈伤组织发生的形态学变化
在解剖镜下进一步观察发现, 外植体诱导培养
2 d时, 芽突破种皮, 根伸长, 根基部形成一团水浸
状类似愈伤组织的细胞团。10 d时, 该细胞团明
显膨大, 形成愈伤组织, 其内部包裹一条或几条类
似不定根的结构; 茎尖部位形成圆周状膨大, 并于
膨大处出现半透明或淡黄色的不规则突起。16 d
时水浸状的表层下逐渐形成淡黄色、质地脆软的
颗粒状愈伤组织, 内部包裹结构较为致密的白色小
颗粒; 茎尖部位膨大由水浸状变得较为干燥, 并且
形成白色至淡黄色的块状愈伤组织; 24 d不定根周
围的愈伤组织逐渐变多、长大, 且易散落(图 1-b、
c); 茎尖部位形成淡黄色愈伤组织, 进一步解剖, 发
现内部包裹一条状物, 条状物一端膨大形成鲜黄色
结构致密的愈伤组织(图 1-d、e)。
5 食用稗胚愈伤组织发生的细胞学变化
外植体诱导培养2 d后, 胚芽萌发突破种皮, 胚
芽表皮下为不规则薄壁细胞, 这些细胞失去了原来
的结构和功能, 成为具分生特性的细胞; 胚根维管
束周围细胞染色较深, 细胞质浓厚, 液泡化程度低,
细胞核大且位于细胞中央, 核仁明显, 具双核仁, 标
志着细胞启动脱分化过程(图 1-f)。3 d后, 胚轴维
管束周围形成分生细胞团(图 2-a)。4 d后, 根维
管束附近的分生细胞团形成具有明显根冠组织的根
原基, 根原基背向维管束向外生长, 逐渐突破表皮
(图 2-b)。6 d后, 愈伤组织内部形成单细胞及多细
胞原胚(图 2-c), 这些原胚一般情况下不能发育成
熟。10 d后, 胚根上的非胚性愈伤组织表皮处有根
原基形成; 茎尖分生区皮层深处的薄壁细胞和胚轴
维管束鞘细胞细胞质变浓, 细胞核变大且移至细胞
中央, 出现明显的核仁, 液泡化程度降低, 启动脱分
化过程(图 2-d、e)。13 d后, 维管束周围形成的
愈伤组织表皮处细胞质变浓, 形成芽原基(图 2-f)。
表明芽原基的发生是外起源的, 往往发生于愈伤组
织的表面或近表面。
讨　　论
有关稗属植物组织培养的研究报道不多。
表 8 分化培养基中激素对愈伤组织分化的影响
Table 8 Influence of phytohormones in regeneration
media on shoot differentiation
培养基代号 NAA浓度 /mg·L-1 6-BA浓度 /mg·L-1 分化率 /%
F2 0.5 2.0 8.71±0.55a
F3 0.5 3.0 4.22±0.01b
F4 1.0 2.0 2.37±0.22c
F1 0.5 1.0 2.22±0.49c
F5 2.0 2.0 1.12±0.03d
2.3 外源激素和活性炭对生根的影响 将高为 3~4
cm的幼苗转至不同的生根培养基中诱导生根。在
4种培养基中(表 3), 只有添加0.2 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1
AC的 G3培养基上的幼苗有根长出, 根分化率为
86.75%。20 d左右可长出 5 cm左右的 1~6条根,
炼苗 2~3 d即可移栽。表明低浓度的生长素和适
量活性炭有利于根的形成。
3 食用稗胚愈伤组织的形成过程
食用稗去稃种子接种到愈伤组织诱导培养基
上后, 1 d萌发出根; 2 d萌发出芽。4~7 d根部出
现水浸状物质, 并逐渐覆盖整条根, 胚轴两侧出现
许多白色小颗粒状突起, 并逐渐被水浸状物质所覆
盖。10 d根及胚轴上的水浸状物质逐渐膨大, 并
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图 1 食用稗成熟胚愈伤组织的形态及解剖结构
Fig.1 Morphology and anatomy structure of callus in matured embryos of E. frumentacea
a: 培养 40 d, 根及胚轴形成湿软的淡黄色愈伤组织, 同时茎尖部位形成乳白色、质地松脆的愈伤组织(箭头所示); b: 培养 24 d,
根及胚轴形成带有黏液的淡黄色颗粒状愈伤组织(×10.65); c: 培养 24 d, 根上颗粒状愈伤组织质地脆软, 内部包裹一条不定根(箭头所
示, ×37.5); d: 培养 24 d, 淡黄色茎尖愈伤(×10.65); e: 培养 24 d, 茎尖愈伤内部包裹的金黄色愈伤组织(箭头所示, ×37.5); f: 培养 2 d
种子, 胚轴维管束鞘细胞启动(箭头所示, ×400)。
Sankhla等(1992)以食用稗的幼穗作为外植体, 在添
加 3~5 mg·L-1 2,4-D 的MS培养基上诱导产生出 3
种不同质地和结构的愈伤组织 , 其中质地致密
且透明状的愈伤组织形成了体细胞胚并分化出
植株。光头稗(E. colonum)是食用稗的近缘野生
种(Yamaguchi等 2005), 由于其对重金属和其他逆
境胁迫具有较强的抗性, 因此成为育种家关注的重
要资源之一。对其体细胞胚发生途径和器官再生
途径的研究是提供利用体细胞融合和DNA重组技
术将其抗性基因转入作物育种的重要基础。
Samantaray等(1997)以光头稗的叶基和叶尖作为外
植体诱导体细胞胚胎发生, 并再生出植株。而且叶
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图 2 食用稗胚愈伤组织的形成
Fig.2 Callus formation process of E. fumentacea
a: 培养 3 d, 胚轴维管束周围分生细胞团(箭头所示, ×200); b: 培养 4 d, 根维管束的分生细胞团形成具有明显根冠组织的根原基(箭
头所示, ×100); c: 培养 6 d, 空腔内形成单细胞原胚、二细胞原胚和四细胞原胚(×1 000); d: 培养 10 d, 茎尖胚轴维管束鞘细胞启动(箭
头所示, ×400); e: 培养 10 d, 茎尖薄壁细胞启动(箭头所示, ×400); f: 培养 13 d, 愈伤组织表皮和下表皮细胞再次启动, 形成芽原基(箭
头所示, ×400)。
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基比叶尖的体细胞胚产率高。证明了体细胞胚发
生途径是光头稗离体培养再生植株的可行途径。
为了探明食用稗胚的组织培养特性, 本文对影
响食用稗胚培养的因素进行了探讨, 并观察了组织
培养过程中外植体的形态学和细胞学变化。结果
表明在食用稗胚愈伤组织诱导时, 培养基成分对愈
伤组织的形成有显著影响。最适宜采用的诱导培
养基为N6+3.0 mg·L-1 2,4-D。此外, 光照对愈伤组
织诱导率的影响显著, 暗培养条件下诱导率明显高
于光照培养诱导率。诱导培养基显著影响愈伤组
织的质量, 而芽分化率受愈伤组织质量的影响。3
种基本培养基中, N6+3.0 mg·L-1 2,4-D培养基诱导
出的愈伤组织的分化率最高。基本培养基同为 B5
的6种激素配比中, 3.0 mg·L-1 2,4-D+1.0 mg·L-1 6-BA
诱导出的愈伤组织的分化率最高。生长于外植体
不同部位的愈伤组织的分化率也有显著差异, 茎尖
愈伤组织的分化率比根的高。外源激素对愈伤组
织分化率的影响也很显著, 基本培养基同为N6的5
种激素配比中, 0.5 mg·L-1 NAA+2.0 mg·L-1 6-BA的
分化率最高。活性炭和NAA对组培苗的生根均有
显著影响, 最佳的生根培养基为 1/2MS+0.2 mg·L-1
NAA+1 g·L-1 AC, 不添加活性炭或NAA浓度过高都
不能形成根。
胚根及胚轴主要形成非胚性愈伤组织, 很少能
够分化成苗。茎尖部位形成 2种愈伤组织, 一种是
结构致密、质地坚硬的块状愈伤组织, 另一种是介
于块状和颗粒状之间的愈伤组织。这两种愈伤组
织都是较易分化的胚性愈伤组织。食用稗的胚根
及胚轴愈伤组织由维管束鞘细胞启动分裂形成, 茎
尖愈伤组织由维管束鞘细胞和周围薄壁细胞分裂形
成。食用稗的愈伤组织器官建成途径倾向于以不
定芽途径再生植株。芽原基起源于愈伤组织的表
皮和下表皮细胞, 为外起源; 根原基形成于维管束
鞘细胞或表皮和下表皮细胞, 因此根原基为内外起
源兼有。
参考文献
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