全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月392
叶绿体中Calvin循环多酶复合体
李瑞，陆巍 *，周玮
南京农业大学生命科学学院，南京 210095
Calvin Cycle Multi-Enzyme Complexes in Chloroplast
LI Rui, LU Wei*, ZHOU Wei
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
提要：从Calvin循环、多酶复合体分离及其特性、可溶性酶组合成多酶复合体的优势及其与类囊体膜的结合对Calvin循
环多酶复合体的研究进展作了介绍。
关键词：Calvin循环；多酶复合体；类囊体膜
收稿 2007-12-07 修定 2008-04-10
资助 南京农业大学科技创新基金(Y2 00 52 3)。
* 通讯作者( E -ma i l：l u w @n j a u . e d u . c n；T el：0 2 5 -
8 4 3 9 5 4 2 3 )。
以往的研究认为，细胞及其细胞器内充满了
游离分子，精确的化学反应是通过这些游离分子
的非目的性碰撞而发生的，但现代科学家们对这
个观点提出了质疑。目前，根据蛋白质浓度、蛋
白质在胞液中的溶解能力、酶 -酶之间的相互作
用提出：代谢途径的酶在体内应该以复合体的形
式存在，并且这种复合体与亚细胞结构和生物膜
相结合，为“底物穿梭”提供更加便利的通道，
继而提高体内蛋白拥挤的环境中的代谢效率(Srere
1987)。尽管可溶性酶的组合在蛋白质拥挤的环境
中有显著的生理作用，但是用生物化学和分子生
物学的技术证明这种观点是非常困难的，因此这
种复合体的形成及其代谢重要性遂成为争论的主
题。
一些动物和微生物细胞中的多酶复合体已有
广泛研究(Srere 1980；Ovadi 1988；Keleti等
1989)，但关于植物代谢途径中酶的组合信息则很
有限(Hrazdina和 Jensen 1992)，且大多数集中于
电子传递链组分的研究。植物生物化学研究的目
的之一就是提高植物体中代谢的效率，其中也包
括作物的光合作用，因此了解体内这种多分子组
合及其对代谢途径的调控就非常重要。本文对叶
绿体基质中可溶性酶之间组合成多酶复合体以及可
溶性酶与类囊体膜结合的研究进展作介绍。
1 Calvin循环
Calvin循环利用光合作用原初反应和氧释放、
光合磷酸化以及电子传递的反应产物 A T P 和
NADPH，将活跃的化学能转换为贮存在糖类中的
稳定的化学能，以供给生命活动的需要，即碳同
化。这个循环在叶绿体基质中进行，需要 11种
酶来催化 13 个连续的反应，分为 3 个阶段，即
羧化阶段、还原阶段和更新阶段，具体的反应过
程如图 1。
长期以来一直认为 Calvin循环中的各个酶都
图 1 Calvin循环[根据Raines (2003)略加修改]
A：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶(Rubisco); B：3-磷
酸甘油酸激酶(PGK) ; C：3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH); D：
丙糖磷酸异构酶(TPI); E：醛缩酶(a ldolase); F：果糖 -1,6-二
磷酸磷酸酶(FBPase); G：转酮酶(transketolase); H：景天庚
酮糖 -1,7-二磷酸酶(SBPase); I：核酮糖 -5-磷酸差向异构酶(Ru-
5-P epimerase); J：核糖磷酸异构酶(RPI); K：磷酸核酮糖激
酶(R PK )。3 -PG A：3 - 磷酸甘油酸；1 ,3 -PG A：1 ,3 - 二磷酸
甘油酸；G - 3 - P：3 - 磷酸甘油醛；D H A P：二羟丙酮磷酸；
Fru -1 ,6 -P：果糖 -1 , 6 - 二磷酸；Fru -6 -P：果糖 -6 - 磷酸；E-
4-P：赤藓糖 -4-磷酸；Sed-1,7-P：景天庚酮糖 -1 ,7-二磷酸；
S ed -7 -P：景天庚酮糖 -7 - 磷酸；R -5 -P：核糖 -5 - 磷酸；X -
5 -P：木酮糖 -5 - 磷酸；R u -5 -P：核酮糖 -5 - 磷酸；R u -1 , 5 -
P：核酮糖 - 1 , 5 - 二磷酸。
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是以可溶性状态游离存在于高等植物叶绿体中的，
直到上个世纪 60年代，Calvin循环中的酶相互结
合形成多酶复合体才被发现(van Noort和Wildman
1964；Mendiola和Akazawa 1964)。目前，许多
实验室已经从叶绿体中分离纯化得到Calvin循环一
些酶组成的多酶复合体。
2 多酶复合体的分离与特性
Müller (1972)认为一些CO2固定酶可能是以一
种易解离的复合体形式存在的，但是一般可溶性
酶之间的相互作用是弱而短暂的，因此它们的多
分子组合的研究比较难，尽管有人曾用不同的手
段观察到了 Calvin循环酶之间的多酶组合。
Sainis和Harris (1986，1987)根据蔗糖密度梯
度离心分离得到的豌豆和菠菜叶绿体基质提取物
中，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶(Rubisco,
EC 4.1.1.39)组分可以核糖 -5-磷酸(R-5-P)为底物
表现出依赖ATP的羧化活性，这表明核糖磷酸异
构酶(RPI, EC 5.3.1.6)、磷酸核酮糖激酶(RPK, EC
2.7.1.19)与 Rubisco可以作为一个整体而纯化出
来，后又发现几乎所有 RPK都可与羧化酶结合。
Gontero等(1988)用离子交换层析、分子筛层
析和羟基磷灰石柱层析方法从菠菜中纯化出一个由
5个酶组成的复合体，这些酶是卡尔文循环过程
中的连续酶，包括 RPI、RPK、Rubisco、3-磷
酸甘油酸激酶(PGK, EC 2.7.2.3)和 3-磷酸甘油醛
脱氢酶(GAPDH, EC 1.2.1.13)，这个复合体的分
子量为 540 kDa。由这 5个酶组成的复合体催化的
反应过程如下：
　　核糖 -5-磷酸 —→ 核酮糖 -5-磷酸 —→ 核酮
糖 -1,5-二磷酸 ———→ 3-磷酸甘油酸 —→1,3-
二磷酸甘油酸——→ 3-磷酸甘油醛+NAD++H3PO4
Babadzhanova等(2002)在棉花叶片中也分离得
到包括这 5个酶的多酶复合体，此种复合体分为
游离的和类囊体膜结合的两种形式，分子量分别
为(520±20) kDa和(640±25) kDa。2006年他们
(Babadzhanova等 2006)又在生长 15~25 d (6~8真
叶阶段、花芽形成期间、开花期间)的棉花叶片
中分离出分子量分别为(240±10) kDa和(520±20)
kDa的游离多酶复合体，并对发育过程中的 RPI、
RPK和 Rubisco的活性变化进行了比较研究，结
果表明多酶复合体中的 RPI和 RPK与单一酶相比
活性变化不显著，Rubisco活性变化显著，生殖
器官形成阶段复合体酶活性和光合速率最高。
Rault等(1993)研究由这 5个酶组成的复合体
的结构和功能特性的结果表明，此种复合体中每
一酶组分的四级结构都不同于游离的单一酶的四级
结构，其动力学研究(Gontero等 1993)结果表明，
复合体中的酶有较高的 Vmax和较低的 Km。Ricard
等(1994)提出，不同的酶组合成多酶复合体后其
催化特性发生变化，这种变化与不同活化位点之
间的反应中间产物通道无关，而是多酶复合体中
酶彼此之间信息传递的结果( Ri ca rd 等 1 99 4；
Gontero等 1994)。
迄今研究较多的是由GAPDH和RPK组成的多
酶复合体，这 2个酶在 Calvin循环过程中催化不
连续的反应，但也可以结合成为复合体而存在。
Nicholson等(1987)在斜生栅列藻(Scenedesmus
obliquus)中分离得到一个稳定的含有GAPDH和
RPK的复合体，分子量为 560 kDa，这 2个酶呈
结合状态，彼此之间的动力学特性相互影响。在
衣藻(Chlamydomons reinhardtii)的叶绿体中也分离
和纯化出一个含有 RPK和GAPDH的双酶复合体
(Lebreton等 1997；Avilan等 1997)，热力学统计
的结果表明其蛋白之间有信息和能量传递。复合
体的稳定或不稳定是通过构象变化来反映的，而
这种构象变化则是通过蛋白质-蛋白质的相互作用
表现出来，最终各组分之间产生互相结合的指
纹。构象变化的热力学研究表明GAPDH和 RPK
即使在分离之后仍然携带有这些指纹，最终引起
一些辅助因子的动力学特性发生变化(Lebreton等
1997；Avilan等 1997；Lebreton和Gontero 1999；
Graciet等 2002)。Mouche等(2002)采用多重技术
相结合的方法研究衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)
中GAPDH和RPK组成的多酶复合体的结果表明，
二聚体的RPK在与四聚体的GAPDH结合和分离的
循环过程中的活性有显著变化；低温电子显微镜
观察表明分离的和模型化的RPK二聚体和整个复
合体的三维结构的对应体之间在结构上有显著变
化。RPK与GAPDH之间相互结合，并可以利用
原初反应和氧释放、光合磷酸化和电子传递反应
中产生的ATP和NADPH，此种双酶复合体中2个
酶之间相互协同调控，定义为一个“控制单位”
——Calvin循环是光、pH和代谢物调控的一个起
始点。因此认为，RPK与GAPDH之间的蛋白质 -
RPK
Rubisco PGK
GAPDH
RPI
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蛋白质相互作用可更好地调控Calvin循环(Lebreton
和 Gontero 1999)。
近 2年来还发现，GAPDH和 RPK组成的多
酶复合体还可与 CP12共同组成一个多酶复合体，
CP12是一个核基因编码的分子量为 8.5 kDa的叶
绿体蛋白，在超分子复合体装配中起蛋白连接子
的作用(Graciet等 2003)，GAPDH、RPK和 CP12
的组装模型如图 2所示，首先GAPDH与CP12相
互结合，解离常数接近 0.44 nmol·L-1，这种结合
可能使GAPDH构象发生改变，而后GAPDH/CP12
复合体与RPK相互结合，其解离常数为 60 nmol·L-1，
最终形成半个复合体，定义为一个单位。这个单
位以二聚体形式最终形成包括2个二聚体的RPK，
2个四聚体的GAPDH，可能是 2个单体 CP12的
复合体。Graciet等(2004)曾对GAPDH/CP12/RPK
组成的复合体的动力学、调控特性及其在 CO2同
化中的作用作了详细综述。Marri等(2005)也曾对
拟南芥进行体外重组得到GAPDH/CP12/RPK相互
结合的复合体，其分子量为 640 kDa。
磷酸酶(SBPase, EC 3.1.3.37)、铁氧还蛋白NADP
还原酶(FNR, EC 1.18.1.1)的多酶复合体，其分子
量为 900 kDa。这一复合体在低离子强度溶液中
比较稳定，Calvin循环酶形成催化链，以 5-磷酸
核糖为底物，经过多步连续酶促反应合成 3-磷酸
甘油酸，这种“底物穿梭”可大幅度的增加催
化效率。Jebanathirajah和 Coleman (1998)用快速
蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,
FPLC)，从烟草叶绿体中分离得到碳酸酐酶(CA,
EC 4.2.1.1)与 Rubisco、RPK、RPI相结合的多酶
复合体，其分子量高于600 kDa，CA可能与Rubisco
结合在卡尔文循环多酶复合体的外侧，RPK位于
复合体中心，并与类囊体膜结合。
总之，这些体外研究的结果表明，大部分参
与 Calvin循环的酶均可以结合成为多酶复合体，
但不同复合体之间的酶组分则不完全相同，酶组
分之间没有确定的化学计量比(表 1)。Raul t 等
(1993)采用免疫化学和光密度分析相结合的方法研
究由 RPI、RPK、Rubisco、PGK和 GAPDH组
成的多酶复合体中酶组分的化学计量比时发现，
多酶复合体含有 RPK的 2个亚基、RPI的 2个亚
基、Rubisco的 2个大亚基(L)和 4个小亚基(S)、
PGK的1个亚基、GAPDH的 2个不同的亚基(α亚
基和 β亚基)。Hosur等(1993)分析Rubisco/RPK多
酶复合体的结晶和结构时，发现Rubisco是正常的
L8S8形式，但对其中一些晶体进行X-ray衍射的结
果表明，晶体 Rubisco除正常 L8S8形式之外还有
其他的形式，如上面所说的 L2S4的形式，这可能
是多酶复合体中其他酶影响造成的。根据不同实
验室的结果可以认为，其原因可能是采用的提取
和纯化程序不同造成的，也可能是多分子之间结
合的松紧程度不同和动态变化造成的。体内由基
质酶和膜结合的酶组成的蛋白复合体可能是蛋白网
络排列的，而不是按单个酶组分“无秩序的”随
机分布排列的，因此溶解于水介质中时的多酶复
合体会趋向解离，各组分分开，只有非常稳定的
酶复合体在提取之后才有可能在非生理的液相环境
中仍然保持结合状态，分离出来可用于特征研
究，否则就难以确定多酶复合体中酶组分的化学
计量比。
另外，分离 Calvin循环中酶复合体时也不能
排除实验操作过程中由于人为因素而引起部分游离
图 2 衣藻(C. reinhardtii)的GAPDH/RPK/CP12复合体组
装模型[根据Graciet等(2003)略加修改]
除了由 5个酶和 2个酶组成的多酶复合体之
外，人们还发现了由其他不同酶组分组成的
Calvin循环多酶复合体。Persson和 Johansson
(1989)用液体两相系统的逆流分配探测 6个Calvin
循环酶的共分配现象的结果表明这些酶之间存在蛋
白质 -蛋白质复合体趋势，这些酶包括 Rubisco、
PGK、GAPDH、丙糖磷酸异构酶(TPI, EC 5.3.1.1)、
醛缩酶、果糖 -1,6-二磷酸磷酸酶(FBPase, EC 3.
1 .3 .11)。Süss等(1993)分离出一个含有 RPI、
RPK、Rubisco、GAPDH、景天庚酮糖 -1,7-二
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酶自由组合成多酶复合体，应该采用灵敏度高的
检测方法证明新鲜细胞器提取物中的酶是聚合成复
合体而不是人为因素造成的。Süss等(1993)用限
制性蛋白酶水解和免疫印迹相结合的方法证实了这
一点。这个方法是建立在 Lys和Arg残基通常参
与寡聚蛋白蛋白交界面形成的基础之上的。如果
能够切割这 2种氨基酸的肽键进而使蛋白组分分
开，则所有的样品都可在同一介质中进行蛋白酶
水解，反过来，特定酶需要具有同一构型；与
单一酶相比，多肽的差异应该是由蛋白质 -蛋白
质之间的相互作用引起的。单独的酶可能更容易
受到特异性蛋白酶的影响和裂解，而如果这些组
分结合到多酶系统中就不易受蛋白酶水解的影响。
经证明，专一的裂解精氨酸和赖氨酸残基的胰蛋
白酶是这一实验中的常用品，有人用胰蛋白酶已
成功证明RPK和GAPDH在新鲜准备的基质提取物
中是相互结合的。此外，在不同离子强度下
Calvin循环酶复合体的解离也可采用这种技术加以
证明(Süss等 1993)。从这些结果中还可以看出，
基质提取物的任何处理都可能引起Calvin循环多酶
复合体的解离，这就可以解释为什么从同样的提
取物中分离的Calvin循环多酶复合体有组分的差异
和分子量高低之分。如同 Calvin循环一样，其他
代谢途径的连续酶也可以在叶绿体中结合成为多酶
复合体，这样所有代谢反应才可以在一个协调的
环境中进行，光反应也才可以更有效地利用能
量，产生还原力，有关其他代谢途径中酶组合的
信息尚少，还有待继续研究。
3 可溶性酶组合成多酶复合体的优势及其与类囊
体膜的结合
植物体内的一些代谢途径可以共享同样的代
谢中间产物，并同时在特定的时间内于拥挤的环
境中进行，因此将酶之间代谢途径的细微区域化
与底物通道连接起来研究是非常必要的，这就可
以将这些代谢途径的共同底物和辅助因子之间的竞
争降到最低，代谢过程得以有效进行。Süss 等
(1993)提出，多酶组合能够使 CO2同化所需组分
和辅助因子(ATP和NADPH)更加便利的运输到催
化位点，还可以防止其他代谢途径的干扰。Rault
等(1993)研究 RPI、RPK、Rubisco、PGK 和
G A P D H 构成的复合体的动力学结果表明，
Rubisco以复合体形式存在时，其催化效率提高，
这可能是每一活化位点的Vmax增加和Km下降造成
的。Sainis和 Jawali (1994)在体外观察到，由
RPI、RPK、Rubisco组成的 Calvin循环多酶复合
体可以表现出以R-5-P为底物和依赖ATP的CO2固
定活性，可为中间代谢物提供通道，致使Rubisco
的催化反应更加便利。PGK和GAPDH在体外的
相互结合表明二者之间可以相互作用，并可为
1 , 3 - 二磷酸甘油酸的穿梭提供通道( W a n g 等
1996)。Brenda (2004)认为，酶结合成复合体后
的最大优势就是可使一些生物合成的代谢中间产物
更加便利的运输到催化位点，而不是在细胞内聚
成团，这种代谢通道在提高和调控细胞的生物化
表 1 不同植物体中含有包括不同亚基的复合体
植物 亚基数目 亚基种类 参考文献
斜生栅列藻 2 GAPDH, RPK Nicholson等 1987
衣藻 Lebreton等 1997
衣藻 Lebreton和 Gontero 1999
衣藻 Avilan等 1997
衣藻 Graciet等 2002
衣藻 Mouche等 2002
拟南芥 3 GAPDH, RPK, CP12 Marri等 2005
豌豆和菠菜 Rubisco, RPI, RPK Sainis和 Harris 1986，1987
烟草 4 CA, Rubisco, RPK, RPI Jebanathiraja和 Coleman 1998
菠菜 5 Rubisco, RPK, RPI, GAPDH, PGK Gontero等 1988
棉花 Babadzhanova等 2002，2006
菠菜 Rault等 1993
菠菜 Gontero等 1993
菠菜 6 Rubisco, PGK, GAPDH, TPI, 醛缩酶, FBPase Persson和 Johansson 1989
菠菜 RPI, RPK, Rubisco, GAPDH, SBPase, FNR Süss等 1993
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学反应中发挥作用。一般，多酶复合体可以为
“底物穿梭”提供更加便利的通道，从而提高酶
催化效率，同时还可增加酶结构的稳定性，其在
体内蛋白质拥挤的环境中的优势更明显。
除了可溶性酶之间可以相互作用结合成复合体
以外，可溶性酶还可与类囊体膜结合。已有的研
究表明，Rubisco、FBPase、RPK、GAPDH、
PGK和 RPI可结合在类囊体膜上(Mori等 1984；
Hermoso等 1989；Sainis和 Melzer 2005)，H+-ATP
合酶可以为 Rubisco提供膜结合位点(Sainis和
Melzer 2005)。但实验过程中由于一些人工操作所
引起的酶吸附在类囊体膜上的假象不能被排除，
这一问题已可以通过低温固定叶切片和免疫电镜加
以解决。早期的免疫化学研究表明，Rubisco分
子随机分布在叶绿体基质中(Shaw和 Henwood
1985；Vaughn 1987)，其他的卡尔文循环酶也是
均匀分布的，但有人用免疫电镜研究的结果对此
种假设提出了质疑，发现卡尔文循环中的酶，
如：RPK、GAPDH和 SBPase都结合在类囊体膜
上(Süss等1993)。此外，还有人发现微藻中的RPK
也结合在类囊体膜上(Mangeney等 1987)，更有人
发现 FBPase和硫氧还蛋白也结合在类囊体膜上
(Hermoso等 1992)。在衣藻的叶绿体中用免疫电镜
可以观察到 Calvin循环酶，如 RPI、GAPDH、
FBPase、醛缩酶和 PGK在体内均与类囊体膜结合
(Süss等 1995)。豌豆叶片的免疫定位观察表明，
60%的GAPDH和 54%的 PGK结合于类囊体膜上
(Wang等 1996)。而Anderson等(1996)对豌豆叶片进
行免疫定位后发现大部分的 PGK、SBPase，一半
的GAPDH、RPK，小部分的 TPI、醛缩酶、CA
都是与类囊体膜结合的。此外Teige等(1998)报道
Calvin循环中的一些次要酶类型，如：核酮糖 -5-
磷酸差向异构酶、转酮酶也都结合在类囊体膜上。
FNR可与包括GAPDH在内的Calvin循环多酶
复合体一同分离得到(Süss等 1993)，它也是与类
囊体膜结合的电子传递链的组分之一，因此推测
PSI和 Calvin循环之间有密切关系。GAPDH是卡
尔文循环中唯一依赖NAPDH的酶，但在基质提取
物的免疫亲和层析中用抗FNR和抗GAPDH的抗体
的结果表明二者是相互结合的(Sainis和Melzer
2005)。PSI的 E亚基是 FNR在类囊体膜上的主要
结合位点(Andersen等 1992)。这表明 FNR的功能
并不是简单的作为Calvin循环多酶复合体到PSI之
间的膜连接器，FNR与GAPDH的结合可以认为
是NADP+/NADPH的通道，这样光反应产生的还
原力NADPH就可更加便利的运输到暗反应，提高
光合速率。
总之，根据前人的研究可以推断，多酶复合
体与类囊体膜结合可以使膜上的代谢物通道更加通
畅，各类代谢途径可以互相连接，同时还可以用
以解释高等植物中有效的光合电子传递和CO2固定
之间的耦联。此外，非液相介质可以显著增加可
溶性酶的稳定性和周转数量，酶与膜结合后会限
制水在酶层中的分布，并在催化位点上产生一个
非极性的环境，从而促使酶的稳定性和周转数量
增加，进而更加便利的发挥其催化作用。酶与膜
结合还可以延长酶的寿命，二者结合后可以阻止
酶聚集和钝化(Bell等 1995)，因此，Calvin循环
酶与类囊体膜结合的研究是有意义的。
4 结语
Calvin循环在植物合成代谢中是一个独特的过
程，在 CO 2 同化中起作用，它与绿色植物、藻
类和光合细菌的生物量和产量、温室气体减少等
有着密切的联系。迄今对 Calvin循环个体酶的研
究比较多，长期以来一直认为Rubisco是这一途径
的限速酶(Man 1999)，因此，对 Rubisco在蛋白
和基因水平上做了大量研究(Spreitzer和 Salvucci
2002)。但Quick等(1992)对 Rubisco是限速酶这
一概念提出了质疑，Raines (2003)对 Calvin循环
的综述中也表明在各种环境条件下，Rubisco对碳
固定的影响很小，FBPase、RPK、GAPDH、醛
缩酶和转酮酶却有着不可忽视的作用，而 SBPase
是 Calvin循环的限速酶，并且要更加重视对酶复
合体的研究，特别是关于复合体中酶活性调控的
机制的研究。因此这就要求我们重新考虑代谢途
径的控制是否还将仍然停留在代谢途径单个酶的活
性上。
尽管Calvin-Benson循环多酶复合体已经得到
证实，但仍有很多问题没有解决。首先是各个实
验室得到的多酶复合体的组成有差异，不仅表现
在不同物种上，同一物种之间也有很大的差异，
这些差异需要用更多的材料作实验，这样才可在
更大范围的高等植物叶绿体中进行比较，验证其
普遍性；其次是揭示多酶复合体的空间结构特
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点，即各个酶是如何组装的，哪个酶在复合体的
内部，哪个酶在复合体的外部，它们是如何相互
作用的，其超分子的空间结构又是如何，迄今这
方面的报道还很少，只有一些结构模型的猜想(图
2)，因此这也是未来研究 Calvin循环多酶复合体
可能要解决的问题；最后也是最本质的问题是多
酶复合体的生理意义和其结构功能的研究，其目
的都是为了揭示多酶复合体在生物体内的作用。
因此在光合作用机制和蛋白质结构的研究中，多
酶复合体的相互结合，并能表现出各个酶的催化
活性的探讨，无论是在体内或是体外进行验证都
有意义。
参考文献
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