全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 45
迷你玫瑰组织培养中细菌污染的防止
由翠荣* 曲复宁 龚雪琴 林荣双
烟台大学生物化学系, 烟台264005
提要 迷你玫瑰组织快繁体系连续继代过程中，插入培养基的试管苗切口处有云雾状污染菌生长，其中 2 种为革兰氏
阴性杆菌，1 种为革兰氏阳性杆菌。培养基中加入氨苄青霉素(50~150 mg.L-1)抑制污染菌生长，不影响试管苗不定芽分
化率，50 mg.L-1 的氨苄青霉素明显促进染菌苗的生根。加入硫酸丁胺卡那霉素(25~100 mg.L-1)有杀灭污染菌的作用，但
对试管苗则有不同程度的毒害(叶片、叶柄和茎段出现黄化现象)，对不定芽分化和生根也有明显的抑制。
关键词 迷你玫瑰; 组织培养; 氨苄青霉素; 硫酸丁胺卡那霉素; 抑菌作用
Control of Bacterial Contaminants in Tissue Cultures of Rosa hybrida cv. mini
YOU Cui-Rong*, QU Fu-Ning, GONG Xue-Qin, LIN Rong-Shuang
Department of Biochemistry, Yantai University, Yantai 264005
Abstract Bacterial contamination is observed as faint clouds in the medium after repeated subculture period
of mini-rose micropropagation system. The contaminants are purified and identified as two different kinds of
Gram-negative and one kind of Gram-positive rod bacteria. The two antibiotics, ampicillin and kanamycin
sulphate which concentrations are respectively 50~150 mg.L-1 and 25~100 mg.L- 1 are used in the culture media.
The result shows that ampicillin has bacteriostatic effect on contaminants and that the effect on adventitious-
bud differentiation of contaminated plants after the treatments of different ampicillin’s concentrations has also
no evident difference as that of normal plants and the treatment concentration (50 mg.L-1) greatly advances the
root formation rate of the contaminated plantlets. The treatments of different concentrations of kanamycin
sulphate well kill the contaminants and have phytotoxic influence on the contaminated plantlets, which leaves,
shoots and stems turn yellow. They have also greatly reduced adventitious-bud differentiation and their root
formation rate.
Key words Rosa hybrida; tissue culture; ampicillin; kanamycin sulphate; bacteriostatic effect
收稿 2003-03-10 修定 　 2003-09-11
*E-mail: ycr@ytu.edu.cn, Tel: 0535-6901995
植物组织培养中的污染是一个很普遍的现
象，因此无菌操作和培养环境的洁净对减少组培
物污染率来说都很重要[1～3]。据报道，多种植物
在建立快繁体系后连续继代多次，体系中经常会
有污染菌的出现。此类污染菌只生长在试管苗插
入培养基的切口处，在培养基中生长极其缓慢，
呈云雾状。这在松柏类植物[4,5]和香蕉的茎尖培养[6]
中都有过报道。本文探讨迷你玫瑰继代培养过程
中抗生素防止细菌污染的效应，以及抗生素对组
培苗分化和生根的影响。
材料与方法
迷你玫瑰(Rosa hybrida cv. mini)快繁体系连续
多次继代后， 部分试管苗插入培养基的切口处出现
云雾状污染菌, 将此污染试管苗培养在1/2 MS+6-BA
1 mg.L-1 附加氨苄青霉素（0、50、100、150 mg.
L -1）或硫酸丁胺卡那霉素（0、2 5、5 0、7 5、
100 mg.L-1）的培养基上进行抑菌和不定芽分化试
验。不定芽分化培养30 d后，统计芽数并继代于
不含抗生素的不定芽分化培养基上，7 d后统计污
染率，以确定次代抑菌率。进行生根试验时，
将染菌的试管苗培养在以下附加氨苄青霉素或硫
酸丁胺卡那霉素（0、50 mg.L-1）的生根培养
基上：(1)1/2MS+IBA 0.5 mg.L-1; (2)1/2MS+IBA
0.3 mg.L-1; (3)1/2MS+IBA 0.2 mg.L-1+NAA 0.2
mg.L-1; (4)1/2MS+IBA 0.2 mg.L-1+NAA 0.2
mg.L-1; (5)MS’+IBA 0.2 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1
（M S’是将 M S 中 N H 4N O 3 的含量减半，其余含
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量保持不变）。20 d 后统计试管苗生根率。
污染菌于无菌条件下接种于葡萄糖蛋白胨液
体培养基中增殖培养后，分别在牛肉膏蛋白胨、
马铃薯葡萄糖和豆芽汁固体培养基平板上划线接
种，置于37℃恒温培养箱培养24 或 48 h 后，观
察菌落的生长情况，确定污染菌的适宜生长培养
基。之后，继续在适宜培养基平板上划线分离，
得到不同的单菌落，分别挑取单个菌落接种于斜
面上培养。每一种菌源均反复划线、镜检，得
到纯培养菌种。确定菌落的形状和大小，进行革
兰氏染色，同时用测微尺测定菌体的大小。有芽
孢的菌体用芽孢染色方法进一步加以确认[7]。
结果与讨论
1 污染菌的界定
分别将污染菌接种在牛肉膏蛋白胨、马铃薯
葡萄糖和豆芽汁固体培养基平板上培养，24或48
h 后进行观察。结果表明，在牛肉膏蛋白胨和豆
芽汁培养基上生长缓慢，甚至不见其生长；在马
铃薯葡萄糖培养基上则生长良好。在马铃薯葡萄
糖培养基平板上反复分离、纯化，得到 3 种不同
特征的纯培养菌种：1 号菌种的菌落直径为 0.6
m m，系革兰氏阴性芽孢杆菌，芽孢端生，显微
测量菌体大小为（1.5~3.0）μ m×（0.5~0.6）
μ m；2 号菌种的菌落直径为0.5 mm，系革兰氏
阳性芽孢杆菌，芽孢端生，菌体大小为（3~6）
μ m ×（0.9~1. 0）μ m；3 号菌种的菌落直径
为 0 . 8 m m ，系革兰氏阴性杆菌，菌体大小为
（5~9）μ m ×（1.1~ 1 . 2）μ m。
2 氨苄青霉素和硫酸丁胺卡那霉素的抑菌效应及
对不定芽分化的影响
表1显示，培养基中附加50~150 mg.L-1氨苄
青霉素对当代污染菌的抑制率为100%。氨苄青霉
素的次代抑菌效果与其浓度有关，抑制率随着氨
苄青霉素的浓度增加而增强。不同浓度氨苄青霉
素对试管苗不定芽的分化率影响不显著。25~100
mg.L-1的硫酸丁胺卡那霉素对污染菌有很明显的杀
灭效应，但对试管苗则有不同程度的毒害，表现
为叶子、叶柄和茎段出现黄化现象，黄化程度随
浓度增大而增强，对不定芽分化也有明显的抑制
作 用 。
3 氨苄青霉素和硫酸丁胺卡那霉素对染菌试管苗
生根的影响
从表２可见：
(1)染菌的试管苗很难生根，即使能生根，
根褐化现象明显。 氨苄青霉素对同一种生根培养
基上试管苗的生根有明显的促进作用，并可消除
根的褐化现象。10 种生根培养基中，1/2MS+IBA
0.2 mg.L-1+NAA 0.2 mg.L-1的试管苗无论有否加入氨
苄青霉素，生根率比其余培养基的都高。但不加氨
苄青霉素的生根率比其余加有氨苄青霉素的都低。
据此可以认为，培养基中附加氨苄青霉素是防止污
染和提高组培苗产率的有效方法。
（2）加有50 mg.L-1 硫酸丁胺卡那霉素的10
表1 氨苄青霉素和硫酸丁胺卡那霉素的抑菌效应及对不定芽分化的影响
Table 1 Bacteriostatic effects on in vitro contaminated mini-roses and effects on adventitious bud differentiation
after the treatment of ampicillin or kanamycin sulphate

抗菌素类别
抗菌素浓度/ 接种苗 分化 不定芽 接种苗 当代抑 次代抑 试管苗
mg.L-1 总数 苗数 分化率/% 总数 菌率/% 菌率/% 黄化率/%
对照 0 40 126 315 － － － －
氨苄青霉素 50 54 169 313 122 100 74.6 0
100 42 128 305 98 100 82.7 0
150 50 151 302 86 100 86.0 0
硫酸丁胺卡那霉素 25 92 0 0 92 100 100 29.3
50 133 0 0 133 100 100 33.1
75 136 0 0 136 100 100 37.5
100 91 0 0 91 100 100 50.5
培养后7 d统计当代或次代抑菌率，30 d统计不定芽分化率。
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种生根培养基的试管苗抑菌率均达100%，但对生
根有明显的抑制作用，对试管苗也有显著毒害效
应，表现为试管苗切口出现明显褐化，叶片和茎
段黄化，甚至死亡。
参考文献
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表2 氨苄青霉素和硫酸丁胺卡那霉素对试管苗生根的影响
Table 2 Effects of ampicillin and kanamycin sulphate on root formation of test-tube plantlet
培养基 氨苄青霉素 硫酸丁胺卡那 接种苗 生根 总根 1 cm以 生根率/ 每株
编号 浓度/mg.L-1 霉素浓度/mg.L-1 总数 苗数 数 上根数 % 生根数
1 0 0 16 8 11 7 50.0 0.69
50 0 17 15 111 105 88.2 6.53
0 50 43 0 0 0 0 0
2 0 0 14 5 9 9 35.7 0.64
50 0 23 22 151 144 95.7 6.57
0 50 40 0 0 0 0 0
3 0 0 24 13 52 46 54.2 2.17
50 0 17 17 116 113 100.0 6.82
0 50 53 1 1 0 1.9 0.019
4 0 0 17 8 24 18 47.1 1.41
50 0 17 11 64 48 64.7 3.76
0 50 46 0 0 0 0 0
5 0 0 18 9 22 15 50.0 1.22
50 0 19 15 95 82 78.9 5
0 50 42 0 0 0 0 0
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