全 文 ：植物生理学通讯 第4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月
不同植物防御素的生物信息学分析
王 汉屏 ’
陕西教育学院生命科学系 , 西安 7 10 0 61
提要 : 采用生物信息学的方法和工具对已在G en B an k 上注册的花生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车前草 、 沙梨 、 辣椒等植物的防御
素的核酸和氨基酸序列作了分析 , 并对其组成成分 、 翻译后修饰 、 导肤 、 跨膜结构域 、 疏水性 / 亲水性 、 蛋白质二级结构
和功能结构域进行预测和推断的结果表明 : 此类蛋白可能是一具有信号肤的分泌型蛋白 , a 一 螺旋和不规则卷曲是蛋白质
二级结构中量最大的结构元件 , p一转角和延伸链散布于整个蛋白质中, 包含一个 g~
a 一thion in 功能结构域。
关键词 : 植物防御素 ; 生物信 息学
B io in fo r m a tic s A n a lysis o f D efe n sin s in D ife
r e n t Pla n ts
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一
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D eP a r。”en t of L沙 Sc ie n e e s , Sh a n nx iCO lle g e of 五’d u ca rio n , X i ’a n 71 00 61 , Ch in a
Ab s恤ct : B y bio in fo n n a tic me th od s an d to o ls , d efe n sin g e n es as w ella s th e e o mP o siti o n o f删 n o ac id seq u en e e s ,
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,
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,
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Pla 妙c a rP a , Pla n ta g o m aj o r , Py ru s Py rlfo lia , a n d CaP sie u m a n n u u m w e re an al y z e d a n d Pre d ie te d . Th e re su lts
d e m o n stra te d th a t d e fe n sin s 15 a so rt o f se e re to ry Pro te in s e o n tai n i
n g sig n a lPeP tid e
.
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,
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.
D e fe n sin s e o n ta in a fu n e tio n al d o m ai n-
g a m m a
一
thio n in
.
K ey w o rd s: Phyto d efe n sin : b io in fo rm ati
c s
植物具有内在的防御系统 , 在外部病原菌侵
染之下 , 自身会产生一系列拮抗物质 , 如一些低
分子量的次生代谢产物橡胶素(d a m b o ni te )、 植保
素(p hy to a le x in )、 凤仙花素(an th o c yan in )等 , 以阻
止病 原菌 的繁殖扩展和进 一 步侵入 寄主植物
(B e r o e a l
一
L o bo 等 2 0 0 2)。 植物防御素正是这类低
分子量短肤中的一个家族 , 它广泛分布于植物体
内 , 其可以拮抗细菌和真菌等多种植物病原菌 ,
在植物中是极为重要的一种抗病因子 , 参与植物
的防卫 反应 。
植物防御素是一类分子量小 (约 5 扔a , 由 45 一
5 4 个氨基酸组成 )、 碱性 、 富含半肤胺酸 、 具复
杂三维结构的短肤(廖乾生等 20 0 3 )。 在微摩尔浓
度下就能表现出广谱的抗菌活性 , 但对人 、 畜 、
植物细胞无害 。 有的植物防御素是植物的内源性
产物 , 也有的是在病原物侵染后诱导其基因表达
而产生的 。 在双子叶植物和单子叶植物中均发现
有植物防御素的存在 , 目前已经在首蓓 、 绿豆 、
菠菜 、 白菜 、 向日葵 、 欧洲云杉 、 甘蓝型油菜 、
小麦 、 辣椒 、 沙梨 、 烟草 、 白芥等植物中克隆
到(H a n k s 等 2 0 0 5 ; 缪建馄等 2 0 0 6 ; s e g g u r a 等
19 98 ; p ar k 等 200 2 ; U rd a n g ar ‘n 等 2 000 ; S han a
和 L 6 n n e b o rg 1 9 9 6 ; 刘胜毅等 2 0 04 ; K o ik e 等
2(X) 2
; D o 等 2 0(科 ; Zh o u 等 20 3 ; Li 和 e rav 1999 ;
v o lPi ce la 等 2仪x〕)。 防御素主要作用于病原微生物
的细胞膜 , 致使病菌对该物质不易产生抗性 , 因
此 , 它有着其他拮抗多肤所无可比拟的优势(张宏
等 20 06) 。 植物防御素基因工程的研究取得一定进
展 , 人们己成功得到一些经济作物和农作物的防
御素转基因植物 , 并证明它们能提高转基因植物
的抗病能力 , 如烟草 、 马铃薯 、 水稻 、 拟南芥
和哈密瓜等(R an e o is 等 2 0 0 2 ; G a o 等 2 00 ; M itte r
等 1 9 9 8 ; 王轶等 20 05 )。 有人还把防御素基因转
收稿
资助
2 0 0 7
一
0 6
一
2 2 修定 2 0 0 7 一1 0 一 16
陕西教育学院重点科研项 目(0 6 K J0 1 3 ) 。
E
一
m a i l
:
h a n P in g w a n g @ 1 2 6
.
e o m ; T e l : 0 2 9
-
8 5 3 7 0 0 6 3
植物生理学通讯 第 4 卷 第 1 期 , 2 008 年 2 月
入番茄 、 毛白杨 、 小麦、 菊花和棉花等植物中以
期获得抗病强的优良品种(余兴邦等 2 0 06) 。
生物信息学是一门由生物 、 数学 、 计算机相
交叉的学科 。 人类基因组计划完成后 , 又进入后
基因组时代 , 并己从基因组测序和表达分析 , 转
向对蛋白质组结构与功能的预测和分析 。 采用各
类分子生物学数据库和分析软件对已知的核酸和蛋
白质序列进行比对 、 分析 、 建立计算模型 , 从
而对其结构 、 功能进行推断及预测 , 已成为生物
信息学研究的一种趋势 。
本文用生物信息学的方法 , 以花生(A : a 。hi :
Jio g o i)为研究重点 , 对鹰嘴豆 (e ie e r a : ie rin u m )、
合欢(T召尸h r o s ia 尸la ty e a 塑a )、 车前草(p la n ta g o
m aj o
r)
、 沙梨(Py r u s 尸夕r ifo lia )和辣椒(c即s ie u m
a n n ““m )等植物的防御素基因及相应氨基酸序列的
理化性质 、 结构特征 、 功能及系统演化关系等进
行预测和分析 , 以期能为它们的深入研究提供参
考 。 以往的防御素研究多为实验性的研究 , 而用
己有的生物信息进行研究还少见报道 , 为此 , 本
文对此进行了尝试 。
列 : 花生(A Y 2 8 8 4 4 8 、 A A P9 2 3 3 0 ) 、 鹰嘴豆
(A Y 2 0 6 39 5
、
A A O 3 8 7 5 6 )
、 合欢(A Y 9 0 7 3 4 9 、
A A X 8 6 99 3 )
、 车前草(A J8 4 32 6 4 、 CA H 5 87 4 0 )、
沙梨(A B 05 26 8 s 、 B A B 64 9 30 )、 辣椒(A F44 2 38 8 、
A A L 35 3 6 6)
。
依据 D NA Star 软件和 h t p :lw w w .n cb i. n lm
.
ni h.
g o v /
、
h ttP :1/ w w w
.
e bi
.
ac
.
u kl
、
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.
e b s
.
d tu
.
田、 htP: /w w w . e xP as y.o 呵等网站提供的各类生物
信息学软件进行在线分析 。 核酸及氨基酸序列的组
成成分分析 、 理化性质分析 、 开放阅读框(o p e n
re ad in g fr 田n e , OR F)的查找和翻译均用 D NA Star 软
件进行 ; 核普酸和氨基酸序列的同源性比对用 B las t
在线工具完成 ; 氨基酸翻译后修饰 、 跨膜结构域
和亲水性 l疏水性的分析用在线工具 N et Phos 2 . 0
Serv
e r
、
Tar g etP 1
.
1 S e rv e r
、
TMH MM 和 Pr o ts ea le
完成 ; 蛋白质的二级结构和三级结构用 SO PMA 和
SW IS S
一
M OD E L 在线工具预测 。
结果与讨论
材料与方法
数据资料来源于 N a tio n a lC e n te r fo r B io te c h -
n o lo g y 玩fo rm a tio n (N e B I)核酸及蛋白质数据库中
己注册的防御素的核昔酸序列及其对应的氨基酸序
1 核昔酸序列及其推导的核普酸序列的组成成分
和理化性质
用 D N A S ta r 软件的 o R F F in d e r 、 E d itse q 、
Pro te a n 程序分析 N CB I上注册的花生 、 鹰嘴豆 、
合欢 、 车前草 、 沙梨 、 辣椒防御素的核酸序列
及其推导的氨基酸序列的结果(表 1) 表明 , ORF 为
表 1 不同植物防御素基因的核酸序列以及推导的氨基酸序列组成成分和理化性质分析
Tab le 1 An al y
s is o f e o m Po siti on an d Physieal an d eh e而eal c harc te rs o f n u ele ie ac id seq u en e e an d d e du e e d 肚hi n o ac id se que nc e
of de fe n sin am
o n g d ifl贻re n t Plan ts
终止 推导的 分子量
密码子 氮基酸残基数 压D a
氨基酸比例(%)植物 O R Flb p 主要氨基酸
碱性 A A 酸性 A A 亲水 A A 疏水 A A 带电A A
花生 2 2 5
2 1 9
2 2 8
2 1 9
2 6 4
2 3 7
T A A 7 4 8 4 5 4 8 6 7
.
8 9 1 3
.
5 1 1 0
.
8 1 3 1
.
0 8 3 5
.
1 4 3 7
.
8 4
鹰嘴豆 T A A 7 2 9 . 2 2 5 2 8 . 1 3 15 . 2 8 1 2 . 5 0 2 9 . 1 7 3 1 . 9 4 4 4 4 4
合欢 T A A 7 5 8 . 5 5 5 9 4 7 . 5 2 14 . 6 7 1 3 . 3 3 3 0 . 6 7 3 0 . 6 7 4 4 . 0 0
车前草 T G A 7 2 7 . 9 4 9 4 1 8 . 7 1 1 5 .2 8 6 . 9 4 2 6 . 3 9 3 1 . 9 4 3 6 . 1 1
沙梨 T A A 8 7 9 . 5 1 7 3 3 8 . 6 9 14 . 9 4 8 . 0 5 2 9 . 8 9 3 2 . 1 8 3 4 . 4 8
辣椒 T A A 7 8 8 . 6 8 8 3 1 8 . 3 5 12 . 8 2 7 . 6 9 2 8 . 2 1 3 0 . 7 7 3 3 . 3 3
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C ys Ly s L e u T七r Phe
Al
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Cys Ly s L eu A sP
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T为r V al se r
C ys L e u T rp G lu Lys
A rg G ly se r
Ar g C y
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Phe G ly G lu T hr V al
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 1 期 , 20 0 8 年 2 月
20 0 bP 左右 , 分子量为 9 k D a 左右 。 理论等电点
均高于 7 , 说明防御素呈碱性 。 终止密码子大都
用 T A A 。 在所分析的植物中 , 只有车前草防御素
基因采用 T A G 作密码子 。 在鹰嘴豆和车前草防御
素氨基酸组成中 , 碱性氨基酸的比例最高 , 均为
15
.
2 8 % : 在合欢防御素氨基酸中酸性氨基酸的比
例最高(1 3 . 3 % ) ; 在花生防御素总氨基酸中 , 亲
水性氨基酸和疏水性氨基酸的比例均最高 , 分别
为 3 1 . 0 5 % 和 3 5 . 14 % 。 e ys 、 Le u 和 A r g 是这些植
物共有的主要氨基酸 。
2 氨基酸序列比对分析
用 Clu sta l w 在线程序对拟南芥 、 甘蓝 、 银
杏 、 小麦 、 花 生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车前草 、
沙梨 、 辣椒的防御素氨基酸序列进行多序列 比对
的结果(图 l) 表明 , 拟南芥 、 甘蓝 、 银杏 、 小
麦 、 花 生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车前草 、 沙梨 、
辣椒的防御素氨基酸序列的 8个半胧氨酸是完全保
守的 , 在相当多的一些植物防御素中 s e r 、 G ly 和
G lu 氨基酸残基也是非常保守的氨基酸位点
(U r a d a n g a rin 等 2 0 0 0 ) 。
3 翻译后磷酸化修饰的预测和分析
多肤链在核糖体上合成释放后 , 通常要经过
翻译后修饰如糖基化 、 甲基化 、 磷酸化等才能正
确折叠形成有效的三维构象 , 并运输到特定场所发
挥功能 。 翻译后修饰的预测和分析 , 对正确认识
和理解 蛋白质功能构象的形成很重 要 。 根据
N etPho S Z
‘
0 S er v er 软件(B lo m 等 2 0 0 4 ) , 磷酸化分
值超过阂值的氨基酸位点被认为是可能的磷酸化作
银杏
小麦
辣椒
拟南芥
车前草
沙梨
鹰嘴豆
合欢
花生
甘蓝
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银杏
小麦
辣椒
拟南芥
车前草
沙梨
鹰嘴豆
合欢
花生
甘蓝
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* * * * * * * *
图 1 不同植物防御素氨基酸序列多重比对
Fig
.
l M u ltiPle a lig n m e n t o f
a而 n o a e id se q u e n ee s a m o n g d ife re n t Plan t d e fe n sin s
符号 “ * ” 、 “ : ” 、 “ . ” 分别表不氨基酸完全相Jri 、 保守和半保守3 种情况 。
植物件毛理学通 讯 第 44 卷 第 l期 , 2 00 8 年 2 月
用位点 , 可知花生的第 59 个氨基酸位点上发生 Ser
的磷酸化(图 2) , 第 3 6 和 71 个氨基酸位点上发生
T hr 的磷酸化 ; 鹰嘴豆在第 43 和 57 个氨基酸位点
发生 S e r 的磷酸化 , 第 4 7 、 5 0 和 69 个氨基酸位
点上发上 T h r 的磷酸化 ; 合欢的第 6 0 个氨基酸位
点发生 Se r 的磷酸化 , 第 37 和 7 2 个氨基酸位点上
发生 T h r 的磷酸化 ; 车前草的第 3 2 、 4 7 个氨基
酸发生 S er 的磷酸化 ; 沙梨的第 3 4 个氨基酸位点
发生 Se r 的磷酸化 : 辣椒的 38 和 61 个氨基酸位点
上发生 S e r 的磷酸化 。 用 N e tPh o s K 1 . 0 S e r v e r 软
件分析这几种植物防御素氨基酸序列的翻译后激酶
磷酸化修饰 , 观察到这几种植物的防御素氨基酸
序列均存在蛋白激酶 C (P KC )的 S e : 磷酸化位点 。
4 导肤的预测和分析
在核糖体上合成的蛋 自质或者留在细 胞质
中 , 或者运送到其他细胞器中 , 并形成有功能的
空间构象后才能发挥其功能 。 导肤是 一段引导新
合成的肤链进入细胞器的识别序列 。 因此 , 预测
和分析导肤 , 对正确认识蛋自质的亚细胞定位和
功能作用的途径及机制有一定的意义 。 为此 , 用
T arg e tp 1
.
1 S e r v e r 预测花生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车
前草 、 沙梨和辣椒防御素氨基酸序列 的 导肤
(E m an u e lsso n 等 2 0 0 0 )的结果表明 , 这些植物的防
御素均含有分泌途径信号肤 , 在花生 、 鹰嘴豆 、
合欢 、 车前草 、 沙梨和辣椒防御素氨基酸序列
中的信号肤分值分别为 0 . 9 9 5 、 0 9 9 4 、 0 . 9 9 6 、
0
.
8 2 6
、
0
.
9 6 3 和 0 . 9 4 0 , 预测的可靠性等级均为
1
。 据此认为防御素蛋白均属于分泌型蛋自 , 在
核糖体合成后 , 由信号肤引导其前体蛋自到达指
定部位 , 切除信号肤而成为成熟蛋白质发挥其抗
菌功能 。
5 信号肤的预测和分析
分泌蛋白及细胞膜蛋白均以前体物质多肤的
形式合成 , 其 N 末端含有作为通过膜时之信号的
氨基酸序列 , 这种氨基酸序列称信号肤或信号序
列 。 由 1 5 一2 5 个氨基酸所组成 。 用 Si g n al P 3 . 0
Se rv e : 分析这几种植物防御素氨基酸序列的信号
肤的存在位置及序列(B e n dt se n 等 2 00 4) , 结果表
明不同植物的氨基酸序列土几信号肤的剪切位点分
值和位置分别为 : 花生在第 2 7 一2 8 个氨基酸之间
(分值为 0 . 6 7 5 ; T E A 一 A T ) (图 3) ; 鹰嘴 夏为第
2 7 一2 8 个氨基酸之间(分值为 0 . 7 7 5 ; T E A 一 K T ) ;
合欢在第 2 8 一 2 9 个氨基酸之间(分值为 0 . 4 9 9 ;
sE A
一
K T ) ; 车前草在第 2 5 一2 6 个氨基酸之间(分
值为 0 . 8 16 ; G E A 一R K ); 沙梨在第 23 一2 4 个氨基酸
之间(分值为 0 . 3 5 4 ; T E M 一G P ): 辣椒在第 2 0 一2 1
个氨基酸之间(分值为 0 . 9 13 ; v M A 一T E) 。 总之 ,
花生和鹰嘴豆信号肤序列为整体氨基酸序列的 N
端 2 7 个氨基酸 , 合欢的为 N 端 2 8 个氨基酸 , 车
前草信号肤序列为 N 端 2 5 个氨基酸 , 沙梨的为
N 端 2 3 个氨基酸 , 辣椒的为 N 端 2 0 个氨基酸 。
lkJ 此 , 可以认为植物防御素的基因在植物体内表
达的是一个前体蛋白 , 此蛋白通过翻译后加工并
借助信号肤运送到胞质外的空间发挥植物防御素
图 2 花’1防御素氮从酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
Fig
.
2 Pre d ie te d Ph o sPh o r yla tio n site s in a m in o a e id s e qu e n ee o f de fe n s in in Pe a n u t
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 2 00 8 年 2 月 2 9
图 3 花生防御素氨基酸序列信号肤的预测分析
Fig 3 Pre d ie te d sig n a lPePtid e o f de fe n s in in Pe a n u t
C 仇 : 原始 剪切位 汽的分值 ; S 值 : 信号肤的分值 ; Y 值 : 综合剪切位点的分值 。
的抗菌功能 。
将信号肤按预测位置切除后分析这些植物防
御素编码序列的组分和性质的结果(表 2) 表明 , 切
除信号肤后的防御素氨基酸序列分子量 (5 k D a 左
右)t匕切除前(g kD a 左右)小很多(3科 kD a) (张宏等
2 0 0 6 )
。
6 不同植物防御素氨基酸序列疏水性 /亲水性的预
测和分析
用 P r o tS 。a le 分析花生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车
前草 、 沙梨 、 辣椒防御素氨基酸序列的疏水性 /
亲水性(K yte 和 D o o little 1982 )的结果表明 , 预测结
果均与花生一致(图 4) , 整个多肤链 N 端 2 0 个左
表 2 去除信号肤后的防御素氨基酸序列组分
T a ble 2 A n a lys is o f am in o a e id s e qu e n e e e o m Po sitio n o f defe n s in a ft er sig n a lPePtid e w ere e u t o f
植物 信号)J太序列 成熟月太序列氨基酸数
分子录 /k D a
P 1
氨基酸比例 / %
碱性 A A 酸性 A A 亲水 A A 疏水 A A 带电 A A
花 产牛 M E K KS LA A L S -
FL FL V L FV TQE
-
IV V T E A
M E K K S LA G L C
-
FL FL V L FV AQ E
-
IV V T E A
M E K KS L A G L C
-
FL FL V L FV A QE
-
V V V QSE A
M G R FW S V LFA
-
LFL V L V IT G PM
-
V G E A
M ER SM R L V SA
-
AFV L V L L L AA
-
T EM
M A H SM R FFA I
-
V L L LA M L V M A
4 7 5
.
4 4 5 2 2 8
.
14 1 7
.
0 2 10
.
6 4 3 8
.
3 0 2 1
.
2 8 4 8 9 4
4 5 5
.
1 8 8 9 8
.
1 3 2 0
.
0 0 1 3
.
3 3 3 7
.
7 8 1 5
.
5 6 5 7
.
7 8
4 7 5
.
4 7 4 2 7
.
8 9 1 9
.
15 1 4
.
8 9 3 8
.
3 0 1 4
.
8 9 5 7
.
4 5
4 7 5
.
2 13 0 2 8
.
7 1 2 1
.
2 8 8
.
5 1 3 6
.
1 7 1 7
.
0 2 5 1
,
0 6
6 4 6
.
9 8 3 1 7 8
.
6 9 1 7
.
19 7
.
8 1 3 5
.
9 4 2 3
.
4 4 4 0
.
6 2
5 8 6
.
4 4 0 3 7 8
.
14 1 5
.
0 2 1 0
.
3 4 3 6
.
2 1 1 8 9 7 4 1
.
3 8
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 1 期 , 20 0 8 年 2 月
图 4 花生防御素氨基酸序列疏水性 / 亲水性的预测
Fig 4 p re d ie te d hyd ro Ph o b ie ity/h yd ro ph ilie ity fo r the d e fe n sin in Pe a n u t
右氨基酸形成一个明显的疏水区域 , 即为疏水的
头部 , 第 3 0 个氨基酸后均表现为亲水性 , 结合上
述分析可知组成疏水性头部的氨基酸均是组成信号
肤的氨基酸 , 这种疏水性的氨基酸组成对信号肤
引导防御素前体蛋白与膜脂结合通过膜是有利的。
7 不同植物防御素跨膜结构域的预测和分析
跨膜结构域是膜中蛋白与膜脂结合的主要部
位 , 一般由 2 0 个左右的疏水氨基酸残基组成 , 形
成 a 螺旋 , 与膜脂相结合 。 预测和分析跨膜结构
域 , 对认 识蛋白质的结构 、 功能 、 分类 以及 在
细胞中的作用部位均有一定的意义 。 用 TM H MM
2
.
0 S er ve
: 预测(Ik ed a 等 20 02 )花生的可能跨膜结构
域的结果表明 , 花生防御素在第 7 一2 9 个氨基酸
(图 5 ) , 鹰嘴豆在第 5 一2 4 个氨基酸 、 合 欢在第
5 一2 4 个氨基酸 、 车前草在第 4 一2 6 个氨基酸 、 沙
梨在第 7 一2 6 个氨基酸 、 辣椒在第 7 一2 9 个氨基酸
形成跨膜结构域 , 结合信号肤的预测分析结果 ,
说明跨膜结构域均在信号肤位置 。
8 二级结构的预测和分析
多肤链借助氢键排列成沿一维方向而呈现有
规则的重复构象的二级结构 , 是氨基酸顺序与三
维构象之间的桥梁 。 二级结构借助范德华力 、 氢
键 、 静电和疏水等相互作用形成蛋白质的三级结
构 , 从而 发挥正常 的生物学功能 。 据此 , 用
S O PM A 对花生 、 鹰嘴豆 、 合欢 、 车前草 、 沙
梨 、 辣椒防御素氨基酸序列的二维结构进行预测
(G e o u rj o
n 和 D ele a g e 1 9 9 5)的结果表明 , 预测结果
均与花生一致(图 6) 。 a 一螺旋和不规则卷曲是防御
素整体结构中的主要组成结构元件 , p一 转角和延
伸链散布于整个蛋 白质中 。
9 功能结构域分析
蛋白质由多个模体组成 , 组成这些模体的氨
基酸区段行使特异的功能 , 同时还蕴含着各 自的
遗传进化信息 。 利用 N C B I链接的C D D 分析花生 、
鹰嘴豆 、 合欢 、 车前草 、 沙梨 、 辣椒防御素氨
基酸序列的功能结构域 , 得到了相一致的结果(图
7)
, 即切掉信号肤 , 剩下的组成成熟肤的氨基酸
序列均包含一个起杀菌作用的毒素 ga m m a 一 th io ni n
功能域 , 属于 g a m m a 一th io ni n 家族蛋 白 。 此功能
域是防御素发挥其功能的单位 。
上述结论虽属推断和预测 , 但为进一步研究
防御素打下 了基础 。
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 20 0 8 年 2 月 3 l
图 7 花生防御素氨基酸序列功能域分析
Fig
.
7 Fu n e tio n d o m a in a n a lysis o f d e fe n sin in Pe a n u t
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2 9 : 3 6 0