全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月 355
收稿 2003-06-24 修定 2003-10-24
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蒜粉中蒜氨酸酶的分离纯化及性质测定
苟萍1 李燕1,* 王荣1 陈坚2
1新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046; 2新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054
Purification and Properties of Allinase from Garlic Power
GOU Ping1, LI Yan1,*, WANG Rong1, CHEN Jian2
1College of Life Science and Technology, Xinjiang University ,Urumqi 830046; 2College of Medicine, Xinjiang Medical University,
Urumqi 830054
提要 蒜粉以 Na/K 磷酸缓冲液抽提、25%~40% (NH4)2SO4 分级沉淀后，用 Sephadex G-200 柱分离得到纯化 200 倍的电泳纯
蒜氨酸酶。测定其性质的结果表明，此酶在 25℃下对半胱氨酸亚砜的 Km 为 0.87 mmol.L-1，Vmax 为 0.46 mmol·min-1，最适反
应温度为 40℃，热稳定性的温度范围在 45℃以下，最适 pH 为 6.6。
关键词 蒜粉；蒜氨酸酶；分离纯化；性质测定
大蒜为百合科葱属植物，有丰富的营养成分
和药用价值。它在杀菌、抗血栓、防治动脉硬
化、预防和治疗中风和高血压等方面有显著的疗
效，近年来又发现在防治肿瘤中也有独特的作
用[1]。新疆大蒜因地理和气候的独特性，其药用
成分含量高，有广阔的开发利用前景。大蒜中有
药理作用的物质为一类含硫化合物——蒜素
(allicin，主要成分是二烷基硫代亚磺酸酯和烷基-
2-丙烯基硫代亚磺酸酯等)。蒜氨酸酶(alliinase,
EC4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin, 烯丙基硫代半胱氨酸
亚砜)生成丙酮酸、氨及含硫化合物蒜素等 [1]。本
文研究了从蒜粉中提取蒜氨酸酶的方法及蒜氨酸
酶的性质。
材料与方法
1 材料
新疆蒜粉(新疆吉木萨尔蒜，Allium sativum)
为新疆医保公司产品。
2 底物制备
参照孙君社和高孔荣[2]的方法制备底物L-半
胱氨酸亚砜。
3 酶活性测定
以L-半胱氨酸亚砜为底物，用丙酮酸法测定
酶活性，以在 25℃条件下，每分钟产生 1 mmol
丙酮酸为1个活力单位(U)。1 mL酶液加 5 mL 底
物于室温下反应 5 min 后，加等量10% 三氯乙酸
终止反应。从中吸取2.5 mL与 0.5 mL 2,4-二硝
基苯肼充分反应后，再加入5 mL 0.5 mol.L-1 NaOH
摇匀显色，用752紫外光栅分光光度计测波长520
nm 处的光吸收(OD)值。
4 蛋白质浓度测定
按Lowry 方法[3] 。
5 聚丙烯酰胺盘状电泳
7%的分离胶，2.5%的浓缩胶，0.05 mol.L-1 Tris-
甘氨酸缓冲液(pH 8.3)，以考马斯亮蓝G-250为染
色剂，甲醇、水、浓氨水(64∶36∶1)为脱色剂，
7% 乙酸透明保存。
实验结果
1 酶的分离纯化
称取40 g蒜粉用4倍体积的0.1 mol.L-1 Na/K
磷酸缓冲液(pH 6.5)抽提。先在冷冻条件下研磨
20 min，4℃下以 2 000×g离心20 min，收集上
清液。沉淀加少量上述磷酸缓冲液重复抽提 2
次，弃去沉淀，上清液为粗酶液。
粗酶液分别加 20%~70% 饱和度的硫酸铵沉
淀，于冰箱中放置 2~4 h 后，4℃下以 2 000×g
离心30 min，沉淀用少量0.1 mol.L-1 Na/K磷酸
缓冲液(pH 6.5)溶解、定容，测定酶活性。图
1 结果表明，硫酸铵饱和度在30%~35% 时酶活性
较高。
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30%~35% 硫酸铵分级的沉淀得到的蒜氨酸酶
用0.1 mol.L-1 Na/K磷酸缓冲液(pH 6.5)溶解，对
蒸馏水透析，透析液上葡聚糖G-200(Sephadex G-
200)柱(2.0 cm×40 cm)，用蒸馏水洗脱，每管5
mL，洗脱曲线见图 2。通过测定洗脱液的蛋白量
以及酶活性可知：5~25 管含有蒜氨酸酶，杂蛋白
含量(A280)较高；26~35 管的蒜氨酸酶活性高，杂
蛋白含量很低。将 26~35 管合并测酶活性，得到
纯化200 倍的较纯蒜氨酸酶。通过PAGE 检测得到
单一条带(图 3)。蒜氨酸酶纯化步骤见表1。
表1 蒜氨酸酶提纯摘要
提纯步骤 体积/mL 总蛋白/mg 总活性/mmol.mL-1 比活力/mmol.mg-1.mL-1 纯化倍数 产率/%
粗酶液 400 398 86 0.23 1.00 100
30%~35% 硫酸铵沉淀 10 9.021 2.813 0.31 1.35 3.27
透析液 10 8.621 2.65 0.31 1.35 3.08
Sephadex G-200层析(第32管) 8 0.060 2.8 46 200 3.26
图1 蒜氨酸酶活性与硫酸铵饱和度的关系
图2 蒜氨酸酶的Sephadex G-200柱层析图谱
2 不同温度下的酶活性及热稳定性
蒜氨酸酶经葡聚糖G-200 柱分离后，将酶活
性较高的26~35 管洗脱液合并作为以下酶性质测试
液。酶液和底物在不同温度下保温后，以失活的
酶液为对照，结果表明，酶的最适温度为40℃(图
4)。将酶在不同温度下保温30 min后冷却，再在
最适条件下测定剩余酶活性，以不经保温的酶活
性测定为100%，酶在 45℃以下较稳定(图 5)。
3 最适 pH
将酶液、底物及和不同pH的缓冲液(pH 3.0~6.6
用0.1 mol.L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 7.0~8.5
用0.1 mol.L-1 Tris-HCl缓冲液，pH 9~10用0.05
图4 温度对蒜氨酸酶活性的影响
图3 蒜氨酸酶电泳
1.粗酶液；2.透析液；3.第 14 管洗脱液；4.第 32 管洗脱液。
mol.L-1甘氨酸-NaOH缓冲液)分别在40℃水浴中保
温10 min 后，测定酶活性。酶活性的最适 pH 值
为6.6(图6)。
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4 米氏常数
在不同底物浓度下测定酶活性，用双倒数作
图法(Lineweaver-Burk)作图(图7)。酶的Km=0.87
mmol.L-1，Vmax=0.46 mmol.min-1，回归方程为
Y=2.149+1.884x，r=0.999。
讨 论
蒜粉用 Na/K 磷酸缓冲液抽提，(NH4)2SO4 沉
淀后透析，再将透析液上葡聚糖G-200柱分离得到
蒜氨酸酶，这种提取方法较Nock 和 Mazelis[4]、
Krest和Keusgen[5]的方法简便，且纯化倍数高。提
取方法成本低，简单可行，适合大量提取蒜氨酸
酶。Krest和 Keusgen[5]从蒜粉中提取得到的蒜氨
酸酶，以L-(+)蒜氨酸为底物，测得 Vmax=0.252
mmol .min-1，Km=1.60 mmol.L-1。我们提取得到
的蒜氨酸酶以半胱氨酸亚砜为底物测得Vmax=0.46
mmol.min-1，Km=0.87 mmol.L-1。二者比较，以
半胱氨酸亚砜为底物时 Vmax 增大，Km 降低。说明
蒜氨酸酶对半胱氨酸亚砜亲和力大，更适合与半
胱氨酸亚砜作用。以半胱氨酸亚砜为底物时，此
酶的最适温度升高，最适 pH 下降。蒜氨酸酶极
其不稳定，提取过程中温度高，时间长，均会
导致酶活性完全丧失。在提取过程中加入甘油、
蔗糖、N a C l、磷酸吡哆醛可提高酶的稳定性。
参考文献
1 程龙军，郭得平. 葱蒜类作物中的蒜氨酸酶.植物生理学通
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2 孙君社，高孔荣. 蒜酶及其动力学研究.食品科学，1995,16
(9):13~15
3 Lowry OH. Protein measurement with the Folin phenol reagent.
J Boil Chem,1951,193:265~275
4 Nock PL, Mazelis M. The C-S lyases of higher plant: Prepara-
tion and properties of homogeneous alliin lyase from garlic. Arch
Biochem Biophys,1986,249:27~33
5 Krest I,Keusgen M. Quality of herbal remedies from Allium
sativum: differences between alliinase from garlic powder and
fresh garlic. Planta Medica,1999,65(2):139~143
图6 蒜氨酸酶活性的最适pH
图5 蒜氨酸酶热稳定性曲线
图7 Lineweaver-Burk作图