全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 5期，2004 年 10 月 599
小球藻的玻璃化超低温保存法
蔡小宁* 陈舒泛 陈俊 刘少华
南京晓庄学院生命科学系，南京 210017
Cryopreservation of Chlorella vulgaris by Vitrification
CAI Xiao-Ning*, CHEN Shu-Fan, CHEN Jun, LIU Shao-Hua
Department of Life Science, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 210017
提要 先用含 0.5 mol·L-1 甘油和 0.4 mol·L-1 蔗糖的预处理液处理 20 min， 然后用含 30% 蔗糖 +15% 乙二醇 +10% 二甲基亚
砜 +BBMG 培养液的玻璃化液处理，在 0℃下预冻 60 min 后，将小球藻投入液氮。此法存活率较高，可达到 60.14%，小
球藻种质保存效果较好。通过试验初步建立了小球藻玻璃化法超低温保存的技术程序。
关键词 小球藻; 超低温保存；玻璃化法
收稿 2003-10-23 修定 　 2004-06-04
资助　 南京晓庄学院重点项目基金(0309001)。
* E-mail: biocai@jlonline.com, Tel: 025-86569270
1 0 年来，随着超低温保存技术的建立和发
展，有多种植物的细胞、组织和器官实现了超低
温冰冻保存[1]。玻璃化保存法是近年来发展起来
的一种保存方法，与其他超低温保存方法相比，
具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优点，
在植物上已经取得很大进展[2,3]。目前，藻类种质
的超低温保存技术已受到广泛的重视。迄今为
止，绝大多数藻类是采用两步冰冻法保存[4~7]，采
用玻璃化法超低温保存藻类的报道很少[8]。本文
探讨玻璃化法超低温保存小球藻种质的技术。
材料与方法
1 实验用小球藻的准备
小球藻(Chlorella vulgaris)接种前，所用的液
体培养基和容器于1.2 kg·cm-2压力下蒸汽灭菌20
min。从保存藻种的平板上挑取小球藻，培养于
装有5 mL BBMG液体培养基(参照 Bold’s basal 培
养基配方[9]，其中含75 g·L-1硝酸钠、 10 g·L-1葡
萄糖、10 g·L-1蛋白胨)的试管中。弱光下(根据我
们的试验，在异养培养条件下光照强度对小球藻
生长无影响)培养 5~7 d，再将试管种接入50 mL
BBMG 液体培养基，于弱光下培养至对数期，此
为最初的液体种子。培养小球藻时，接入 2% 的
液体种子于50 mL培养液中，放在摇床上于25℃
弱光下培养，摇床转速为120 r·min-1，4~5 d即
可得到实验用的小球藻。
2 预处理液的加入
在室温下分别取2 mL藻液置于若干离心管中
离心(转速500 r·min-1，下同)，弃去上清液，小
球藻沉降于离心管底部，然后分别加入预先配制
的不同浓度的预处理液(表 1)，混匀，于室温下
处理20 min 后再离心。
3 玻璃化液处理
玻璃化液配方为30%蔗糖+15％乙二醇+不同
浓度二甲基亚砜 +BB M G 培养液，加入前先放在
0~4℃下预冷，在无菌条件下取代预处理液，悬
浮后移入冻存管，于 0℃下预冻不同时间后放入
液氮中。
4 化冻和玻璃化保护剂的去除
将在液氮中保存半年后的冻存管取出，立刻
放入40℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰
晶消失后移入室温中。化冻后的小球藻在无菌条
件下先在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中室温平衡5 min，
然后再在1.2 mol·L-1蔗糖溶液中平衡5 min，最后
转入BBMG 液体培养基中培养。培养条件为27℃、
弱光、摇床速度120 r·min-1，培养 4 d。
5 存活率的测定
参照Canavate及Lubian的方法[10]，将经过处
理的小球藻样品和对照小球藻样品再培养4 d后，
用 722 型光栅分光光度计于波长 540 nm 处测藻
液的吸光度。根据预先确定的藻细胞密度(y×108
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个·L-1)和吸光度(x)的直线回归方程：y=3.456x-
0.389(r=0.9961)，可以推算出上述冰冻样品和对
照样品在再培养 4 d 后的藻细胞密度，两者的百
分比值即为超低温保存的存活率[6]。
实验重复 3 次，每处理设置 3 个平行样品，
取平均值。
结果与讨论
1 预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对小球藻
存活率的影响
在超低温保存中通常对植物材料进行预处
理，预处理过程中通过蔗糖提高胞质浓度，增加
抗冻力和抗脱水力，促进降温过程中玻璃化的形
成[11]。甘油也是一种常用的冰冻保护剂。我们比
较了预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对玻璃化
法超低温保存小球藻存活率的影响，结果(表1)表
明，在所试浓度范围内，如果预处理液中不添加
甘油和蔗糖，而仅仅作玻璃化液处理的存活率最
低，为 29.11%；预处理液中单加甘油或蔗糖的
存活率大幅度提高；预处理液中甘油和蔗糖都添
加时，小球藻的存活率则随着甘油浓度的增加而
逐渐下降。这表明，玻璃化液处理前，先用含
有蔗糖和甘油的预处理液预处理，可大大提高玻
璃化法超低温保存的小球藻存活率。以0.5 mol·L-1
甘油和 0.4 mol·L-1 蔗糖的组合中，存活率最高，
达到 60.14%。
表1 预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对存活率的影响
甘油/mol·L-1 蔗糖/mol·L-1 藻细胞浓度/×108个·mL-1 存活率/ %
对照 (未经任何处理) 4.690 100.00
0.5 0.4 2.820 60.14
1.0 0.4 2.731 58.22
1.5 0.4 2.677 57.07
2.0 0.4 2.649 56.49
2.5 0.4 2.397 51.10
3.0 0.4 2.090 44.56
0.5 0 2.628 56.04
0 0.4 2.171 46.30
0 0 1.365 29.11
　　玻璃化液配方为：30% 蔗糖 +15% 乙二醇 +10% 二甲基亚砜 +BBMG 培养液，预冻时间为 60 min。
2 玻璃化液中不同浓度二甲基亚砜对小球藻存活
率的影响
将待保存的小球藻经含0.5 mol·L-1甘油和0.4
mol·L-1 蔗糖的预处理液处理后，再以含不同浓度
二甲基亚砜的玻璃化保护剂处理60 min，结果表
明，10%二甲基亚砜处理的小球藻存活率最高(表
2 )。
3 预冻时间对小球藻存活率的影响
在藻类冰冻保存中，常用的预冻时间为
0~60 min，已有报道表明预冻时间对藻的存活率
影响极大[4,5]。我们用30% 蔗糖 +15% 乙二醇 +10%
二甲基亚砜 +BBMG 培养液的玻璃化溶液处理小球
藻后，于 0℃下分别预冻不同时间，结果表明，
无论预处理与否，小球藻的存活率都以预冻时间
为60 min时最高(表3)。
综上所述，小球藻种质的玻璃化超低温保存
较理想的技术程序为：先用含0.5 mol·L-1的甘油
和0.4 mol·L-1的蔗糖溶液预处理20 min左右，然
后加入含有 30% 蔗糖 +15% 乙二醇 +10% 二甲基亚
砜 +BBMG 培养液的玻璃化保护剂，放入 0℃冰中
预冻 60 min 左右，再投入液氮中保存；保存半
年(或以上)后，将冻存管取出，立刻放入40℃恒
表2 玻璃化液中不同浓度二甲基亚砜对
小球藻存活率的影响
二甲基亚砜浓度/ % 藻细胞浓度/×10 8个·mL-1 存活率/ %
对照 (未经任何处理) 4.690 100.00
7.5 1.829 38.99
10.0 2.268 48.35
15.0 2.820 60.14
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温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移
入室温中；化冻后的小球藻在无菌的条件下转入
0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中室温平衡5 min，然后再
转入1.2 mol·L-1蔗糖溶液中平衡5 min。此时，小
球藻可转入BBMG 培养液中再培养，培养条件27℃，
摇床速度120 r·min-1，培养 4 d，即可获得活化
的小球藻。
参考文献
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表3 预冻时间对小球藻存活率的影响
处理时间/min
存活率/ %
未预处理 预处理
0 0 3.57
15 0.34 10.07
30 5.46 42.81
60 28.65 66.32