全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月 205
辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定
黄粤* 马荣群 翟晓灵 岳文辉 潘忠强 李梅 崔健 李显日
青岛市农业科学研究院，青岛市农业生物技术重点实验室，青岛 266100
Cloning and Sequencing of the Coat Protein Gene in Pepper Mild Mottle Virus
HUANG Yue*, MA Rong-Qun, ZHAI Xiao-Ling, YUE Wen-Hui, PAN Zhong-Qiang, LI Mei, CHUI Jian, LI Xian-Ri
Qingdao Academy of Agricultural Sciences, Key Agribiotech Laboratory of Qingdao, Qingdao 266100
提要 从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA。根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2，
用 RT-PCR 扩增 PMMV-QD 的 CP 基因的 cDNA，插入 pMD 18-T 载体，转化感受态受体菌 XL1-Blue，以蓝白菌落筛选
转化株，用 PCR 检测白色菌落，确认获得了含 cDNA 的阳性重组子。序列测定和比较的结果表明该片段确含有 PMMV
的 CP 基因编码区，此种 cDNA 与国外报道的 PMMV 病毒株系核苷酸序列的同源性达到 97.7%。
关键词 辣椒温和斑点病毒(PMMV); 外壳蛋白(CP)基因；cDNA；序列分析
收稿 2004-06-10 修定 　 2004-11-01
*E-mail: huangyuehy@sohu.com, Tel: 0532-7892652
辣椒病毒病害在田间发病极为普遍，严重影
响辣椒的产量和品质，可以侵染辣椒的病毒有30
多种[1]，而辣椒温和斑点病毒(pepper mild mottle
virus, PMMV)是对保护地栽培的辣椒最具有破坏性
的病原之一，在世界范围造成严重的经济损失。
这种病毒是正链 RNA 病毒——烟草花叶病毒组的
成员之一，病毒粒子呈杆状，可以通过机械接
种、农事操作或者种子传毒，至今尚未发现可以
传毒的生物介体。它不侵染番茄；在烟草中，当
与烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)或番
茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)竞争时，
其复制和积累的能力都有减弱[2]。
国外已经分别在1982、1984 和 1990 年对烟
草花叶病毒组 3 个成员 T M V、T o M V、T M G M V
(tabacco mild green mottle virus)的核酸全序列作了
报道[3~5]，90 年代后，对 PMMV 的许多株系也有
很多研究。Velasco 等[6]的研究指出，PMMV 的
RNA 基因组含有6 357 nt 和 4 个开放可读框。最
后的一个可读框编码外壳蛋白(coat protein, CP)。
采用病毒CP转基因使植物获得对病毒的抗性的报
道已有很多[7~9]，Shin 等[10]也证实 PMMV CP 基因
是筛选辣椒转基因的有用标记，但在我国尚未见
到 PMMV 分子生物学研究的报道，本文的目的是
克隆这种病毒包含有编码 17.2 kD CP 的基因序
列，并与已有报道中的同一类的结果进行比较和
分析，以期能为鉴定 PMMV 和辣椒抗病毒育种研
究奠定基础。
材料与方法
病毒来自本院分离株系 PMMV- Q D，用异硫
氰酸胍方法提取病毒 RNA[11]。用大连宝生物工程
有限公司的试剂盒[Takara One Step RNA PCR Kit
(AMV)]和自行设计的引物 P1、P2 进行反转录。
使用大连宝生物工程有限公司的试剂盒(PCR Frag-
ment Recovery Kit)进行cDNA回收。将回收产物
插入载体(pMD18-T)，转化宿主菌——大肠杆菌
菌株(XL1-Blue 购于Clontech 公司) ，以蓝白斑筛
选阳性克隆。从白色菌落中提取质粒，用自行设
计的引物进行 PCR 扩增，验证这种病毒 CP 基因
的转化效果，阳性克隆由大连宝生物公司进行序
列测定。
结果与讨论
1 引物设计
根据已报道的 PMMV 的 CP 蛋白自行设计、合
成2 个引物P1(5 ATTACTACCGCCGATGCTGAG 3)
和 P2(5 TGGAGGAAAAACACTACGAG 3)，二者
之间包含这种病毒基因组的5 287~6 235 nt，共949
nt。而编码CP的序列是5 685~6 158 nt，含有474
nt，位于 P1 与 P2 之间的序列之内。引物的退火
温度差为 2.5℃；最佳退火温度为 54.1℃。
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2 RNA 提取
所提取到 P M M V - Q D 的 R N A 紫外吸收值
( O D 2 6 0 / O D 2 8 0 )为 1 . 9 7，分子量主要集中在
100~3 000 bp位置(图1)。
进行反转录后进行琼脂糖凝胶电泳(图 1)。从图 1
来看，反转录的 cDNA 分子量与预期的反转录扩
增片段 949 bp 相符合。
从琼脂糖凝胶中回收 cDNA，与 T 载体连接
后转化宿主菌XL1-Blue，在含有X-Gal、IPTG和
Amp 的 L- 琼脂平板上进行蓝白斑筛选。选到7个
白色菌落，从中提取质粒进行 P C R 检测。结果
(图2)表明，7个菌落的重组质粒均含有这种病毒
的 C P 基因。
3 编码 PMMV-QD CP cDNA 区域的克隆
以病毒 PMMV-QD 的总 RNA 为模板，以 P1、
P2为引物，用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)
图2 PCR 检测重组质粒的 DNA插入片段
1~7: 7 个白色菌落质粒DNA 为模板; 8: 反转录的 cDNA 为
模 板 。
图3 重组质粒中插入的cDNA片段的碱基序列及推导的氨基酸序列
方框表示引物序列; 下划线表示 CP 基因序列。
4 核酸序列
提取重组质粒 DNA，对插入片段进行序列测
定，结果(图 3)表明，序列共有949 nt，与设计
图1 PMMV-QD RNA 及其 CP 基因 cDNA 的
琼脂糖凝胶电泳图谱
1、2: 病毒 RNA 提取物; 3: 阴性对照; 4~7: 反转录成的
cDNA; 8: 试剂盒自带阳性对照(462 bp); 9: 分子量标记 DL2000。
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的PCR 引物之间所包含的预期碱基数目完全相同。
我们所克隆的 c D N A 编码 C P 的位置是
398~872，该序列 5 端为一个启始密码子 ATG，
编码 Met，3 端为一个终止子 TAG，474 个碱基
编码157 个氨基酸残基(图 3)。
用 BLAST 程序查询GenBank 中的同源序列，
将本文中的 PMMV-QD 与其他几个病毒株系比较
(表 1 )，可以看到，碱基序列同源性最高的达
97%，CP 氨基酸序列同源性最高的为 100%，证
明我们分离到的病毒确为辣椒温和斑点病毒。
表1 PMMV-QD 的 cDNA 核酸序列及推测的 CP 氨基酸序列与其它病毒株系的比较
GenBank 编号 重合位置 CP编码区同源性 cDNA区同源性 氨基酸序列同源性
AB000709 1~949 462/471 928/949 (97.7%) 157/157 (100%)
AB069853 1~949 462/471 928/949 (97.7%) 157/157 (100%)
M81 413 1~949 461/471 926/949 (97.6%) 157/157 (100%)
AJ308228 1~949 446/471 897/949 (94%) 152/157 ( 96.8%)
在表1中，此种病毒的几个株系CP的氨基酸
序列同源性比核酸序列的同源性高。其原因从表
面上看是遗传密码兼并性造成的，更进一步说，
在生命活动中起功能作用的蛋白质在这种病毒的变
异和进化过程中比核酸更加稳定。Rodriguez-
Cerezo 等[12]指出此种病毒是高度稳定的进化群
体。从我们的实验结果也可以看到，P M M V - Q D
的 CP 氨基酸序列与 AB000709[13]、AB069853[14]、
M81413[15]完全相同，只是在核苷酸序列上存在差
异，再次说明 PM M V 是进化上相当稳定的病毒。
另外，从核酸序列推测得到 PMMV-QD 的 17
kD 的CP氨基酸组成与Velasco等[6]和向本春等[16]
分离到的毒株的氨基酸组成不同，其原因值得进
一步探讨。
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