全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 431
超量表达细胞D型周期蛋白CYCD3;1影响拟南芥根的发育
李芳，许颖，张姣，殷姗，喻富根 *
南京大学生命科学学院，南京 210093
提要：用雌激素诱导表达的启动子(XVE启动子)超量表达CYCD3;1的结果表明CYCD3;1的超量表达不仅抑制拟南芥初
生根的伸长，而且还抑制初生根对重力刺激的反应能力。
关键词：拟南芥；XVE 启动子；CYCD3;1；根的发育；向重力性反应
Overexpression of D-type Cyclin CYCD3;1 Affects Root Development in
Arabidopsis thaliana L.
LI Fang, XU Ying, ZHANG Jiao, YIN Shan, YU Fu-Gen*
College of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China
Abstract: To investigate the effect of CYCD3;1 on the development of Arabidopsis root, we had overexpressed
CYCD3;1 under the control of the estrogen receptor-based chemical-inducible system (XVE promoter). The
results demonstrate that CYCD3;1 overexpression inhibite the elongation of primary roots of Arabidopsis and
reduce their ability responding to gravitropic stimulus.
Key words: Arabidopsis thaliana; XVE promoter; CYCD3;1; root development; gravitropic response
收稿 2008-01-21 修定 2008-05-04
资助 国家自然科学基金(3 02 700 86 )和南京大学大学生创新
计划项目。
* 通讯作者(E-m a i l：fu gen yu @sina . com；T el：0 2 5 -
8 3 6 8 6 7 5 5 )。
植物发育是一个集细胞分裂、生长和分化为
一体的过程，而细胞分裂是受细胞周期活动调控
的(Inzé和 Veylder 2006)。在细胞周期中，有两
个关键的控制点，即G1/S期和G2/M期的转变。
在拟南芥中，D型细胞周期蛋白CYCD3;1限制G1/
S期的转变速度(Menges等2006)。Dewitte等(2003)
用 35S:CYCD3;1在拟南芥中组成型地过量表达
CYCD3;1后，细胞周期的几个时期的分配即有改
变，而且有丝分裂增加、细胞分化受抑制。由
于 35S:CYCD3;1是强组成型表达，转基因拟南芥
的生长发育会受到影响，而且植株的形态结构也
发生变异(Dewitte等2003)。本文采用含有XVE启
动子(受雌激素诱导的化学诱导系统)的 pER8质粒
获得了诱导表达CYCD3;1的转基因拟南芥(王慧博
等 2007)，用这一转基因的拟南芥定时、定量地
表达 CYCD3;1，研究雌激素诱导与非诱导条件下
转基因和野生型拟南芥，初生根伸长生长和对重
力反应的差异，以期进一步研究细胞周期活动与
植物形态发生和生长发育的关系。
材料与方法
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的生态
型为 Columbia型。取转化后收获的拟南芥种子，
用潮霉素抗性筛选获得转基因植株。转基因植株
自交后收获种子(F1代)，每个株系所结的种子作
潮霉素抗性筛选；选取有抗性与没有抗性的比例
为3:1的株系所结的种子(即转基因的遗传符合孟德
尔一对性状分离规律)萌发培养，分别收获每棵F1
代植株自交后所结的种子(F2代)，再分别抗性筛
选每棵 F1代植株所结的种子。如F2代不发生性状
分离(即全部有抗性)，则该棵 F1代植株是纯合植
株，其所结种子(F2代)为纯合体，可用于后续实
验(王慧博等 2007)。对纯合植株从分子水平上作
PCR鉴定，鉴定引物为：5 AACCGATGATACG-
GACGAAA 3和5 TTGTATGGAGCAGCAGACGC
3。PCR条件：94 ℃预变性 10 min；94 ℃变性
30 s，54 ℃退火 90 s，72 ℃延伸 30 s，35个循
环；72 ℃最后延伸 10 min。
配制 1/2MS培养基(0.8% 琼脂、1% 蔗糖，
pH 5.8)，20 mmol·L-1的雌激素(17- β-雌二醇)
(Sigma公司)母液(溶于二甲基亚砜，DMSO) ；诱
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导培养基加入雌激素(0.1、1、5 µmol·L-1)、0.02%
Tween20 (上海生工)，非诱导的培养基根据不同
诱导浓度，加入与诱导的培养基等量的DMSO和
0.02% Tween20 (Curtis等 2005)。将经过酒精灭菌
的种子点种在直径为 9 cm培养皿中的培养基上，
每盘 30 粒种子。用保鲜膜包好培养皿后，放入
4 ℃冷藏箱中同步化 3 d，取出培养皿并竖直放在
光照培养箱里。24 h光照，光照强度为 70 µmol·
m-2·s-1，温度为(22±0.5) ℃。
取生长 4 d (5 µmol·L-1雌激素诱导和非诱导)
的拟南芥幼苗的根，立刻用液氮冻存。用GTC法
(Konomi等 2002)提取根中总RNA。 用U-3000UV
分光光度计(HITACHI公司)测定总RNA浓度。用
M-MLV Reverse Transcriptase反转录试剂盒
(Promega公司)扩增 cDNA的第一条链。反转录体
系总体积为 25 µL，其中含有 1 µg总 RNA、0.5
µg Oligo dT引物，补加无菌水至 17 µL。70 ℃
预热 5 min，立即置冰上 2 min，再加入 1.25 µL
的 10 mmol·L-1 dNTP混合物、0.75 µL Rnase抑制
剂、5 µL的 5×M-MLV反转录缓冲液、1 µL的
M-MLV反转录酶。PCR反应条件为：42 ℃ 60
min，70 ℃ 15 min。4 ℃保存备用。
为检测引物(GeneScript公司合成)的特异性，
先做 RT-PCR (ABI 9700 PCR仪)，并用ACTIN2
做内参以标准化 cDNA的模板量。50 µL RT-PCR
反应体系中含有 1 µL cDNA模板。反应条件为：
94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，54 ℃退火
40 s，72 ℃延伸 15 s，扩增 33个循环。引物为
CYCD3;1-F：5 TCCTCAACAAATGCCACCG 3,
CYCD3;1-R：5 GAAAGAGGGTCAAAGGGA 3；
ACTIN2-F：5 TTGACTACGAGCAGGAGATGG 3,
ACTIN2-R：5 ACAAACGAGGGCTGGAACAAG
3。PCR产物经凝胶电泳后回收测序(GeneScript公
司 ) 。
测定 CYCD3;1表达量的实时 PCR (Real-time
PCR)用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 试剂
盒(TOYOBO，www.bio-toyobo.cn)，采用 ABI
PRISM 7700体系渗入法。反应体系为 20 µL，其
中含有 0.5 µL cDNA模板、0.4 µmol·L-1引物、
10 µL Master Mix，在每轮实时 PCR中都用 AC-
TIN2做内参以标准化 cDNA的模板量。反应条件
为：95 ℃预变性 60 s；95 ℃变性 15 s，54 ℃退
火 15 s，72 ℃延伸和数据收集 45 s，扩增 40个
循环。实验重复 9次(3次生物学重复，即提 3次
总 RNA；3次技术重复，即每个 cDNA模板做 3
次实时PCR)。CYCD3;1相对表达量按公式：∆CT=
CT (CYCD3;1)-CT (ACTIN2)计算，表达量 =100×
2-∆CT，实验数据为9次重复实验的平均值(Portereiko
等 2006)。
分析初生根长度和向重力性反应时，取生长
在培养基中的第 4、6 天的拟南芥幼苗拍照，用
AutoCAD软件计算其初生根根长。每个实验重复
3次，每次 30粒种子，培养皿竖直放在光照培养
箱中，光照强度为 70 µmol·m-2·s-1，光照 48 h后，
培养皿旋转 90度放置 2.5 h后，用 70%酒精固定
幼苗，于体视显微镜下拍照，用 AutoCAD软件
测量根长和根弯曲的角度。实验重复 3次，每次
30粒种子。在诱导与非诱导条件下，转基因株系
与野生型(WT)拟南芥的初生根根长和向重力性弯
曲角度的差异显著性，用成组 t检验。数据 =平
均值 ± 标准偏差。
实验结果
1 转基因株系AtD3;1-3的筛选和鉴定
从表 1可以看出，F1代植株有抗性与无抗性
的比值为 3:1，说明 T-DNA插在一条染色体上，
抗性植株自交后的 F2代全部有抗性，说明两条同
源染色体上都有 T-DNA插入，转基因株系AtD3;
1-3为纯合的植株。
表 1 潮霉素抗性培养基上转基因株系AtD3;1-3的筛选
Table 1 Screening of the transgenic plant AtD3;1-3
grown in hygromycin media
植株 长真叶的植株数 /个 未长真叶的植株数 /个
F1代 106 3 6
F2代 137 0
从图 1 可以看出，用所设计的 PCR 鉴定引
物，转基因株系 AtD3;1-3能扩增出目的条带(约
2 200 bp)，表明经过潮霉素筛选出的株系 AtD3;
1-3 为阳性。
2 雌激素诱导后转基因植株AtD3;1-3根中CYCD3;1
的过量表达
浓度为5 µmol·L-1的雌激素对启动子的诱导效
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果可以达到饱和(Zuo等 2000)。从图 2可以看出，
RT-PCR扩增的条带大小正确，CYCD3;1为 134
bp，ACTIN2为 138 bp，无杂带。切胶回收片
段，测序，发现引物的特异性很好，扩增出的
产物为目的基因 CYCD3;1和 ACTIN2的片段。内
参ACTIN2在转基因和野生型拟南芥中表达量几乎
一致。
CYCD3;1表达量都极低且无明显变化。说明XVE
系统是一高效可靠的诱导表达体系，转基因株系
AtD3;1-3的根能受雌激素诱导过量表达CYCD3;1。
图 1 转基因株系AtD3;1-3的 PCR检测
Fig.1 Identification of PCR product
of transgenic plant AtD3;1-3
1：AtD3;1-3；2：野生型(WT)；3：pERD3;1 质粒(王慧
博等 2007 ) (阳性对照)；4：空白对照；5：DN A分子量标准。 图 3 转基因植株AtD3;1-3和野生型拟南芥中CYCD3;1
相对表达量的Real-time PCR分析
Fig.3 Real-time RT-PCR analysis of CYCD3;1 expression
in wildtype and AtD3;1-3 Arabidopsis
诱导浓度单位为 µm o l . L - 1。下图同此。
3 CYCD3;1的过量表达对转基因植株AtD3;1-3的
初生根的伸长的影响
从图 4和图 5可以看出，在不同浓度(0.1、1、
5 µmol·L-1)雌激素的诱导作用下，生长 4 d和 6 d
的拟南芥转基因株系AtD3;1-3比同样条件下非诱
导的AtD3;1-3的初生根伸长明显变慢，抑制伸长
的程度随着雌激素浓度的增加而增加。很多文献
中已报道XVE启动子诱导基因表达的效果是随着
雌激素浓度增加而增加的(Zuo等 2000；Curtis等
2 0 0 5 )，因此雌激素浓度越高[雌激素浓度为 5
µmol·L-1时它对启动子的诱导效果就会达到饱和
(Zuo等 2000)]，CYCD3;1的表达越高，初生根
伸长越受抑制。需要说明的是：WT/0和WT/0.1、
WT/0和WT/1、WT/0和WT/5组合中WT/0根长
的差异是由DMSO (表面活性剂，破坏细胞膜)浓
度的不同造成的，高浓度的DMSO对野生型拟南
芥初生根的伸长有不利影响。
4 CYCD3;1的过量表达影响转基因植株的根向重
力性反应
从表 2和图 6可以看出，在重力作用下，经
过5 µmol·L-1雌激素诱导，转基因株系AtD3;1-3对
重力刺激的反应丧失，不再向地弯曲，而非诱导
的转基因株系AtD3;1-3则正常弯曲，向重力的反
应正常。诱导的转基因株系AtD3;1-3比非诱导的
根据公式CYCD3;1的相对表达量 =100×2-∆CT，
计算的转基因AtD3;1-3和野生型拟南芥中CYCD3;1
相对表达量的结果是，非诱导的 W T：∆ C T =
2.58±0.04；诱导的WT：∆CT=1.85±0.03；非诱
导的AtD3;1-3：∆CT=0.49±0.05；诱导的AtD3;1-3：
∆CT=-3.99±0.08。从图 3可以看出，与非诱导的
转基因株系AtD3;1-3相比，5 µmol·L-1雌激素诱导
的AtD3;1-3中CYCD3;1表达量大大增加，几乎提
高了 2 5 倍。诱导与非诱导的野生型拟南芥中
图 2 转基因株系AtD3;1-3和野生型拟南芥中
表达的CYCD3;1 RT- PCR扩增
Fig.2 RT-PCR amplification of CYCD3;1 expression
in wildtype and AtD3;1-3 Arabidopsis
1：D N A 分子量标准。2 ~ 5：A CT I N2 的 P CR 产物，其
中 2 为非诱导的WT；3 为诱导的WT；4 为非诱导的 AtD3 ;1-
3；5 为诱导的 AtD 3 ;1-3。6 ~ 9：CYCD 3 ;1 的 PCR 产物，其
中 6 为非诱导的WT；7：为诱导的WT；8 为非诱导的 AtD3 ;
1 -3；9 为诱导的 At D 3 ; 1 -3。
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AtD3;1-3的根伸长慢，而诱导与非诱导的野生型
拟南芥之间的向重力反应与根伸长无明显差异。
图 4 CYCD3;1的过量表达对转基因株系
AtD3;1-3的初生根伸长的影响
Fig.4 Effects of CYCD3;1 overexpression on primary
roots elongation of transgenic plant AtD3;1-3
图 5 生长 6 d的转基因植株AtD3;1-3
和野生型拟南芥根的生长
Fig.5 Growth of roots of the 6-d-old wildtype
and AtD3;1-3 Arabidopsis
1：非诱导的W T；2：诱导的W T；3：非诱导的 At D 3 ;
1 - 3；4：诱导的 A t D 3 ; 1 - 3。标尺：3 m m。雌激素诱导浓
度为 5 µmol·L-1。
表 2 CYCD3;1的过量表达对转基因株系AtD3;1-3
的初生根向重力性弯曲的影响
Table 2 Effects of the CYCD3;1 overexpression on primary
root gravitropic curvature of transgenic plant AtD3;1-3
植株 弯曲角度 /度 根长 /mm
非诱导的WT 34.0±12.0 3.87±0.66
诱导的WT 32.9±10.5 3.41±0.57
非诱导的 AtD3;1-3 36.2±12.1 3.21±0.65
诱导的 AtD3;1-3 0 2.37±0.46a
　　a 表示差异极显著，显著水平为 0 . 0 1。
图 6 转基因株系AtD3;1-3与野生型拟南芥的向地反应
Fig.6 Root gravitropic responses of wildtype
and AtD3;1-3 Arabidopsis
1：非诱导的W T；2：诱导的W T；3：非诱导的 At D 3 ;
1 -3；4 ~ 7：诱导的 A t D 3 ; 1 - 3。标尺：3 m m。雌激素诱导
浓度为 5 µmol·L-1。
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讨　　论
已有的研究表明，CYCD3;1促进细胞周期中
的植物细胞从 G1期进入 S期(Menges等 2006；
Dewitte等 2007)。组成型超量表达 CYCD3;1的拟
南芥，生长迟缓，大量的细胞不能及时退出细胞
周期而分化成熟(Dewitte等 2003)。与Dewitte等
(2003)用 35S组成型启动子相比，本文所用的雌
激素诱导的启动子能定时定量、严谨高效地表达
CYCD3;1，同时通过诱导与非诱导的转基因植株
的比较，排除了转基因操作本身对植株的影响，
能更加清晰准确地研究CYCD3;1的表达对根发育
的影响。本文结果表明，诱导后超量表达
CYCD3;1的转基因拟南芥，其初生根伸长生长比
野生型明显的慢。由于根的伸长主要靠成熟区的
细胞增大而变长的(Furutani等 2000)，所以可以推
测超量表达CYCD3;1对转基因拟南芥初生根伸长
生长之所以抑制，可能是其从分生区退出细胞周
期进入伸长区的细胞减少所致。
初生根生长发育的一个特点是其能感受重力
方向的变化，并调整自身的生长模式，因而根尖
端保持与重力方向一致( B e e m s t e r 等 2 0 0 3；
Ishikawa和 Evans 1995)。多数研究认为，根感
受重力的部位是根冠，而发生向重力弯曲生长的
部位在根的伸长区(Palme等 2006)。本文结果表
明，超量表达 CYCD3;1的转基因拟南芥，其初
生根的向重力反应能力丧失。由于超量表达
CYCD3;1会破坏细胞周期活动方式和抑制细胞分
化，因此我们认为，本文中植物根的向地性反应
能力的保持，必须有协调的分生区细胞周期活动
以及正确的伸长区细胞分化。这从另一个侧面为
研究植物细胞周期和细胞分裂以及分化之间的复杂
关系提供了一条新的思考途径。
参考文献
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