全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 673
拟南芥CKL3基因表达对非生物胁迫的响应
郭新红, 王婕, 秦玉芝, 喻达时, 刘选明 *
湖南大学生命科学与技术研究院, 生物能源与材料研究中心, 长沙 410082
提要: 以拟南芥为材料, 采用 PCR和 RT-PCR技术在DNA和 RNA水平上鉴定出了与 CKL3基因对应的 T-DNA插入纯合
突变体, 并对其表型变化进行了观察。半定量RT-PCR检测CKL3基因在拟南芥不同器官和非生物胁迫响应中表达的结果
表明, CKL3基因在根、花、叶中表达较高, 在茎、叶柄中表达较弱; 盐胁迫下CKL3基因表达下降, 蓝光下CKL3基因表达
升高, 但热激和红光对此基因表达量的影响不大。
关键词: 拟南芥; CKL3基因; 基因克隆; 非生物胁迫; 表达分析
Responses of CKL3 Gene Expression to Abiotic Stresses in Arabidopsis
GUO Xin-Hong, WANG Jie, QIN Yu-Zhi, YU Da-Shi, LIU Xuan-Ming*
Bioenergy and Biomaterial Research Center, Institute of Life Science and Technology, Hunan University, Changsha 410082, China
Abstract: The homozygous T-DNA mutants of the CKL3 gene in Arabidopsis were identified at DNA and RNA
levels, and its phenotypic changes were observed. The Semi-Quantitative RT-PCR was used for the analysis of
the expression levels of CKL3 gene in the different tissues and under abiotic stresses. The expression profiling
showed that CKL3 was highly expressed in roots, flowers and leaves, and less in stems and leafstalks. It was
found that CKL3 gene was induced by blue light and inhibited by salt stress, but not regulated by heat shock at
37 ℃ and red light.
Key words: Arabidopsis; CKL3 gene; gene cloning; abiotic stress; expression analysis
收稿 2008-04-09 修定 2008-06-23
资助 国家自然科学基金(30600368、30770200)和 2006 年
湖南省高校青年骨干教师资助项目(5 21 29 81 85 )。
致谢 美国加州大学洛杉矶分校林辰涛先生曾给予指导。
* 通讯作者(E-mail: sw_xml@hnu.cn; Tel: 0731-8821721)。
酪蛋白激酶(casein kinase, CK)是广泛存在于
真核生物的丝 /苏氨酸蛋白激酶, 包括CK1和CK2
两大亚类。后者是一种多效的能利用ATP或GTP
作为磷酸基团供体的蛋白激酶, 由4个亚基αα ββ
组成。有报道认为 160种蛋白可在体外被 CK2修
饰, CK2与转录调控、细胞增殖、信号转导、发
育和肿瘤发生等有关(Johnson等 1998)。前者是以
单体形式在体内各组织以及在细胞各种膜区室分布
广泛的激酶, 与DNA修复、代谢调控、有丝分裂
和信号转导的调节等过程有关(Gross和Anderson
1998; Bioukar等 1999; Kemp和 Pearson 1990;
Gietzen和Virshup 1999)。植物如黄豆(Murray等
1978a)、Brassica cauliflora (Murray等 1978b)、
小麦胚(Rychlik和 Zagorski 1980)、烟草(Erdmann
等 1982)、玉米幼苗(Dobrowolska等 1987)、青花
菜(Klimczak和 Cashmore 1993)、拟南芥(Klimczak
等 1995; Lee等 2005)、四棱豆(Mukhopadhyay
1997)和玉米胚乳(Babatsikos和Yupsanis 2000)中均
已分离纯化得到 CK 1。同源比较表明在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)基因组中可搜索到21个可能
的 CK1同工酶的 cDNA序列。到目前为止, 除了
Liu等(2003)报道了水稻OsCKI基因的生理功能以
外, 其他植物中 CK1的生理功能研究尚不多见。
迄今, 拟南芥CK2类蛋白中CKB3和CKB4的
植物体内功能研究已有报道。Daniel等(2004)报
道, CK2的调节亚基CKB3过表达可以影响拟南芥
生物钟的调节, 他们进一步的实验证明, CKB3通过
调节CCA1的磷酸化调控植株的生物钟, 因此认为
CK2对维持拟南芥生物钟的正常功能非常重要。
近年来, Perales等(2006)认为CK2的调节亚基CKB4
是一个核定位蛋白, 在生物体内以同分异构体存在,
其磷酸化异构体是蛋白质的泛素/蛋白酶体降解途
径中的首选底物, CKB4蛋白酶体降解受拟南芥生
物钟的调节。CKB3和CKB4是迄今发现与光信号
转导途径有关的 2个酪蛋白激酶基因。但拟南芥
CK1类蛋白功能的分析尚未见报道。拟南芥CKL3
基因属于 CK1类蛋白, 全长 1 769 bp cDNA序列
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月674
(AGI编号: AY547391), CDS长度为 1 248 bp, 编码
415个氨基酸。本文对拟南芥 CK1 类蛋白中的
CKL3基因表达和 T-DNA插入突变体做了鉴定分
析, 以期为进一步采用此基因改良农作物产量和品
质时参考。
材料与方法
拟南芥(Arabidopsis thaliana) CKL3 (At4g28880)
基因的 T-DNA插入突变体 Salk_110494购自美国
Salk研究院遗传分析实验室(Salk Institute Genomic
Analysis Labratory), 野生型拟南芥为Columbia生态
型。拟南芥种子用 70%酒精溶液浸泡, 吸出酒精
溶液后用无菌水清洗4~6次, 然后用0.1% HgCl2浸
泡 7 min, 吸出后用无菌水清洗 4~6次, 放入 4 ℃冰
箱中 4 d。播种时, 种子用 0.1%琼脂悬液悬浮后
均匀点播在含 0.8%琼脂的固体培养基表面, 置于
22 ℃光照培养箱中培养。移栽的植株则放在培养
室中于长日照条件下(光照16 h·d-1, 光照强度为100
µmol·m-2·s-1)生长。取 2周龄拟南芥幼苗在液氮中
速冻后, 储存于-80 ℃冰箱中供抽提 RNA和 RT-
PCR分析用。另外, 分别收取 5周龄植株的根、
茎、叶、叶柄、花放在液氮中速冻后储存于 -80
℃冰箱中供目标基因的组织表达分析用。取 T-
DNA插入突变体和野生型植株的新生叶3~4片, 用
DNA Plant Mini Kit (Ambiogen生物技术有限公司)
方法提取总 DNA。
非生物胁迫处理均以生长 2周龄的拟南芥进
行热激和盐胁迫处理。(1)幼苗放在 37 ℃恒温箱中
处理 0、1、2、3、6、8、1 0 h。( 2 )根放在
含 200 mmol·L-1 NaCl的液体培养基中处理 0、
1/4、1/2、1、2、4 h。(3) 22 ℃条件下暗培养
6 d的拟南芥幼苗放在蓝光和红光下分别处理 0、
1、6、12、24 h。蓝光和红光光源分别为 LED-
B (波长为 470 nm, 半幅宽为 30 nm)和 LED-R (波
长为 660 nm, 半幅宽为 20 nm), 光照强度均为 100
µmol·m-2·s-1。各种处理材料分时收获, 并以液氮速
冻后储存于-80 ℃冰箱中供目标基因的非生物胁迫
诱导表达分析用。
总 RN A 的抽提采用 RN Aeas y Mi ni K i t
(Ambiogen生物技术有限公司)按照说明进行, 反转
录按照 Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase
Instruction操作, 取 2 µg经DNaseI处理的总 RNA
用于 cDNA第一链的合成, 产物作为 RT-PCR模
板。
以提取的总DNA为模板, 用T-DNA的特异引
物 R0 (5 TGGTTCACGTAGTGGGCCATC 3)及基
因 5 与 3 端引物进行 P C R 反应。鉴定突变体
Salk_110494的 5与 3端引物分别为 Salk_110494
(+) (5 CTAAACAACAACCCTAAATCCTT 3)和
Salk_110494 (-) (5 ATGTCCAACAACTGAGAAAA-
GAG 3)。在相同 PCR反应体系中, 分别加入不同
引物组合: 基因 5与 3端引物各 1 µL, 基因 3引物
及T-DNA的特异引物R0各 1 µL。PCR程序为: 95
℃预变性 5 min; 95 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 30 s, 72
℃延伸 40 s, 30个循环后延伸 5 min。1%琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR产物。
用于CKL3组织表达和非生物胁迫诱导表达分
析的引物为5 GGCAGTTCCTGGGTCTAGCAATC-
3和 5 AATTAAGGGCACGGAGTCACATTA 3 。
内参肌动蛋白2引物为5 GCAAGTCATCACGAT-
TGGTG 3 和5 ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC
3 。PCR程序为: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性 30
s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s, 28个循环后延伸
10 min。每个 RT-PCR分析重复 3遍。1%琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR产物。
结果与讨论
1 T-DNA插入突变体的鉴定
根据ATIDB (Arabidopsis thaliana Integrated
Database)提供的信息, 得知 Salk_110494突变体为
正向插入, 插入位点在 CKL3基因外显子 154 bp
处。对 Salk_110494 T-DNA插入突变体进行DNA
分子水平的鉴定, 图1为Salk_110494突变体1~6号
株系的鉴定结果, 株系 5鉴定为突变纯合子。
图 1 Salk_110494 T-DNA插入突变体的 PCR鉴定
Fig.1 PCR identification of Salk_110494 T-DNA mutants
1 ~ 6 的引物为 R 0 / S a l k _ 1 1 0 4 9 4 ( - ) ; 1 ~ 6 的引物为
Salk_110494(+)/Salk_110494(- )。
2 纯合子株系的RT-PCR鉴定
从 DNA水平上鉴定为纯合子的株系 5进行
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 675
CKL3基因转录水平分析的结果表明, 野生型植株
中可检测到 CKL3基因的表达, 而突变体植株中则
检测不到。T-DNA插入突变导致该基因DNA不
能转录成 RNA, 所以突变体的RNA反转录后形成
的总 cDNA中缺少这种基因的 cDNA (图 2), 表明
所鉴定的突变体是 CKL3基因的沉默突变体。
h后的拟南芥中CKL3基因表达开始下降, 1 h时表
达量明显下降。(3)拟南芥从暗培养转移到蓝光下1
h后, CKL3基因表达开始增加, 6 h时表达量明显
增加。(4)拟南芥从暗培养转移到红光下 0~24 h后,
CKL3基因表达水平变化均不明显。
5 突变体的表型
收取突变体 Salk_110494的纯合子植株的种
子, 在同等条件下直接将野生型和纯合突变体的种
子播在土中观察表型的结果表明, 在不同的生长时
期, 野生型和纯合插入突变体的表型变化不明显, 均
能正常生长。同时, 观察非生物胁迫处理的野生型
和纯合插入突变体的表型, 结果表明, 在不同时间
的热激、盐胁迫、蓝光和红光处理过程中, 没有
观察到野生型和沉默突变体之间生长有明显的表型
差异。
目前, 我们构建了CKL3基因的过表达载体和
RNA干扰载体, 已转入拟南芥中, 期望通过过量表
达和抑制表达进一步研究 CKL3的生物学功能。
图 2 拟南芥野生型和突变体中CKL3基因的RT-PCR分析
Fig.2 RT-PCR analysis of CKL3 gene of the wild type and
mutant of Arabidopsis thaliana
3 不同组织中CKL3基因的表达
采用半定量RT-PCR分析检测CKL3基因在拟
南芥的茎、根、叶、叶柄、花等不同器官中表
达的结果(图 3)表明, CKL3基因在根、叶、花中
表达较高, 而在茎、叶柄中则较弱。暗示 CKL3
基因在拟南芥的根、花和叶的生长发育过程中可
能起作用。
4 非生物胁迫下CKL3基因的表达
图 4表明, (1)在 22 ℃和 37 ℃中生长的拟南
芥的CKL3基因表达水平差异不明显。(2)盐胁迫 1/4
图 3 CKL3基因在拟南芥各器官中的表达
Fig.3 CKL3 gene expression in different organs of
Arabidopsis thaliana
图 4 热激、盐胁迫和蓝、红光下的 CKL3基因表达
Fig.4 Expressions of CKL3 gene under heat shock, salt stress, blue light and red light
参考文献
Babatsikos C, Yupsanis T (2000). Separation and purification of
both CK-I and CK-II casein kinases in developing maize
endosperm-Phosphorylation of native HMG-proteins. J Plant
Physiol, 156: 492~503
Bioukar EB, Marricco NC, Zuo D, Larose L (1999). Serine phos-
phorylation of the ligand-activated beta-platelet-derived
植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月676
growth factor receptor by casein kinase I-gamma2 inhibits
the receptor’s autophosphorylating activity. J Biol Chem,
274: 21457~21463
Daniel X, Shoji Sugano S, Tobin EM (2004). CK2 phosphorylation
of CCA1 is necessary for circadian oscillator function in
Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 3292~3297
Dobrowolska G, Meggio F, Pinna LA (1987). Characterization of
multiple forms of maize seedling kinases reminiscent of ani-
mal casein kinases S (type 1) and TS (type 2). Biochim
Biophys Acta, 931: 188~195
Erdmann H, Bocher M, Wagner KG (1985). The acidic peptide-
specific protein kinases from suspension-cultured tobacco
cells: a comparison of the enzymes from whole cells and
isolated nuclei. Plant Sci, 41: 81~89
Gietzen KF, Virshup DM (1999). Identification of inhibitory
autophosphorylation sites in casein kinase I epsilon. J Biol
Chem, 274: 32063~32070
Gross SD, Anderson RA (1998). Casein kinase I: Spatial organiza-
tion and positioning of a multifunctional protein kinase
family. Cell Signal, 10: 699~711
Johnson LN, Lowe ED, Noble ME, Owen DJ (1998). The structural
basis for subastrate recognition and control by protein
kinases. FEBS Lett, 430: 1~11
Kemp BE, Pearson RB (1990). Protein kinase recognition se-
quence motifs. Trends Biochem Sci, .015: 342~346
Klimczak LJ, Cashmore AR (1993). Purification and characteriza-
tion of casein k inase I from broccoli. Biochem J, 293:
283~288
Klimczak LJ, Farini D, Lin C, Pond D, Cashmore AR, Giuliano G
(1995). Multiple isoforms of Arabidopsis casein kinase I
combine conserved catalytic domains with variable carboxyl-
terminal extensions. Plant Physiol, 109: 687~696
Lee JY, Taoka K, Yoo BC, Ben-Nissan G, Kim DJ, Lucas WJ
(2005). Plasmodesmal-associated protein kinase in tobacco
and Arabidopsis recognizes a subset of non-cell-autonomous
proteins. Plant Cell, 17: 2817~2831
Liu W, Xu ZH, Luo D, Xue HW (2003). Roles of OsCKI1, a rice
casein kinase I , in root development and plant hormone
sensitivity. Plant J, 36: 189~202
Mukhopadhyay K (1997). Purification and characterization of a
protein k inase from winged bean. Phytochemistry, 46:
461~467
Murray MG, Guilfoyle TJ, Key JL (1978a). Isolation and charac-
terization of a chromatin-associated protein kinase from
soybean. Plant Physiol, 61: 1023~1030
Murray MG, Guilfoyle TJ, Key JL (1978b). Isolation and prelimi-
nary characterization of a casein kinase from cauliflower
nuclei. Plant Physiol, 62: 434~437
Perales M, Portolés S, Más P (2006). The proteasome-dependent
degradation of CKB4 is regulated by the Arabidopsis biologi-
cal clock. Plant J, 46: 849~860
Rychlik W, Zagorski W (1980). Purification and characterization
of adenosine-3,5-phosphate-independent protein kinase from
wheat germ. Eur J Biochem, 106: 653~659