全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月148
PhytoPAM浮游植物分析仪用于微藻光合作用研究中几种参数设定的优化
张曼，曾波*
西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室，生命科学学院，重庆
400715
Optimal Parameterization of PhytoPAM Phytoplankton Analyzer in Microalgae
Photosynthesis Analysis
ZHANG Man, ZENG Bo*
Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Key Laboratory
of Plant Ecology and Resources in Three Gorges Reservoir Region, School of Life Science, Southwest University, Chongqing
400715, China
提要：PhytoPAM 浮游植物分析仪是一种用于藻类生长、光合作用、叶绿素荧光动力学研究的仪器。文章以蛋白核小球
藻为材料探讨 PhytoPAM 浮游植物分析仪用于量子产量测定和快速光响应曲线分析中最佳参数设定。结果表明，饱和脉
冲档位的选取对测定最大量子产量(Fmax)影响不大，但脉冲时长对其影响显著，脉冲时长以 0.2 s 为宜。稳态光照时长对
有效量子产量(FPSII)有影响，测定中设定的稳态光照时长以 120 s 为宜。在快速光响应曲线(RLC)分析中，步长(即照光时
间)以 30 s 为宜，适宜的最大测量光照强度(MML)应为藻培养光照强度的 3 倍左右。
关键词：PhytoPAM 浮游植物分析仪；小球藻；参数优化；量子产量；快速光响应曲线
收稿 2006-10-31 修定 　2006-12-30
资助 教育部 “ 春晖计划 ” 项目(2004-7)、重庆市科技项目
(2003-7858)和新世纪优秀人才支持计划。
*通讯作者(E-mail：bzeng@swu.edu.cn；Tel：023-
　68334839)。
自1931年Kautsky发现叶绿素荧光诱导现象
之后，叶绿素荧光诱导动力学技术已成为研究植
物生长和光合作用的方法(张守仁1999；韩博平等
2003；White和Critchley 1999；Ralph和Gademann
2005)。20 世纪 80年代，叶绿素荧光测定仪问世
后，研究者能更为方便地研究植物光合机理，揭
示植物生长及光合作用与环境因子的关系(White和
Critchley 1999；Jesus等2005；Ralph和Gademann
2005；Strain 等 2006)。在微藻研究中，人们用
叶绿素荧光测定仪测定微藻生长、分析水体中不
同微藻类群组成和阐释环境因子对微藻光能利用机
理的影响(Kolber和Falkowski 1993；Schreiber等
1994；Kashino 等 2002；Strzepek 和 Harrison
2004；Ivanov 等 2006)，有力促进了水体初级生
产力的估测，以及水华爆发的检测和藻类光合机
制的研究。目前，在诸多分析浮游植物的叶绿素
荧光测定仪中，德国 Walz 公司生产的 PhytoPAM
浮游植物分析仪(PhytoPAM Phytoplankton Analyzer)
可用于测定不同类群微藻(如绿藻、硅藻和蓝藻)
的生长和光合生产、叶绿素含量、光能利用效率
等，并可用于确定水体中不同类群微藻含量。此
种仪器由于功能多、测定耗时少且精度高，在国
外已成为用于微藻研究的重要设备，为很多研究
机构所使用(Kühl等2001；Jesus等2005；Juneau
等2005；Juneau和Harrison 2005；Strain等2006)，
国内对此仪器的使用目前尚处于起始阶段(韩志国
等2005)。尽管 PhytoPAM浮游植物分析仪已成为
微藻研究中的重要设备，但到目前为此，如何正
确使用该仪器以使测定的结果更为准确和高效，
国内外尚无系统的研究和报道。
应用 Ph y t o P A M 浮游植物分析仪研究微藻
时，常需分析微藻的光能利用效率和光合特征，
其中包括微藻的最大量子产量(maximal FPSII,
Fmax)、有效量子产量(FPSII)以及基于电子传递速
率的快速光响应曲线(rapid light curve, RLC)。Fmax
和FPSII是衡量光合能力的指标(Lambers等1998)。
基于电子传递速率的光响应曲线类似于通常意义上
的基于CO2固定的光响应曲线(photosynthetic rate-
light curve) (McMinn等2003；Serôdio等2005)，
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通过此光响应曲线，可以分析得到光响应曲线线
性区段斜率(a)、最大电子传递速率(ETRmax)及饱
和光照强度点(Ik)。在用此仪器测定微藻的上述指
标时，其结果受相关参数设定的影响，具体表现
为：(1)在Fmax 和FPSII 的测定中，给予的饱和脉
冲强度大小和饱和脉冲持续时间对量子产量有影响
(Gmbh 2003)，饱和脉冲强度过小或饱和脉冲时间
过短会导致量子产量测定值比真实值低；(2)在测
定某光照强度下微藻的FPSII时，需要对处于测定
杯中的微藻样液给予一定时间与原生长环境一样强
度的光照(以下简称稳态光照)，稳态光照时间长
短会影响测得的FPSII值；(3)在分析微藻的基于电
子传递速率的光响应曲线时，要保证所设定的最
大光照强度足够高以获得微藻的 ETR max。但是，
最大光照强度过高所导致的光抑制现象又会使仪器
测得的 E T R ma x 偏低。另一方面，在光响应曲线
测定中，对于任一光照强度，理论上的光照时间
应足够长以保证微藻完全适应此光照环境，并表
现出与此光照强度相对应的 ETRmax，但在实际测
定中对任一光照强度都给予很长的光照时间却难以
做到。在实际测定中，最大测量光照强度
(maximal measuring light, MML)以及光照强度的照
光时间(步长)都需要由研究者自行设定，设定值
的大小将影响 I k、E T R ma x 以及 a 测定值的大小
(Gmbh 2003)。
为了正确而有效地使用 PhytoPAM 浮游植物
分析仪，保证此仪器用于微藻研究的科学性和可
靠性，并促进其在实验研究工作中的应用，我们
对微藻光能利用和光合特征分析中相关参数的最优
设定从以下3个方面进行了研究：(1) Fmax测定中
的最适饱和脉冲强度和最适饱和脉冲持续时长的确
定；(2) FPSII测定中的稳态光照强度的最适光照时
长的确定；(3)光响应曲线测定中最适 MML 及步
长的确定。
材料与方法
1 实验材料
以分离自嘉陵江(长江支流)的蛋白核小球藻
(Chlorella pyrenoidosa Chick.)为实验材料，于HGZ
培养液(华汝成1981)中在光照强度150 mmol·m-2·
s-1、温度 20 ℃下静止培养。培养 5 d 后，取对
数生长期的藻液进行测定。
2 实验方法
用 PhytoPAM 浮游植物分析仪(PhytoPAM
Phytoplankton Analyzer，德国Walz公司生产)测定
并分析小球藻的Fmax、FPSII 和 RLC。在实际测定
中，每个指标用相同浓度的小球藻培养液(约 200
mg·L-1)重复测定3次。
PhytoPAM 浮游植物分析仪饱和脉冲共有 10
个强度设置，分别以档位 1~10 表示，从 1~10 强
度依次增大。为分析饱和脉冲强度和脉冲时长对
Fmax 的影响，确定最适饱和脉冲强度，实验中共
选用5个不同饱和脉冲强度(分别为2、4、6、8、
10档)和5个饱和脉冲时长(分别为0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5 s)。分别测定不同饱和脉冲强度和不同
饱和脉冲时长设定下小球藻的Fmax，测定前小球
藻的样液预先在20 ℃下暗适应处理20 min。
为分析稳态光照时长对FPSII的影响以确定最
适稳态光照时长，实验中设定 7 个不同稳态光照
时长(分别为 20、40、60、120、150、180、
210 s)，测定不同稳态光照时长下小球藻的FPSII。
实验中饱和脉冲档位为 8 档，饱和脉冲时长为
0.2 s。
为分析 RLC 测定时最大光照强度和每一光照
强度照光时长的影响，确定 R L C 测定时最适的
MML 和步长，实验中设定 4 个不同步长(10、20、
30、40 s)和 4个不同光照强度步数(8、10、12、
15 步)。测定光强步数为 8 步时，依次设定光量
子通量密度(PFD)为 1、32、64、128、192、
256、320、384 mmol·m-2·s-1；步数为 10 步时，
依次设定 PFD 为 1、32、64、128、192、256、
320、384、448、512 mmol·m-2·s-1；步数为 12
步时，依次设定 PFD 为 1、32、64、128、192、
256、320、384、448、512、576、640 mmol·m-2·s-1；
步数为 15 步时，依次设定 PFD 为 1、32、64、
128、192、256、320、384、448、512、576、
640、704、832、960 mmol ·m-2·s-1。8、10、
12、15 步所对应的 MML 分别为 384、512、640、
960 mmol·m-2·s-1。分析不同光照强度和不同光照
时长下小球藻的光响应曲线的 ETR max、I k和 a。
3 数据分析
所有实验数据处理均用Spss 11.5和Microsoft
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Excel 2003进行统计分析。检验饱和脉冲大小和
时长对Fmax 以及 RLC 步长与 MML 大小对测定 Ik、
ETRmax 和 a的影响，采用双因素方差分析，稳态
光照时长对FPSII 的影响采用单因素方差分析。
结果与讨论
1 饱和脉冲大小和时长对测定Fmax的影响
档位选择对小球藻Fmax测定没有影响(表1)，
但不同饱和脉冲时长对Fmax 影响显著，Fmax 随着
饱和脉冲时长的增加先升后降(图1)。饱和脉冲时
长为0.2 s时的Fmax最高，且高于饱和脉冲时长为
0.3、0.4、0.5 s时的Fmax (图 1)。
又处于光抑制状态，荧光的非光化学猝灭成分增
加，以致测得的Fmax 偏小(韩博平等2003)。据此
认为，饱和脉冲时长以 0.2 s 为宜。
2 稳态光照时长对测定FPSII的影响
从图2可见：稳态光照时长从20 s增长到120
s 时，FPSII 随着稳态光照时长的增长而增加；而
稳态光照时长从120 s继续增长到210 s时，FPSII
增加不明显，不同稳态光照时长所对应的 FPSII 没
有明显差异。
图1 饱和脉冲时长对小球藻Fmax的影响
　　图中数据为平均值 ± 标准误，不同小写字母表示在0.05 水
平上差异显著。下图同此。
图2 稳态光照时长对小球藻FPSII的影响
在Fmax 测定时，选择的代表不同强度的5个
饱和脉冲档位对其影响不大，即使低档位的饱和
脉冲，其强度也能保证 Fmax 测定对光强的要求。
但是，饱和脉冲时长对Fmax有明显影响(图 1、表
1)，Fmax 随饱和脉冲时长的增加先升后降。这是
由于当饱和脉冲时长过短时，不足以引发其电子
传递通路完全拥塞，测得的Fmax 就会偏小(Gmbh
2003); 另一方面，当饱和脉冲时长过长时，微藻
在环境中的光照强度发生变化的情况下，处
于该环境中的微藻的 FPSII 与微藻对新的光环境的
适应程度有关。在新光照强度环境中的时间越
长，测得的量子产量越接近该光照强度环境应具
有的实际量子产量。时长过短测得的 FPSII 偏低，
这可能是所释放的荧光还不稳定，藻细胞没有足
够的时间适应稳态光照之故。因此，当稳态光照
时长从20 s增大到 120 s时，FPSII 逐渐增大。由
此可见，稳态光照时长 120 s 就能够正确地测定
FPSII，同时还能在一定程度上减少测定所花费的
时 间 。
3 RLC 测定中步长与 MML 的大小对 Ik、ETRmax
和 a 影响
研究表明，Ik和 ETRmax均随着RLC步长(即每
测量光照强度的照光时间)的增加而呈现增加的趋
势；同时，随着 MML 增加，Ik 和 ETR max 均呈现
先增后减的趋势(图 3)。
步长为40 s时测得的Ik显著高于10和20 s时
的Ik，与步长为30 s时测得的Ik值差异不显著(图
3-a)。当MML为512 mmol·m-2·s-1时，Ik最高，显
著高于MML为384和960 mmol·m-2·s-1时的Ik，与
MML为640 mmol·m-2·s-1时的Ik差异不显著(图3-
表1 饱和脉冲档位和脉冲时长对小球藻Fmax的影响
　　
变量
　　　　　　双因素方差分析
　　　　　
自由度 F值 　 显著性水平
档位 4 1.278 0.291
时长 4 2.639 0.045
档位 × 时长 16 0.370 0.984
　　档位选取 5 个不同饱和脉冲强度，分别为 2、4、6、8、
10 档；时长选取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 s。
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b )。
步长为 20、30、40 s 时测得的 ETRmax 差异
不明显，但显著高于步长为10 s时的ETRmax值(图
3-c)。MML 为 384、512、640 mmol·m-2·s-1 时测
得的 ETRmax 差异不明显，但显著高于 MML 为 960
mmol·m-2·s-1时测得的ETRmax值(图3-d)。
步长和 MML 大小对 a的影响均差异不显著，
且二者无交互作用(表 2)。
抑制，以致使高光照强度下的 E T R 值降低，从
而低估 ETRmax 和 Ik 的值。a可反映藻类对光能的
利用效率(Juneau等 2005)，步长和MML大小对 a
均无显著影响，这表明步长和 MML 对光能利用效
率影响不明显。
为得到较好的光响应曲线和较为准确的
ETR max、I k、a，我们以在短时间内同时可以测
得三者的最大值为标准，综合分析步长和 MML 的
合适选择。结果表明，最适步长为30 s (图3-a、c)，
最适 MML 为 512 mmol·m-2·s-1 (图 3-b、d)。由于
MML 为 512 mmol·m-2·s-1，而本研究中小球藻培养
的光强为150 mmol·m-2·s-1，据此认为，在RLC 的
测定中，步数设定时选取的 MML 以藻类培养光照
强度的 3~4 倍为宜。
PhytoPAM浮游植物分析仪的参数设置对分析
测定结果有明显影响。因此，在使用 PhytoPAM
浮游植物分析仪进行藻类量子产量测定和光响应曲
线分析时，需要考虑合适的参数设置。本文虽然
测定的只是蛋白核小球藻的结果，但这些参数对
大多数藻类的分析测定可能也有借鉴意义。如果
研究的藻种不同，为得到最佳测定结果，在正式
研究工作之前，应先确定所研究微藻的最适参
数，以保证研究工作的顺利进行。
图3 RLC的步长与步数对测定Ik和ETRmax的影响
表2 RLC 分析步长和MML 对小球藻 a的影响

变量
双因素方差分析
自由度 F值 显著性水平
步长 3 1.589 0.211
M M L 3 0.530 0.665
步长 × M M L 9 0.802 0.617
由以上结果可见， ETRmax和 Ik均随步长的增
加而增加，这是由于步长越长，在每一测量光照
强度下照光越久，藻液就越能有更多的时间适应
不同的光环境并反映出与光环境相应的荧光。
ETR max 和 Ik 均随 MML 的增加呈现先增后减的趋
势，这是由于当 M M L 偏大时，微藻开始受到光
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