全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月448
链格孢菌毒素对莱茵藻光合电子传递的抑制及其作用位点
刘玉晓 1，许晓明 1,*，戴新宾 1，强胜 2
南京农业大学 1生命科学学院植物科学系，2杂草研究室，南京 210095
提要 ：以野生型莱茵藻和其抗除草剂突变体为材料，检测链格孢菌毒素在光合电子传递链上的作用位点和模式的结果表
明，此种毒素抑制QA至QB的电子传递，是光系统 II抑制剂，其作用模式类似于苯酚类型的除草剂。
关键词：链格孢菌毒素；莱茵藻；电子传递；突变体；光系统 II
Inhibition and Action Site of Alternaria alternata Crofton-weed Toxin (AAC-
toxin) on Electron Transport of Photosystem II of Chlamydomonas reinhardtii Dang.
LIU Yu-Xiao1, XU Xiao-Ming1,*, DAI Xin-Bin1, QIANG Sheng2
1Department of Plant Sciences, College of Life Sciences, 2Weed Research Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, China
Abstract: The action site on photosynthetic electron transport and mode of Alternaria alternata crofton-weed
toxin (AAC-toxin) were investigated in wild and mutants of Chlamydomonas reinhardtii. The results showed
that toxin, a photosystem II (PS II) inhibitor, inhibited the electron transport between QA and QB, similar to
phenol-type herbicides in its action mode.
Key words: AAC-toxin; Chlamydomonas reinhardtii; electron transport; mutant; photosystem II
收稿 2007-02-07 修定 　2007-04-18
资助 “8 6 3”计划(2 0 0 6 A A1 0 A2 1 4 )和江苏省自然科学基
金(BK2 00 54 20 )。
* 通讯作者(E-ma i l：xu xm@njau .edu .cn；T el：0 25 -
8 4 3 9 5 4 2 3 )。
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)是
一种在我国广泛分布的外来入侵性杂草。强胜
(1998)曾从紫茎泽兰中分离到致病力强的链格孢菌
菌株，此种菌株能产生具有致病力的代谢产物，
其主要成分经纯化鉴定后，定名为链格孢菌毒素
(Alternaria alternata crofton-weed toxin，AAC-
toxin)。此种毒素在低浓度下即可杀死许多单双子
叶杂草(万佐玺等 2001)，因此很有希望开发成为
生物源型除草剂。我们以前的工作曾暗示此种毒
素能抑制光合作用的电子传递(Chen等 2005)，但
其具体作用位点还不清楚。此外，链格孢菌毒素
对光合磷酸化、非循环电子传递和ATP合成酶的
影响也尚未研究过。因此，要想利用链格孢菌毒
素开发商品化的除草剂，还应对其进行更系统的
研究，以了解此种毒素的准确靶标和作用模式。
单细胞真核绿藻莱茵藻，是属于真核类的低
等植物，类似于高等植物的细胞，并可以容易地
分离出各种突变体，因而成为研究光合作用机制
的一种实验模式生物。光系统 II反应中心的D1蛋
白是除草剂的结合蛋白，其 3.0 Å分辨率的光系
统 II的晶体结构也已经得到(Loll等 2005)。而抗
除草剂的莱茵藻D1突变体常用来鉴定涉及除草剂
结合的靶标氨基酸，从而更深入了解除草剂的结
合模式(Oettmeier 1999)。为此，本文用莱茵藻野
生型及抗除草剂的突变体，较系统地研究了链格
孢菌毒素在光合电子传递链中的作用位点和模式。
材料与方法
参照万佐玺等(2001)文中的步骤和方法分离和
纯化链格孢菌毒素，并溶于甲醇中。为了避免溶
剂对光合膜的破坏，类囊体悬浮液中的甲醇终浓
度都控制在 1% (V/V)以下，以避免甲醇的影响。
在以下实验中，类囊体先用不同浓度的毒素暗处
理 10 min，然后加到反应介质中，叶绿素终浓度
为 20 µg·mL-1。每个实验重复 3~5次。
野生型莱茵藻(Chlamydomonas reinhardtii
D a n g . )及 5 个突变体( D 1 - V a l 2 1 9 I l e、D 1 -
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Phe255Tyr、D1-Ser264Ala、D1-Leu275Phe和D1-
Gly256Asp)购自美国杜克大学莱茵藻遗传中心。
用 TAP营养液于人工气候箱中培养，每天光照和
黑暗时间为 12 h/12 h，光照强度为 80 µmol·m-2·s-1，
每隔 2 h摇动 1次。对数生长期收集细胞用于实
验。
类囊体提取参照Xiong 等(1997)文中的方法。
叶绿素测定参照Arnon (1949)的方法。
非循环光合磷酸化测定参照Wei等(1998)文中
的方法。其中ATP的含量采用荧光素 /荧光素酶
的方法测定，荧光素 /荧光素酶试剂盒购自中国科
学院上海植物生理生态研究所。
光合作用的电子传递参照Coombs等(1986)书
中的方法，用氧电极(Chlorolab2，Hansatech
Instruments，UK)测定。
Mg2+-ATPase活性测定参照 Ponomarenko
(2006)文中的方法，其中无机磷的测定用钼蓝法。
快速叶绿素荧光诱导动力学曲线用植物效率
分析仪(Handy PEA，Hansatech Instruments，UK)
测定。反应液体积为 0.5 mL，其中含有 0.1 mol·L-1
山梨糖醇、20 mmol·L-1 HEPES缓冲液(pH 7.0)、
10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 KCl、0.1 mmol·L-1
NH4Cl和一定量的类囊体(Xiong等 1997)，最终叶
绿素浓度为 5 µg·mL-1。反应液暗适应 5 min后，
加入不同浓度毒素，再次暗处理 10 min后测定，
作用光强度为 3 000 µmol·m-2·s-1。每个处理重复
6 ~ 8 次。
莱茵藻 D1突变体抗性和敏感性的测定参照
De Prado等(2000)文中的方法，略有改动。希尔
反应用氧电极法测定，反应液为 25 mmol · L- 1
Tricine-NaOH缓冲液(pH 7.6)、1 mmol·L-1 MgCl2、
1 mmol·L-1 MnCl2、2 mmol·L-1已二胺四乙酸二钠
盐(Na2EDTA)、0.4 mol·L-1山梨糖醇、3 mmol·L-1
铁氰化钾(FeCy)和 2.5 mmol·L-1 NH4Cl。EC50是抑
制希尔反应活性至 50%时的毒素浓度。毒素的抗
性因子定义为 R/S (REC50/SEC50)，其中，R代表抗
除草剂的莱茵藻突变体，S 为野生型莱茵藻。
EC50值用SAS 统计分析软件(Version 8.0)通过
logistic非线性回归计算，一元方差分析(Tukey’s
HSD test)用 SPSS软件(Version 13.0)计算，以分
析不同浓度处理之间的差异水平。实验数据表示
为平均值 ± 标准差。
实验结果
1 链格孢菌毒素对ATP合成和光合电子传递的影响
藻类光合磷酸化的速率比高等植物低(Fiedler
等 1997)。如图 1所示，链格孢菌毒素抑制 ATP
生成(P<0.01)，EC50为 85.02 µg·mL-1。ATP生成
与光合电子传递相耦联，因此，为研究此种毒素
对 ATP 合成的抑制，我们测定了其对基础、解
耦联和耦联磷酸化的电子传递的影响。结果显
示，其可抑制基础和解耦联的电子传递，其浓度
越大抑制能力越强，且各浓度之间的差异显著
(P<0.01)。但在其浓度小于 40 µg·mL-1时磷酸化的
电子传递活性未受到影响(P>0.05，表 1)，高浓
度下才抑制。另外，链格孢菌毒素对解耦联的电
子传递的抑制程度明显强于基础和耦联磷酸化的电
子传递，EC50分别为 81.48、199、124.5 µg·mL-1，
当浓度为 120 µg·mL-1时，电子传递活性分别下降
到不加链格孢菌毒素的 26.5%、62.8%、54.6%。
据此，我们推断链格孢菌毒素的作用位点在类囊
体膜处于解耦联的状态下时被暴露，而在膜的能
量化过程中(磷酸化和基础的状态)，大部分被掩
藏。并且链格孢菌毒素促进电子传递发生解耦联
和抑制磷酸化反应的能力非常小。因此可以认
为，链格孢菌毒素阻断电子传递可能是ATP合成
受抑的主要因素。
此外，我们又分别测定了链格孢菌毒素对光
系统 II和光系统 I的电子传递的影响。结果表明，
随着链格孢菌毒素浓度的增加，其对光系统 II的
图 1 链格孢菌毒素对莱茵藻类囊体非循环
光合磷酸化的影响
Fig.1 Effect of AAC-toxin on non-cyclic photophosphoryla-
tion of C. reinhardtii thylakoids
不加毒素的值为(27.19±0.763) µmol (ATP)·mg-1 (Chl)·h-1。
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抑制逐渐增强，且各浓度之间差异显著(P<0.01) ；
但链格孢菌毒素对光系统 I电子传递几乎没有影
响，只是在高浓度时显示出轻微的抑制(表 2)。因
此可以推测，此种毒素的作用位点似在光系统 II。
(100%~200%)相比，其解耦联电子传递的能力是
微弱的，并且这种解耦联特性可能是由于链格孢
菌毒素本身结构的脂溶性影响类囊体膜蛋白的稳定
性所致。另外，高浓度的链格孢菌毒素抑制Mg2+-
ATPase的活性。这与非循环磷酸化的电子传递在
高浓度时受到的抑制一致，说明链格孢菌毒素在
高浓度时可能对 ATP合成酶有轻微影响。
3 链格孢菌毒素对叶绿素荧光诱导的影响
莱茵藻类囊体的快速荧光诱导动力学曲线与
高等植物类似，呈典型的OJIP曲线(图 3)。不同
浓度链格孢菌毒素明显影响莱茵藻类囊体叶绿素的
荧光诱导。首先，随着链格孢菌毒素浓度的增
加，J 点(大约 2 ms)逐渐增高。其次，Fo (暗适
应状态下的最小荧光)也逐渐变大。另外，没有
表 1 链格孢菌毒素对莱茵藻类囊体非循环电子传递的影响
Table 1 Effects of AAC-toxin on non-cyclic electron transport of C. reinhardtii thylakoids

链格孢菌毒素浓度 /µg·mL-1
电子传递活性 /%
解耦联的电子传递 基础的电子传递 耦联磷酸化的电子传递
0 100.0±0.00Aa 100.0±0.00Aa 100.0±0.00Aa
5 95.3±0.42Bb 96.8±0.80AaBb 99.1±0.82Aa
10 92.8±0.85Cc 95.2±2.95ABb 98.5±1.42Aa
20 89.8±1.50Dd 93.8±0.22BbCc 98.0±1.81Aa
40 85.4±1.77Ee 88.8±1.63Cd 94.9±1.56ABb
100 41.8±1.60Ff 71.6±2.56De 76.5±1.36Cc
120 26.5±1.25Gg 62.8±0.69Ef 54.6±0.16Dd
　　基础、耦联磷酸化和解耦联的电子传递不加毒素的值分别为(23.94±0.512)、(28.2±0.455)、(30.35±0.65) µmol (O2)·mg-1 (Chl)·
h -1。不同的大写字母表示有极显著差异( P= 0 .0 1 )，小写字母表示有显著差异( P= 0 .0 5 )，相同字母之间无差异。
表 2 链格孢菌毒素对莱茵藻类囊体解耦联光系统 II
和光系统 I电子传递的影响
Table 2 Effects of AAC-toxin on uncoupled PS II and PS I
electron transport of C. reinhardtii thylakoids
链格孢菌毒素
电子传递活性 /%
浓度 /µg·mL-1 光系统 II的电子传递 光系统 I的电子传递
(H2O→ PD/FeCy) (DCIPred→MV)
0 100.0±0.00Aa 100.0±0.00Aa
5 94.2±1.79Bb 100.0±2.07Aa
10 90.5±1.52Cc 99.5±0.86Aa
20 86.1±1.61Dd 98.8±2.10Aa
40 71.1±1.08Ee 99.2±1.61Aa
100 28.4±1.02Ff 86.7±1.17Bb
　　光系统 II 和光系统 I 电子传递不加毒素的值分别为(52.9±
0.86)和(48.2±0.12) µmol (O2)·mg-1 (Chl)·h-1。对苯二胺(PD)、
铁氰化钾( F e C y )和甲基紫精( M V )为电子受体，二氯酚靛酚
(DCIP)在抗坏血酸存在下为电子供体。不同的大写字母表示有
极显著差异(P=0.01)，小写字母表示有显著差异(P=0.05)，相
同字母之间无差异。
2 链格孢菌毒素对Mg2+-ATPase活性的影响
如图 2所示，低浓度(<20 µg·mL-1)的链格孢
菌毒素提高Mg2+-ATPase的活性，即便如此，最
大酶活性也仅提高了 37% (5 µg·mL-1时)。因此，
与 NH4Cl等解耦联剂提高Mg2+-ATPase的活性
图 2 链格孢菌毒素对莱茵藻类囊体
Mg2+-ATPase活性的影响
Fig.2 Effect of AAC-toxin on Mg2+-ATPase activity
of C. reinhardtii thylakoids
不加毒素的值为(170.224±2.399) µmol (Pi)·mg-1 (Chl)·h-1。
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K 峰(300 µs)出现。在毒素浓度达到最大(160
µg·mL-1)时，J点即饱和，荧光诱导曲线形状也由
OJIP转化成 OJ。
最后，根据抗除草剂的氨基酸位点位于D1蛋
白上的第四和第五螺旋之间的 2 1 1 ~ 2 7 5 位
(Oettmeier 1999)的看法，我们又用 5个莱茵藻抗
除草剂突变体做了一些实验。突变体对链格孢菌
毒素在表现抗性的条件下，R/S值大于 1；表现
超敏感或负交互抗性时，R/S值小于 1 (Oettmeier
1999)。结果显示，突变体D1-Ser264Ala 和D1-
Phe255Tyr对该毒素没有表现抗性。但突变体D1-
Val219Ile、D1-Gly256Asp、D1-Leu275Phe表现
出轻微的抗性(表 3)。这表明D1蛋白的氨基酸位
点 219、256、275与毒素的结合有关，并且链
格孢菌毒素确实通过取代了QB的结合位点，从而
引起QA至 QB的电子传递受抑制。另外，Trebst
等(1993)提出，苯酚类除草剂和典型的三嗪 -脲类
除草剂的主要区别在于，突变体D1-Ser264Ala对
前者不表现抗性，而对后者则表现高抗性。所
以，我们认为链格孢菌毒素的作用模式类似于苯
酚类的除草剂。
讨　　论
现代农业的发展离不开除草剂的应用，而不
同的除草剂在植物体内有不同的靶标位点。其
中，靶标定位于光系统的除草剂遂成为研究和开
发的热点。为了开发抑制光合作用的生物源型除
草剂，许多天然产物和衍生物都已有深入的研
究，并认为，这些天然产物可以作用在光合作用
电子传递链的不同水平，如放氧复合体、P680到
QA、Q A到 Q B、PQ 库、Cytb6f-PC 等。此外，
还可以作为能量传递抑制剂或者解耦联剂。
光系统 II抑制剂，包括很多化合物(天然或合
成的)和除草剂，能取代QB并抑制QA至QB的电子
传递。它分为两大类：典型的三嗪 - 脲类除草剂
和苯酚类的除草剂(Trebst等 1993)。三嗪 -脲类除
草剂在D1蛋白的结合定向优先朝向Ser264，而苯
酚类则朝向His215 (Oettmeier 1999)。即三嗪 -脲
类除草剂在D1蛋白上主要和Ser264相互作用。当
Ser264突变为其他氨基酸时，突变体会对三嗪 -脲
类除草剂表现高抗性，对苯酚类则仍表现敏感。
链格孢菌毒素是一种致病真菌产生的天然代
谢物，本文结果显示，此种毒素首先抑制ATP的
合成。Gould (1976)认为ATP合成的抑制由以下
图 3 链格孢菌毒素对莱茵藻类囊体叶绿素荧光诱导的影响
Fig.3 Effect of AAC-toxin on Chl a fluorescence transients of C. reinhardtii thylakoids
表 3 莱茵藻D1突变体对链格孢菌毒素的R/S值
Table 3 R/S values of AAC-toxin in D1
mutants of C. reinhardtii
突变体 R/S值 抗性或敏感性
D1-Val219Ile 1.87 抗
D1-Gly256Asp 1.67 抗
D1-Leu275Phe 2.13 抗
D1-Ser264Ala 0.88 敏感
D1-Phe255Tyr 0.81 敏感
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3种原因引起：(1)电子传递受到阻断；(2)电子传
递发生解耦联；(3)磷酸化反应被抑制。据此，我
们对这些原因作了分析并推测链格孢菌毒素对光系
统 II电子传递是有抑制作用的。快速叶绿素荧光
诱导动力学方法的研究结果显示“J”点和 Fo增
高，无K峰出现。Strasser和Govindjee (1992)认
为“J”点的增高可归因于 QA和 QB之间电子传
递速率的下降，因此，可推测链格孢菌毒素影响
QA和QB之间的电子传递。至于 Fo变大，其原因
可能是暗适应状态下，反应中心处于 S 0 状态
(QAQB-)，加入链格孢菌毒素后，QB被取代，所
带的电子便回传给QA所致。放氧复合体失活可引
起K峰的出现(Srivastava和 Strasser 1996)，但在
我们的实验中并没有K峰出现，说明链格孢菌毒
素对光系统 II供体侧没有抑制作用。总之，快速
叶绿素荧光诱导动力学结果进一步推断出链格孢菌
毒素抑制光系统 II受体侧QA和QB之间的电子传
递。另外，结合抗除草剂突变体，我们推测此
种毒素的作用模式类似于苯酚类的除草剂。
总之，链格孢菌毒素是天然的光系统 II抑制
剂，作用位点在 Q B，作用模式类似于苯酚类的
除草剂。并且 D1蛋白的 219、256、275三个氨
基酸位点涉及毒素与QB的结合，其中，275位的
氨基酸可能性更大。对此，我们还将采用放射性
同位素标记方法进一步研究链格孢菌毒素和典型的
光系统 II抑制剂如DCMU和阿特拉津(atrazine)等
的竞争性结合，并借助计算机模型精确定位链格
孢菌毒素在QB结合区域的定向。
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