全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 963
黄瓜子叶节的蛋白质组双向电泳条件的优化
李凤玉 1,*, 潘德灼 1, 陈伟 2
1福建师范大学生命科学学院, 福州 350108; 2福建农林大学生命科学学院, 福州 350002
Optimization of Two-dimensional Electrophoresis for Proteome of Cucumis
sativus L. Cotyledonary Node
LI Feng-Yu1,*, PAN De-Zhuo1, CHEN Wei2
1College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China; 2College of Life Sciences, Fujian Agriculture and
Forestry University, Fuzhou 350002, China
提要: 对黄瓜离体子叶节的蛋白质双向电泳的条件进行优化的结果表明: 黄瓜子叶节蛋白质主要分布在pH 4~7范围, 用酚
抽提法制备蛋白质干粉, 第一向等电聚焦固相 pH梯度胶条(24 cm)的最适蛋白上样量为 1 200 µg, 第二向 SDS-PAGE采用
11.5%的分离胶, 可以得到1 100多个蛋白点。
关键词: 黄瓜子叶节; 蛋白质组; 双向电泳
收稿 2008-06-04 修定 2008-09-18
资助 福建省自然科学基金(B0510007)和福建省科技厅项目
(K 0 4 0 2 5 )。
* 通讯作者(E-mail: fyli@fjnu.edu.cn; Tel: 13067253699)。
蛋白质双向电泳(2-DE)技术是由 O’Farrell
(1975)创立的, 是差异蛋白质组学研究的重要技术,
也是蛋白质检测和质谱分析一类等后续工作前的关
键性一步。近年来, 双向电泳技术广泛应用于植物
学的研究, 在蛋白质水平上探讨水稻( S he n 等
2003)、小麦(范宝莉等 2004)和荔枝(陈伟等 2001)
等植物的生长发育机制。由于双向电泳涉及的环
节较多、植物材料的多样性以及植物组织中存在
着干扰电泳的代谢产物, 因此, 双向电泳条件往往
对电泳结果影响较大。杉木(杨梅等 2007)、白桦
树(宋学东等2006)和山黧豆(吴庆丰等2006)的蛋白
质双向电泳技术已有所报道。
黄瓜是研究植物成花和性别表达机理的常用
材料(陈惠明等 2005; 庞基良等 1999; 徐纪明和向
太和 2007)。近年来, 已有人将双向电泳技术用于
黄瓜蛋白质差异的研究(范海延等 2007; 屈中华等
2007), 但是技术尚不够成熟。本文从总蛋白抽提
方法、第一向等电聚焦 pH 范围、蛋白质上样量
以及SDS-PAGE分离胶浓度等方面进行了探讨, 为
植物蛋白质组学研究提供实验技术参考。
材料与方法
1 材料
材料为本实验室组织培养的黄瓜(Cucumis
sativus L.)幼苗离体子叶节。黄瓜品种 ‘早丰 1号 ’
种子购自大连园艺北方种业研发中心。
2 试剂和仪器
固相 pH梯度(IPG)胶条、IPG缓冲液、两性
电解质(ampholyte)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯
酰胺( B i s )、二硫苏糖醇( D TT)、尿素、硫脲、
二甲氨基丙磺酸(CHAPS)、β-巯基乙醇(β-Me)、
过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、碘乙酰
胺(IAA)、牛血清白蛋白(BSA)、Tris-饱和酚 pH
8.0, 以上均为进口试剂。所有溶液均用双蒸水(dd
H2O)配制。
IPGphor等电聚焦仪和Ettan DALT six垂直电
泳仪(Amersham Pharmacia Biotech公司), 高速冷冻
离心机(BECKMAN公司)。
3 蛋白质样品的提取和制备
采用三氯乙酸(TCA)-丙酮法和酚抽提法(刘康
等 2005)制备黄瓜离体子叶节的蛋白质干粉。取
20~30 mg蛋白质干粉, 加入 15倍体积的裂解液[7
mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% (W/V) CHAPS、
2% (V/V)两性电解质和 65 mmol·L-1 DTT]混合均匀
后, 置于35 ℃恒温水浴中2.5 h, 于常温下, 以20 000×g
离心 5 min, 取上清液。以 Bradford (1976)的方法
技术与方法 Techniques and Methods
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测定样品中蛋白质含量, 以牛血清蛋白为标准蛋
白。
4 双向电泳
向胶条槽中加入 450 µL含样品的水化液[7
mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% (W/V) CHAPS、
0.5% (V/V) IPG缓冲液、18 mmo·L-1 DTT和痕量
溴酚蓝], 放入胶条后滴加覆盖油, 盖上胶条槽盖子,
置于 IPGphor上, 等电聚焦(IEF)条件为 20 ℃, 50
µA·胶-1, 电压和时间参数为: 30 V (12 h)→200 V (1
h)→ 500 V (1 h)→ 1 000 V (1 h)→ 1 000~8 000 V
(0.5 h)→ 8 000 V (5 h)→ 1 000 V (2 h)。
等电聚焦后, 迅速取出 IPG胶条, 分别于平衡
液 I和平衡液 II [平衡液: 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH
8.8)、6 mol·L-1尿素、30% (V/V)甘油、2% (W/V)
SDS、痕量溴酚蓝。第 1次平衡每 10 mL平衡液
加入 100 mg DTT即平衡液 I, 第 2次平衡每 10 mL
平衡液加入 250 mg IAA即平衡液 II]中平衡15 min
后取出的胶条用滤纸小心吸去残余平衡液, 再用电
极缓冲液[0.025 mol·L-1 Tris、0.192 mol·L-1甘氨
酸、0.1% (W/V) SDS, pH 8.3]润洗 1 s, 并转移至第
二向 SDS-PAGE胶上。
平衡好的 IPG 胶条移至分离胶上端, 放入
Ettan DALT six电泳仪进行电泳, 先 10 mA·胶 -1电
泳 30 min, 后用 30 mA·胶 -1电泳, 示踪的溴酚蓝行
至凝胶底部边缘时停止电泳。
5 考马斯亮蓝染色
电泳结束后, 凝胶用蒸馏水冲洗后并用染色液
[0.03% (W/V)考马斯亮蓝 R-250、50% (V/V)甲
醇、10% (V/V)乙酸]染色 2 h后, 进行脱色处理直
至背景变浅和蛋白点清晰可见, 脱色后的凝胶用蒸
馏水冲洗 3次后用 Image Scanner扫描仪扫描。
结果与讨论
1 蛋白质干粉制备方法的比较
双向电泳中等电聚焦胶条合宜的pH与清晰可
辨的双向电泳图的获得关系极大, 有利于蛋白质差
异的比较(Görg等 2000)。本文中黄瓜离体子叶节
的大部分蛋白质分布在 pH 4~7范围内的酸性一
端。因此认为, 分离黄瓜离体子叶节应选择pH 4~7
的 IPG 胶条。
蛋白质干粉制备是双向电泳的关键步骤, 它的
好坏直接决定着双向电泳的分辨率、重复性和蛋
白质谱的清晰度(Bodzon-Kulakowska等 2007;
Giavalisco等 2003)。在蛋白质提取过程中, 如何去
除影响蛋白质可溶性和双向电泳重复性的物质(如
核酸、脂类和多糖等生物大分子以及盐类小分子)
很重要(郭尧君 2005)。大分子物质会阻塞凝胶孔
径; 盐浓度过高会降低等电聚焦的电压, 甚至损坏
IPG胶条。另外, 植物材料蛋白质含量也很重要,
而且植物组织中含有的色素、酚、醌、多糖等
代谢产物也会对后续的蛋白质分离和鉴定有影响
(Bodzon-Kulakowska等 2007)。因此, 蛋白质提取
方法是获取差异蛋白的关键。本文比较两种蛋白
质干粉的制备方法, 即TCA-丙酮法(图 1-a)和酚抽
提法(图 1-b), 上样量为 1 200 µg, 12%分离胶。
图 1结果经 Image Master 2D软件分析得出,
TCA-丙酮法提取的蛋白质干粉经双向电泳后得到
的蛋白点约有 450个, 而酚抽提的蛋白点约有 840
图 1 不同蛋白质干粉制备方法双向电泳图谱的比较
a: TCA-丙酮法; b: 酚抽提法。
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个, 比 TCA-丙酮法多近 400点, 且各点的分离比
较清晰, 能满足双向电泳分析的需要。因此认为,
酚抽提法更适合黄瓜离体子叶节中总蛋白质的提
取。
但TCA-丙酮法虽然能有效地抑制蛋白酶的活
性, 避免蛋白质降解, 可本文采用的黄瓜离体子叶
节中含有较多的多糖(如细胞壁中的果胶和纤维素)
等代谢产物, 会随着离心而沉淀下来, 以致蛋白质
干粉中的各类杂质增多, 对双向电泳会有不良效
果。酚抽提法是先将于液氮下研磨呈粉末的组织
材料溶解在蛋白质提取液中, 这样以酚抽提蛋白质
后, 再在蛋白质溶液中加入蛋白质沉淀剂, 离心得
到蛋白质沉淀物。所以认为, 酚抽提法得到的蛋白质
干粉中的杂质少, 可较好地避免多糖等物质的干扰。
2 样品溶液蛋白上样量的比较
双向电泳的第一向 IEF聚焦效果的好坏直接
影响蛋白质分离的好坏。在 IEF过程中, 样品溶液
中不能有太多的离子, 否则聚焦时电压升得很慢甚
至升不到所设定的电压, 从而影响聚焦的效果(郭尧
君 2005)。一般来说, 植物细胞内大部分蛋白质的
表达丰度很低, 所以提高样品的上样量会有利于低
丰度蛋白的检出, 但上样量过高又会引起高丰度蛋
白的斑点掩盖低丰度蛋白斑点, 而且样品中含有盐
离子, 上样量越大盐离子也越多, 盐离子浓度会直
接影响等电聚焦时电压的上升, 从而影响聚焦效果
(Giavalisco等 2003)。本文从样品制备方法、第
一向 IEF等电聚焦的电压设置、平衡时间、SDS-
PAGE凝胶浓度和染色方法的灵敏度等综合考虑,
比较上样量为 1 000、1 200和 1 400 µg蛋白的结
果表明, 上样量为 1 000 µg的蛋白质呈圆形, 检出
的蛋白点约有620个, 低丰度蛋白检出的量很少(图
2-a); 上样量为 1 200 µg, 蛋白点呈圆形, 横向与纵
向拖尾较少, 蛋白点分离均匀, 检出的蛋白点增加
到了1 100多个, 低丰度蛋白数量也明显增加(图2-
b); 上样量为 1 400 µg, 由于上样量过大, 使样品溶
液中的杂质及离子含量增大, 在 IEF过程中电压上
升缓慢, 等电聚焦效果较差(图 2-c)。据此认为, 最
佳的上样量为 1 200 µg。
3 SDS-PAGE分离胶浓度的比较
分离胶浓度会影响蛋白质分离的清晰度, 如果
图 2 不同上样量的蛋白质双向电泳图谱比较
a: 上样量为 1 000 µg; b: 上样量为 1 200 µg; c: 上样量为 1 400 µg。
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胶浓度过大, 蛋白质分离即不够清晰, 而且有的蛋
白质点会重叠; 如果胶的浓度过低, 虽然蛋白质点
可以较好地分开, 但分子量小的蛋白质点会丢失。
因此, 应该寻求相对最适的分离胶浓度。本文探讨
11.0%、11.5%、12.0%、12.5%的分离胶对黄瓜
蛋白质的分离效果表明, 11.0%的分离胶有部分蛋
白点丢失, 且蛋白点不够清晰(图 3-a)。11.5%的
分离胶蛋白点能充分分开, 且蛋白点清晰(图 3-b)。
12.0%的分离胶能够使小分子的蛋白点分开, 但是
大分子的蛋白点有的重叠, 有的不够清晰, 而且蛋
白前沿离溴芬蓝还有一段距离, 说明胶的浓度还可
以减小(图 3-c)。蛋白点在 12.5%的分离胶上分离
得不很清楚, 离溴芬蓝前沿还有一段较长的距离(图
3-d), 说明胶浓度太大。综合以上结果认为, 分离
黄瓜离体子叶节中蛋白质的分离胶的最适浓度为
11.5%。
总之, 黄瓜离体子叶节蛋白质双向电泳用 pH
4~7的 IPG线性胶条得到的分离效果较好, 用酚抽
提法制备黄瓜离体子叶节蛋白质干粉好, 第一向等
电聚焦最适上样量为 1 200 µg, 第二向 SDS-PAGE
图 3 不同分离胶浓度双向电泳图谱的比较
a: 11%分离胶; b: 11.5%分离胶; c: 12%分离胶; d: 12.5%分离胶。
用11.5%的分离胶, 是黄瓜离体子叶节中蛋白质双
向电泳的较佳方案, 图谱中蛋白点有1 100多个, 图
像清晰, 蛋白点的拖尾现象明显减少。
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