全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1041
影响水稻籼粳亚种间杂交构建回交自交系的花药培养效果的2个因素
向«‘朝1,2,3 张楷正2,3 李季航2,3 李平2,3,*
1 西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；2 四川农业大学水稻研究所，四川温江 611130；3 四川农业
大学作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室，四川雅安625014
提要 水稻籼粳亚种间杂交构建的回交自交系(BIL)的 10 个株系在 3 种诱导培养基、1 种分化培养基以及样株剪叶与否处
理的结果表明，通用培养基(GM)不适合于籼粳交后代 BIL 的花药培养。N6 和 SK3 都有较高的出愈率，但 N6 的绿苗发生
率比 SK3 高，说明 N6 的愈伤组织质量和诱导效果更优于 SK3。无论 N6 还是 SK3，剪去样株叶片的绿苗发生率显著下降，
显示花药培养过程中绿叶的作用很重要。完善籼粳亚种间杂交构建 BIL 的花药培养体系和从较多的株系中取材可保证花
药培养的后代有较大的二倍体群体以供选择。
关键词 水稻籼粳杂交后代；回交自交系；花药培养体系
Two Factors Influencing on Anther-cultural Effect of Backcross Inbred Lines
Constructed by Offspring of Oryza sativa ssp. Indica×Japonica
XIANG Xun-Chao1,2,3, ZHANG Kai-Zheng2,3, LI Ji-Hang2,3, LI Ping2,3,*
1College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China;
2Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Wenjiang, Sichuan 611130, China; 3Key Laboratory of Crop Genetic
Resource and Improvement, Ministry of Education, Sichuan Agricultural University, Yaan, Sichuan 625014, China
Abstract Ten lines of backcross inbred lines (BIL) constructed by offspring of Oryza sativa ssp. Indica×Japonica
were treated in three induction media, a differentiation medium, cutting leaves or not of sample plants. Results
showed that, general medium (GM) was not fit to anther culture of BIL. N6 and SK3 both hada high callus
induction frequency, but the proportion of green plantlet differentiation of N6 was higher than that of SK3. It
suggested that callus quality and induction effect of N6 was better. The proportion of green plantlet differentia-
tions was decreased evidently when cutting leaves were done in N6 or SK3. It indicated that green leaves could
have very important effect during the course of anther culture. To perfect the anther-cultural system of BIL and
select more cultured materials from BIL, there would be more diploid to be selected in anther-cultural progeny.
Key words offspring of Oryza sativa ssp. Indica×Japonica; backcross inbred lines; anther-cultural system
收稿 2006-06-08 修定 　2006-11-16
资助 国家“863”计划(2003AA212030)、教育部长江学
者和创新团队发展计划(IRT0453)。
*通讯作者(E-mail: liping@cngk.com, Tel: 028-
8274177)。
在我国杂交水稻研究中，籼稻种质资源已经
得到充分发掘，近几年育成的籼型恢复系的遗传
差异较小(王松文1997；刘殊等2002)。为了提高
产量、品质和抗逆性，扩大籼粳亚种间杂交的遗
传差异已成为研究者必需考虑的问题。但籼粳亚
种间杂交后代分离大，稳定周期长，出现理想单
株的几率很小。周开达和汪旭东(1997)在总结籼
粳亚种间杂种优势利用的经验时曾提出，选育亚
种间重穗型组合时，粳稻在亲本遗传背景中的比
例应不高于四分之一，在杂种中的比例不高于八
分之一。籼粳亚种间杂交后再回交构建回交自交
系(backcross inbred lines, BIL)能够大量减少其粳型
血缘，BIL 再经花药培养即可显著缩短育种周期
并提高选择效率。一般认为在选择花药培养的培
养基中，SK3 (陈英等 1992)和通用培养基(GM，
杨学荣等1980) 2个培养基是适用于籼粳亚种间杂
交后代或籼型水稻的花药培养。此外，调整培养
基配方以提高籼粳亚种间杂交后代花药培养效果的
报道较多(罗琼等 1995；刘保申等1996；张跃非
和张超英 1999；朱永生等 2001；何涛等 2002)。
而关于籼粳亚种间杂交构建BIL的花药培养和如何
优化其花药培养体系的报道还未见。本文选用
N6、SK3 和 GM 作为诱导培养基，以 MS 作为分
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化培养基，根据 3 种诱导培养基的愈伤组织质
量，选择最佳的诱导培养基。同时根据低温预处
理阶段绿叶对愈伤组织质量的作用大小及其花药培
养后代的自然加倍情况，完善了籼粳亚种间杂交
所构建的 BIL 花药培养体系。
材料与方法
水稻(Oryza sativa L.)的回交自交系(BIL)用
‘蜀恢 955’(♀)和‘Kitaake’(♂)构建。‘蜀恢
955’(Oryza sativa ssp. indica)是四川农业大学水
稻研究所的优良籼型恢复系, ‘Kitaake’(O. sa-
tiva ssp. japonica)是来自日本的特早熟粳稻。2000
年 8 月在四川温江做杂交，当年冬繁，选 1 个单
株与‘蜀恢 955’(♂)回交得到 BC1。2001 年夏
季从 BC1 中选 1 个与‘蜀恢 955’相近的单株再
与‘蜀恢 955’(♂)回交得到 BC2。BC2 当年冬繁
加代并选 1 个单株留种得到 BC2F1，BC2F1 再自交
并选1个单株留种得到BC2F2，在 BC2F3 构建株系，
到2004年夏季得到BC2F6。从 BC2F6 中选择综合性
状较好的10个株系进行花药培养研究，它们是株
系 153、155、179、181、226、230、234、
261、271 和 273。
花药培养材料的小孢子处于单核靠边期时取
材。取回的材料 155、179 和 261 作 2 种处理：
一半剪叶，另一半留叶；其它株系全部留叶。所
有材料均用 75% 的酒精消毒后，用湿纱布包裹，
然后放在7~10℃的冰箱中预处理7 d。
诱导培养基有：(1) N6：除大量元素和微量
元素Ⅰ外，还补充 2 mg ·L-1 甘氨酸、1 mg ·L-1
VB1、0.5 mg·L-1 VB6、0.5 mg·L-1 尼克酰胺腺嘌呤
二核苷酸(NAD)、0.5 mg·L-1 KT、1 mg·L-1 NAA、
2 mg·L-1 2,4-D、60 g·L-1 蔗糖和60 g·L-1 Na2SiO3。
(2) SK3：除大量元素和微量元素Ⅰ外，还补充
0.25 mg·L-1 Na2MoO4·2H2O、10 mg·L-1 甘氨酸、5
mg·L-1 VB1、2.5 mg·L-1 VB6、2.5 mg·L-1 NAD、
0.5 mg·L-1 KT、2 mg·L-1 NAA、2 mg·L-1 2,4-D、
60 g·L-1 蔗糖和60 g·L-1 Na2SiO3。(3) GM：除大量
元素和微量元素Ⅰ外，还补充0.025 mg·L-1 CuSO4·
5H2O、0.25 mg·L-1 Na2MoO4·2H2O、0.025 mg·L-1
CoCl2·6H2O、2 mg·L-1 甘氨酸、1 mg·L-1 VB1、0.5
mg·L-1 VB6、100 mg·L-1 脯氨酸、300 mg·L-1 水解
酪蛋白(CH)、1 mg·L-1 NAA、2 mg·L-1 2,4-D、
60 g·L-1蔗糖和60 g·L-1 Na2SiO3。每个处理重复3
次，单因素随机设计，采用 DPS 软件进行统计分
析 。
幼穗从预处理材料的叶鞘中取出，用 70% 的
酒精消毒5 min，再用 0.1% HgCl2 消毒 10 min，
然后用无菌水冲洗数次，最后取出花药放置在已
灭菌的培养基斜面上，每支试管接 30 枚花药。
所有愈伤组织的分化培养基均采用 MS 培养
基。培养基中附加 1 mg·L-1 KT、1 mg·L-1 NAA、
0.2 mg·L-1 IAA和60 g·L-1 Na2SiO3。
生根培养基为1/2 MS+30 g·L-1 Na2SiO3，不
加生长调节物质。
绿苗生长出 3 片以上的绿叶时，从试管内移
栽到海南陵水四川农业大学水稻所南繁站的试验田
内，移栽后的管理关键是在移栽后的半个月内夜
间必须注意保温。
实验结果
1 3种培养基诱导愈伤组织形成和分化的效应比较
7 个株系由通用培养基(GM)诱导的出愈率为
0~11.19%，平均为4.64%，此种愈伤组织的平均
绿苗发生率为3.99%，有5个株系的绿苗发生率为
0，说明 G M 诱导的愈伤组织质量很差，明显逊
色于 N6 和 SK3。杨学荣等(1980)认为 GM 针对籼
稻有良好的效果，但从我们的结果来看并不适合
于籼粳交偏籼后代的花药培养。
另外，N6 和 SK3 都有较高的出愈率，N6 培
养的 4 个株系出愈率为 5.87%~9.88%，SK3 培养
的 4个株系出愈率为6.58%~9.43%；N6 的平均出
愈率为 7.57%，SK3 的为 8.63%。但 N6 的平均绿
苗发生率为28.97%，而 SK3的为 24.60% (表 1)。
N6 和 SK3 的愈伤组织都是在同一种分化培养基上
分化的，它们绿苗发生率之所以有些差异，可能
是两者的愈伤组织质量不太相同所致。由此看
来，籼粳交后代的花药用培养基N6培养的效果似
乎好些。不同株系的出愈率和绿苗分化率无论在
N6 还是 SK 3 上，其差异均达到极显著水平。
2 样株叶片剪除对愈伤组织绿苗发生率的效应
从表 2 可以看出，无论是 N6 还是 SK3，剪
除样株叶片后的绿苗分化率显著下降，155+SK3
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的降幅最大，达到52.00%，179+N6 的降幅最小，
但也达到了 24.58%。经剪叶后，155+SK3 的绿
苗发生率降到 0 ，不剪叶的绿苗发生率则达到
52%。说明在花药培养过程中，除了去掉烂叶和
黄叶外，不能去掉绿叶，否则会严重影响愈伤组
织的绿苗分化率。各处理的绿苗分化率无论是剪
除样株叶片还是不剪均达到极显著差异。
3 不同株系的自然加倍
从表 3 可以看出，籼粳亚种间杂交构建 BIL
的不同株系的自然加倍中，二倍体的比例占多
数，其次是单倍体和多倍体，混倍体所占比例最
小。但不同材料间的差异很大，株系 155 的二倍
体、单倍体和多倍体分别为 35.71%、33.93% 和
28.57%，各自所占比例大概相当。而226 则全部
表1 N6和SK3培养基对不同株系的出愈率和绿苗分化率的效应
Table 1 Effect of N6 and SK3 media on calli rate and green plantlet differentiation rate of different lines
N6培养基 SK3培养基
株系
　　　愈伤组织数/个 出愈率/% 绿苗数/株 绿苗分化率/% 愈伤组织数/个 出愈率/% 绿苗数/株 绿苗分化率/%
153 285 8.19B 152 53.33A 266 9.43A 127 47.74A
181 183 5.87D 14 7.65D 75 6.58D 4 5.33D
230 255 9.88A 57 22.35C 123 9.11B 25 20.33B
271 233 6.75C 54 23.18B 414 8.52C 60 14.49C
总计 956 7.57 277 28.97 878 8.63 216 24.60
　　大写字母表示在 0.01 水平上差异显著(Duncan 法)。下表同此。
表3 不同株系的自然加倍数
Table 3 The nature-doubled number of different lines
单倍体 二倍体 多倍体 混倍体
株系
统计数/株 比例/% 统计数/株 比例 /% 统计数/株 比例/% 统计数/株 比例/%
153 72 28.80 160 64.00 16 6.40 2 0.80
155 19 33.93 20 35.71 16 28.57 1 1.79
179 55 37.67 71 48.63 18 12.33 2 1.37
181 11 55.00 9 45.00 0 0 0 0
226 7 100.00 0 0 0 0 0 0
230 23 26.14 61 69.32 4 4.55 0 0
234 6 9.23 57 87.69 2 3.08 0 0
261 29 61.70 18 38.30 0 0 0 0
271 5 6.58 60 78.95 10 13.16 1 1.32
273 63 45.00 62 44.29 14 10.00 1 0.71
总计 290 32.40 518 57.88 80 8.94 7 0.78
表2 样株叶片剪除对绿苗分化率的影响
Table 2 Effect of cutting leaves on green plantlets differentiation rate
剪叶 不剪叶 绿苗分化率 株系和培养基
愈伤组织数/个 绿苗数/株 绿苗分化率/% 愈伤组织数/个 绿苗数/株 绿苗分化率/% 下降率/%
179+N6 835 29 3.47B 385 108 28.05C 24.58
155+SK3 58 0 0C 100 52 52.00B 52.00
261+SK3 13 4 30.77A 17 9 52.94A 22.17
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都为单倍体，没有二倍体、多倍体和混倍体存
在。二倍体比例最高的是234 (87.69%)，多倍体
和混倍体比例最高的都是155 (分别为 28.57%和
1.79%)。181、226 和 261 没有多倍体发生。在
1 0 个株系中出现混倍体的也仅有 1 5 3、1 5 5、
179、271和 273，它们所占比例为0.71%~1.79%；
其它 5 个株系都无混倍体发生。各株系均为回交
自交系，基因型差异较小，说明尽管差异微小，
但对花药培养后代的绿苗自然加倍的影响仍很大。
讨 论
从籼粳亚种间杂交构建的 BIL 花培群体中可
以选育出优良的纯系。为了扩大遗传距离，加速
杂交后代的稳定性和提高选择效率，用籼粳亚种
间杂交构建的回交自交系的花药进行培养并再从中
选择优良单株是一种比较理想的策略(方宣钧等
2001；李梅芳和周开达 2001)。四川农业大学水
稻研究所较早用此法育成了水稻重穗型恢复系
‘蜀恢162’(周开达和汪旭东1997)。我们所得到
的518 个二倍体单株中，经 2005 年两季的测配，
几个单株都表现出较优良的综合性状，将母本的
大穗多粒、株叶形态好的特点与父本的早熟、后
期转色好及米质好的特点结合到了一处。
根据本文结果我们认为，完善籼粳亚种间杂
交构建 BIL 的花药培养体系时，应从较多的株系
中取材，这样才能够保证花药培养的后代有较大
的二倍体群体以供选择。籼粳亚种间杂交构建的
BIL进行花药培养时，应保留全部绿叶并用Ｎ6作
诱导培养基和 MS 作分化培养基，如此得到的绿
苗分化率较高，通用培养基不宜采用。由于不同
株系间绿苗的自然加倍率和二倍体比率差异很大，
有的甚至完全是单倍体，因此花药培养时最好从
BIL 中尽量多取较理想的株系进行培养，以保证
花培后代有较高的二倍体比率供育种选择。
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