全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月 91
拟南芥T-DNA 插入突变体atsuc3 的 PCR 鉴定
李敏 杨双 阮燕晔 樊金娟 张立军*
沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110161
Identification of atsuc3 with T-DNA Insertion by PCR
LI Min, YANG Shuang, RUAN Yan-Ye, FAN Jin-Juan, ZHANG Li-Jun*
College of Life Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
提要 应用两种植物T-DNA插入突变体PCR鉴定方法，即“三引物法”和“双引物法”对拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3
(目的基因两条染色体均发生 T-DNA 插入的纯合突变体)进行鉴定和比较的结果表明，“三引物法”由于易产生非特异性
扩增而无法得到 PCR 鉴定结果，从而导致鉴定失败；“双引物法”则可避免此种现象，得到可靠、有效的鉴定结果。
关键词 拟南芥；atsuc3；T-DNA 插入突变；蔗糖转运蛋白；PCR
收稿 2005-05-30 修定 　 2005-11-21
*通讯作者(E-mail：ljzhang@syau.edu.cn，Tel: 024-
88487163)。
基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关
基因，进行异体超表达研究( M e y e r 等 2 0 0 0，
2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变
技术，获得目的基因敲出突变体( B o u c h e 和
Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再
通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能
(Meyer 等 2004)。与前者相比，后者具有许多优
势(Meyer 等 2004)，已成为反向遗传学研究的主
要手段(Bouche 和 Bouchez 2001；Parinov 和
Sundaresan 2000)。
蔗糖是植物光合作用同化产物最主要的转运
形式，其转运的方向和速率对于高等植物的生长
发育至关重要，而其跨膜转运及在体内分配的过
程与蔗糖转运蛋白(SUTs或SUCs)密切相关(Barker
等 2000；Dreyer 等 1999)。研究表明，拟南芥
基因组中包含9个编码蔗糖转运蛋白的基因(AtSUC1~
A t S U C 9 )，构成拟南芥蔗糖转运蛋白基因家族
(Meyer 等 2000)。其中，AtSUC3 是该家族中基
因和蛋白质结构最为特殊、功能最具争议的成员
(Barker 等 2000；Meyer 等 2004)。目前，关于
AtSUC3功能的信息多来自酵母突变体异体表达研
究的结果(Barker 等2000；Meyer等2000，2004)，
而针对拟南芥植株本身的研究也主要集中于对
AtSUC3 表达规律的探索，尚未见生理功能的报
道。T-DNA 插入突变技术的反向遗传学研究策略
是研究AtSUC3生理功能的一个系统和直观的途径
(Bouche和Bouchez 2001；Meyer等2004；Parinov
和Sundaresan 2000)。
反向遗传学研究的首要条件是获得大量
AtSUC3 基因敲除突变体，建立一套快速、可靠
的T-DNA 插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重
要。目前，鉴定方法主要有2种(http://signal.salk.
edu/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物
法”。
“三引物法”的原理如图 1 所示，即采用三
引物(LP、RP、LB)进行 PCR 扩增。野生型植株
(wild type，WT)目的基因的两条染色体上均未发
生 T-DNA 插入，所以其 PCR 产物仅有 1 种，分
子量约900 bp (即从LP到 RP); 纯合突变体植株
(homozygous lines，HM)目的基因的两条染色体上
均发生 T-DNA 插入，而 T-DNA 本身的长度约为
17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物
的形成，所以也只能得到1种以 LB与 LP (或 RP)
为引物进行扩增的产物，分子量约410+N bp (即
从 LP 或 RP 到 T-DNA 插入位点的片段，长度为
300+N bp，再加上从 LB 到 T-DNA 载体左边界的
片段，长度为 1 1 0 b p ) ; 杂合突变体植株
(heterozygous lines，HZ)只在目的基因的一条染色
体上发生了 T-DNA 插入，所以 PCR 扩增后可同
时得到410+N bp 和 900 bp 两种产物。上述3种
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图1 “三引物法”原理示意(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html)
　　a: T-DNA 插入目的基因编码序列的方式、位置以及 PCR 鉴定反应所需引物。LP、RP：与目的基因片段互补的特异引物；
LB：插入 T-DN A 片段的特异引物；N：T-DNA 的实际插入位点与侧翼序列之间的距离(通常为 0~300 b p)。b：3 种可能的基
因型植株 P C R 产物的差异。W T ：野生型植株；H Z ：杂合突变体植株；H M ：纯合突变体植株。
图2 双引物普通PCR法原理示意(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html)
　　a：以 L P、R P 为引物，不同基因型植株 P C R 产物的差异。b：以 L P、L B 或 L B、R P 为引物，不同基因型植株 P C R 产
物的差异。N 、W T 、H Z 、H M 同图 1 。
情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因
型的植株。此法优点是可同时鉴定出纯合突变体
并确证 T-DN A 的插入情况。
“双引物法”的基本原理与“三引物法”相
似，即采用特异引物扩增目的基因片段和 T-DNA
插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴
定。具体方法如图 2 所示：首先以基因组 D N A
作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增目的基
因片段，初步鉴定出纯合突变体(图2-a); 然后再
以基因组 DNA 为模板，由 T-DNA 片段的特异引
物(LB)与 LP 或 RP 组成一对引物，扩增目的基因
T-DNA 插入片段，以确证所获突变体为 T-DNA 插
入目的基因的突变体(图2-b) (http://signal.salk.edu/
tdnaprimers.html)。此法的不足之处是完成最终鉴
定需进行两轮 PCR 扩增。
本文采用上述两种 PCR 方法，对 T-DNA 插
入突变体 atsuc3 进行了鉴定，并比较其鉴定结
果，旨在寻找一种针对T-DNA插入突变体atsuc3
快速、有效的鉴定方法，为进一步研究基因功能
奠定基础。
材料与方法
1 植物材料和试剂
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(Columbia-
0型)和T-DNA插入突变系(Salk_077715) T1代种子
由美国俄亥俄州立大学ABRC (Arabidopsis Biologi-
cal Resource Center)提供。种子播于混合基质(营
养土∶草炭土∶珍珠岩=1∶1∶1)中，16 h 光照/
8 h 黑暗，23~25℃控温培养。
2 单株总 DNA 的提取
采用改进的拟南芥基因组 DNA 提取法(杨双
等 2005)提取单株总 DNA。
3 “三引物法”P C R 鉴定
以所提取的植株总 D N A 为模板，进行 P C R
扩增。PCR 所用引物的设计参照 SIAGnAL 的相关
资料(http://signal.salk.edu/isectprimers.html)，PCR
试剂盒由大连博亚生物技术有限公司提供。3 条
物分别为：LP, 5 TCGACACCGAGTCACTCATCG
3；RP, 5 TCACCTTCACAATCACACACA 3；
LBa1, 5 TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 3。反
应体系共20 mL：1 mL模板、1 mL (20 mmol·L-1)
引物、0.4 mL (10 mmol·L-1) dNTPs、2 mL 10×PCR
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缓冲液、3.6 mL (25 mmol·L-1) MgCl2、Taq DNA
聚合酶1 U (BBI)、双蒸水。循环参数：94℃ 1 min，
58℃ 1 min，72℃ 2 min，30 次循环。1.7% 琼
脂糖凝胶电泳检测扩增结果，于波长300 nm的透
射光下观察，照相记录。
4 “双引物法”P C R 鉴定
4.1 纯合突变体的初步鉴定 以所提取的植株总DNA
为模板，进行 PCR 扩增，引物为 LP、RP (序列
同 3)。反应体系、循环参数及扩增结果的检测和
记录方法同 3。
4.2 T-DNA插入突变的确证 以4.1初步鉴定为纯
合突变株的总 D N A 为模板，以 L B a 1 、L P 和
LBa1、RP(序列同 3)分别作为一对引物，进行
PCR 扩增。反应体系、循环参数及扩增结果的检
测和记录方法同 3。
结果与讨论
1 “三引物法”鉴定的结果
“三引物法”P C R 鉴定结果如图 3 所示，
1~W 均在溴酚蓝前沿出现较宽且模糊的条带，分
子量小于100 bp。改变反应温度后，仍无法得到
特异性扩增条带(资料未列出)。产生这种结果的
原因可能是 PCR 反应体系的引物浓度过高，或者
是某条引物与反应过程中某个阶段的 PCR 产物结
合，形成非特异扩增所致。
性扩增产物(1104 bp)基本上相同。表明3号植株
可能为目的基因被敲出的 atsuc3 突变体，而 1、
2、4、5、6、7 号植株为杂合突变体或野生型
植 株 。
以 3 号植株总 DNA 为模板，确证 T-DNA 的
插入突变，扩增结果如图5 (RP与LBa1)和图6 (LP
与 LBa1)所示。图 5 中 W 和 3 只在溴酚蓝前沿出
现较宽且模糊的条带，分子量小于100 bp，具有
引物二聚体的典型特征。这说明 RP 与 LBa1 之间
图3 三引物(LP、RP、LBa1) PCR 图谱
　　M：Marker；W：野生型(Columbia-0 型)植株；1~7：
待鉴定植株。
图4 特异引物(LP、RP) PCR图谱
　　M：Marker；W：野生型(Columbia-0 型)植株；1~7：
待鉴定植株。
图5 使用 RP、LBa1 进行 PCR 检测的图谱
　　M：Marker；W：野生型(Columbia-0 型)植株；3：上
述初步鉴定的纯合突变体植株。
图6 使用 LP、LBa1 进行 PCR 检测的图谱
　　M：Marker；W：野生型(Columbia-0 型)植株；3：上
述初步鉴定的纯合突变体植株。
2 “双引物法”鉴定的结果
纯合突变体的初步鉴定结果如图 4 所示，除
3 外，1~W 均得到清晰的特异性扩增条带，产物
分子量在1 031~1 200 bp 之间，与目的基因特异
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片段过长，不能有效扩增，导致引物二聚体的形
成，所以 RP 与 LBa1 不能用于鉴定 T-DNA 插入
atsuc3突变体。图6中只有初步鉴定的纯合突变体
(3 号)出现特异性扩增条带，产物分子量大约为
700 bp。根据图4和图6的结果可以确证3号植株
为T-DNA插入突变体atsuc3，可用于进一步的鉴
定和基因功能研究。
总之，“三引物法”虽在理论上是可行的，
但在实际操作中由于 PCR 反应体系的引物浓度过
高，或者是某条引物与反应过程中某个阶段的
PCR 产物结合，形成非特异扩增等原因，还无法
获得理想的 PCR 扩增结果而导致鉴定失败。这虽
可能采用特定的方法，即控制反应条件的方法以
减少非特异扩增条带的产生，但这会大大增加实
验的成本和复杂程度；而“双引物法”则可避
免上述现象产生，鉴定成功率高，结果可靠，更
适用于从大量拟南芥 T-DNA 插入突变体中快速鉴
定出 atsuc3 突变体。本文结果对其他拟南芥 T-
DNA 插入突变体的筛选和鉴定也有一定的参考价
值。
参考文献
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