全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1168
酵母表达系统在植物功能基因组学研究中应用的局限性
潘维锋 李师鹏*
山东师范大学生命科学学院，济南250014
Yeast, a Model System to Elucidate Plant Gene Function: Application and Limi-
tation
PAN Wei-Feng, LI Shi-Peng*
College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China
提要 介绍了酵母表达体系在植物的功能基因组学研究中的应用，并对这一实验手段应用的局限性进行了分析，以期提
醒研究者应全面理解采用这一体系所获得的实验数据，确保据此而作出的结论全面、可靠。
关键词 酵母；拟南芥；基因组学；酵母功能互补；功能基因组学
收稿 2006-08-14 修定 　2006-10-23
*通讯作者(E-mail: lishipeng@ibcas.ca.cn, Tel: 0531-
85778862)。
随着 DNA 测序技术的不断完善，基因测序变
得越来越经济、有效、可靠。到 2006 年 6 月为
止已经完成包括酵母、人类、拟南芥在内的21个
真核生物基因组测序，另外还有 126 个真核生物
基因组计划正在进行中(数据来源于 NCB I 数据
库)。这些前沿性工作导致了大量新基因的发现，
为人们在基因组水平上研究生物的生长和发育等生
命现象打下了基础。单倍体啤酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)是1997年完成全基因组测序的，这是
第一个完成的全基因组测序的真核生物。整个酵
母基因组包括约6 200个不含内含子的基因。其中
很多基因的功能已得到较为深入的研究，有关信
息可以通过互联网在酵母基因组数据库中查到，
如斯坦福大学的 SGD (Saccharomyces Genome
Database)数据库。迄今，整个酵母的 95% 以上
的基因序列被系统敲除，不同的单基因敲除突变
体可以从Invitrogen公司 ATCC (American Type
Culture Collection)或EUROSCARF (European Sac-
charomyces cerevisiae Archives for Functional Analysis)
获得。
作为单细胞真核生物，酵母细胞较容易用来
表达其他真核生物的蛋白，用于蛋白质的亚细胞
定位和后期蛋白生物活性的分析；同时，作为最
早进行功能基因组研究的真核生物，酵母丰富的
信息可以为其他真核生物功能基因组研究提供参
考。事实上，不断完善的酵母研究体系大大促进
了包括植物在内的功能基因组学的研究进展。
本文介绍酵母表达体系在植物基因的功能基
因组研究中的应用，并对应用这一表达体系的局
限性作了分析。
1 酵母表达体系的优点
酵母表达体系具有许多优点：(1)作为真核细
胞表达体系，酵母与体外培养的动物、植物细胞
相比，具有操作简单易行、培养周期较短的特
点；(2)相对简便成熟的遗传操作技术，可以有效
地产生丰富多样的酵母突变体；(3)较为完善的表
达控制系统，如 PMA1 和 PDR5 等强启动子可以
介导目的蛋白高水平表达，表达蛋白的丰度可以
达到膜蛋白的 10%；此外，采用诱导表达启动子
可以在时间上严格控制目的蛋白的表达，如
GAL1-10 (半乳糖诱导)、PHO5 (胞外无机磷诱导)
和 HSE (37℃温度诱导)。正是由于有这些优点，
使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组
研究的前列。
由于生物基因功能进化上的保守性，使酵母
表达系统也可广泛用于研究其他生物系统功能基因
组的功能。譬如细菌(Morsomme 等 2002)、原生
动物(Bhattacharyya等2002; Burchmore等2003)、
真菌(Zwiers等 2003)、动物(Ton等 2002)和植物
(Minet等1992; Liang等1997)。
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2 酵母体系在真核生物功能基因组研究中的应用
2.1 表达异源蛋白 除了满足生化分析的材料要求
外，还可为目的蛋白功能研究提供直接试验依
据。酵母体系用于外源蛋白的表达源于20世纪80
年代，与细菌相比，酵母体系可以将表达的异源
蛋白(exogenous protein)定位到细胞内的膜结构上，
从而易于后期对蛋白生物化学活性进行分析。这
一技术对于用传统的生物化学技术很难分离的运输
蛋白和通道蛋白特别有效。例如，多重耐药性
(MDR multidrug resistance)基因最早发现于动物细
胞，它编码膜转运蛋白，介导脂溶性药物向膜外
的主动转运。拟南芥基因组编码多个与动物 MDR
同源的基因，其中 AtMDR1 突变体呈现为或显示
为生长素运输障碍表型。Noh 等(2001)将 AtMDR1
基因导入酵母表达载体(p426ADH)，并用这一研
究体系发现，酵母细胞表达的 AtMDR1 可以特异
性地与生长素运输抑制剂萘基邻氨甲酰苯甲酸
(NPA naphthylphalamic acid)结合，显示AtMDR1
可能通过与 NPA 的作用在生长素极性转运过程中
发挥调节作用。这一工作是对 AtMDR1 的功能研
究中的直接实验依据。
建立一个成功的异源酵母蛋白表达系统并不
是轻而易举的。由于酵母的糖基修饰机制和蛋白
分拣机制与植物细胞不同，如果某蛋白的糖基化
对其功能至关重要，那么采用酵母体系获得的此
种蛋白将会失去生物活性。另外，如果外源蛋白
在内质网中折叠较慢或发生折叠错误，合成的蛋
白将会在内质网内滞留，外源蛋白的累积可能会
对细胞产生毒性，从而导致细胞缓慢生长甚至死
亡。错误折叠的外源蛋白同时也会激活细胞的降
解机制，导致蛋白降解，在这种情况下，将很
难获得高表达量的蛋白质(Kauffman等 2002)。
2.2 新基因的克隆及其产物的亚细胞定位 由于某
些生化过程或代谢途径在进化上是高度保守的，
因此，用植物基因与特定的酵母突变体进行互补
试验，根据互补表型，采用一定的酵母突变体筛
选植物的不同 cDNA 文库，鉴定参与某一生化过
程或代谢途径的有关基因，这一方法已经广泛应
用于植物基因功能的研究。譬如，采用 K + 吸收
的酵母缺陷型突变体，在拟南芥中筛选到了 3 个
可能的编码K+ 转运蛋白的基因：AKT1 (Sentenac
等1992)、KAT1 (Anderson等1992)和HKT1 (Scha-
chtman和Schroeder 1994); KAT与AKT1序列相似
但非等位，而 HKT1 同 AKT1 和 KAT1 都没有相似
性。同样地，用酵母的 2 种不同氨基酸转运缺陷
突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等(1993)
和Hsu等(1993)成功地克隆到相应的编码相同氨基
酸透过酶的植物基因(NAT2/AAP1)，两者与酵母
的同源基因相比，在序列上虽毫无相似之处，但
它们编码的蛋白显然具有相同的运输功能。毫无
疑问，酵母细胞为研究这些转运蛋白的转运机制
提供了一个很好的研究体系。但是，我们应当意
识到，在植物细胞中，这些转运蛋白的活性可能
受到另外一些与酵母不同的蛋白因子调节，基因
的表达在时空上受到更加严格的调控，所以，这
就决定了它们功能上具有的一些与酵母不同的特异
性。另外，与酵母细胞不同，植物细胞具有发
达的内膜系统，植物转运蛋白除了主要分布在细
胞膜上以外，还有相当一部分蛋白分布在细胞内
部结构的膜系统上，当它们在酵母中表达时，这
些本来分布在内膜系统的蛋白就可能定位到酵母的
质膜上去。譬如，在酵母细胞中 EXO70P 分布在
细胞质膜上，我们采用绿色荧光蛋白(GFP)标记
拟南芥基因组中与酵母exo70p同源的AtExo70-20
蛋白时，发现该蛋白并没有分布在质膜上，而是
分布在核周质区域的膜结构上(未发表数据)。
2.3 同源基因的功能确定 除了采用酵母突变体在
植物中克隆具有特定功能的未知基因外，也可以
根据序列相似性，或用植物基因与相应的酵母功
能缺陷突变体互补，确定某一基因的生物功能。
很多植物蛋白能够和酵母突变体进行功能上的互
补，从而为未知功能基因的研究提供最初的实验
依据。酵母的互补试验是阐述这些基因功能的一
个有效手段。例如，根据序列相似性，人们克
隆到了与酵母 Nhx1 同源的拟南芥基因 AtNHX1
(Apse等1999; Gaxiola等1999)，该基因编码Na+/
H + 交换蛋白基因家族的一个成员。在酵母中，
Nhx1蛋白定位于原液泡区隔内(PVC prevacuolar
compartment)，它与 Na+ 介导的植物盐耐受性有
关。酵母互补实验证明 AtNHX1 cDNA 可以互补
酵母nhx1突变体的部分表型(Gaxiola等1999)，当
在拟南芥中过量表达 AtNHX1 时，转基因植物也
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会获得一定的耐盐性(Apse等1999)。此方法还成
功地用于分离拟南芥中参与笼形蛋白包被囊泡向液
泡转运有关的相关基因，或用来检测同源的拟南
芥基因功能。如Sar1p和Sec12p (参与ER-to-Golgi
转运途径，d’Enfert 等 1992)，Pep12p (SNAP 受
体蛋白，与细胞分泌过程中的膜融合有关)
(Bassham 等 1995)。
3 在酵母中表达的植物蛋白其分布和功能的可能
变化
在细胞中，一个成熟的蛋白要发挥功能，常
常是与其他蛋白相互作用的。与植物细胞相比，
酵母细胞具有特异的组织结构形式、蛋白分拣机
制和不同的生命活动调节方式。这些不同可能会
造成异源表达的蛋白在分布和功能上发生变化。
因此，如此之多的拟南芥基因能够成功地互补酵
母细胞突变体，不能不让人产生疑问，即仅用酵
母互补的数据来确定植物蛋白的功能，可能有些
草率。
事实上，越来越多的证据显示，在酵母和植
物细胞中，某些蛋白功能和亚细胞定位并不是对
应的。例如，采用酵母 vam3 突变体互补时，人
们已克隆到拟南芥AtVAM3基因(Sato等1997)。酵
母的 VAM3P 是一个 t-SNARE 蛋白，分布在液泡
膜上，介导转运囊泡与液泡膜的融合。拟南芥
AtVAM3最初认为分布在茎尖分生组织的液泡膜上
(Sato等1997)，但后来采用免疫电镜和梯度密度
离心分离细胞组分技术研究这一问题时发现，在
拟南芥的根和叶细胞中，AtVAM3 并没有分布在
液泡膜上，而是和 AtPEP12 一起分布在原液泡区
隔内。据此推测，拟南芥 AtVAM3 与酵母 VAM3P
不同，至少在根和叶中该蛋白参与从高尔基体反
式管网结构TGN (trans-Golgi network)到原液泡区
隔的囊泡转运过程，或者参与原液泡间的融合过
程，而与原液泡区隔到液泡的转运途径无关
(Sanderfoot等1999)。AtVAM3之所以能互补酵母
vam3，可能是 AtVAM3 在酵母细胞中表达会导致
异位表达的蛋白错误地定位到液泡膜上的缘故。
在研究植物细胞分泌过程中，人们还发现酵
母的一个基因常常与多个拟南芥基因相对应。如
酵母 V-SNARE 基因 VTI1，该基因在酵母基因组
中只有一个拷贝，但有报道认为VTI1蛋白具有多
重功能，参与多个转运途径中的囊泡融合过程。
酵母中已发现多个VTI1等位突变体，不同等位突
变只影响某一特异的转运途径，而对其他途径没
有影响。拟南芥基因组中有2个基因(AtVTI1a和
AtVTI1b)与酵母VTI1有关。以酵母所作的试验表
明，这2个基因编码的蛋白可以互补不同的VTI1
等位突变体，说明这 2 个植物蛋白被特异化为只
具有部分酵母Vti1p蛋白的功能，分别在2个不同
的转运途径中发挥作用(Zheng等1999b)。另外一
个例子是Vps45p蛋白(与 Sec1p蛋白相似)。在酵
母细胞中该蛋白参与 2 条通向液泡的转运途径：
羧肽酶 Y 途径和胞质到液泡途径。在羧肽酶 Y 途
径中，Vps45p 与原液泡t-SNARE Pep12p 蛋白作
用，参与源于反式高尔基网管结构(TGN)的转运
囊泡与原液泡区隔的融合；在胞质到液泡途径
中，该蛋白与反式高尔基网管结构中 t- S N A R E
Tlg2p蛋白作用，与此结构中的转运中间体形成有
关。现已查明，拟南芥 c D N A 编码的一个蛋白
AtVPS45与酵母 Vps45p具有高度的同源性，该蛋
白在酵母表达时可与 vps45 突变体缺陷表型互补
(Bassham和Raikhel 1998)。在拟南芥中还看到，
AtVPS45 只分布在反式高尔基管网结构中，只同
分布在这一结构上的 t-SNARE 蛋白发生作用，而
在原液泡区隔中没有分布，因此不可能与原液泡
区隔中tSNARE结合(Bassham和Raikhel 2000)。显
然，AtVPS45 在酵母细胞中表达时，也参与囊泡
和前液泡结构的融合过程，而在植物细胞中，这
一功能则由其他蛋白承担，但此种蛋白迄今尚未
发现。酵母 PEP 1 2 基因是另外一个例子，该基
因在拟南芥基因组中至少有3个与之序列非常相近
的基因：AtPEP12 (Bassham 等 1995)、AtVAM3
(Sato等1997)和AtPLP (Zheng等1999a)。这些不
同的基因是否有不同功能，或者这些基因的功能
是冗余的(redundant)，目前尚不清楚。但已有实
验显示，至少 AtPEP12 和 AtVAM3 在功能上并不
是冗余的。
尽管目前已经有了比较完善的酵母表达体
系，但仍有相当一部分异源蛋白在酵母表达时常
常不能得到理想的结果，甚至产生一些假象。例
如，采用酵母互补系统研究植物液泡膜受体的工
作并不容乐观，虽然早些时候发现植物VSRps-1 可
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以部分互补酵母vsp10p的表型(Humair等 2001)。
但最近有研究认为植物VSRs在酵母细胞中不能为
其蛋白分拣机制识别(Shimada等2003; Hernández
等 2005)。
4 结语
综上所述，酵母细胞有其特异性，所以不应
简单地认为植物细胞是绿色酵母细胞。当植物蛋
白在酵母体系中表达时，特别是采用多拷贝载体
在酵母中进行过量表达时，外源蛋白并不总是定
位在其应在的亚细胞结构上。植物蛋白在酵母表
达时的分布模式和功能并不总是反映其在植物细胞
中的真实情况，因此，仅仅依据酵母互补的实验
数据来确定植物蛋白在植物细胞中的定位和功能是
不够的。酵母互补试验只是基因功能研究的第一
步，要想得到科学的结论，还应当尽可能多的与
植物细胞的数据结合起来进行综合分析。采用酵
母表达系统研究植物基因的功能，虽然是植物功
能基因组学研究中的有效方法，但有其局限性。
本文列举的事例并不是想否定酵母试验的结果，
而是想提醒研究者应更全面的理解采用酵母这一表
达体系所获得的数据，以求能得出更为科学和可
靠的结论。
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