全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 851
拟南芥中PLC4 基因的超表达对花粉发育的影响
吕丽敏 孙春丽 王冬梅 潘延云*
河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000
提要 从 salk 库中取得 1 种 PLC4 基因突变体， PCR 检测表明其 T-DNA 插入位点比网上的位置有 235 bp 的偏差，在 PLC4
基因的 3 非翻译区，位点的插入造成该基因的超表达。表型分析表明，该突变株的花粉形态与野生型有差异。推测该基
因的超表达对花粉发育造成影响。
关键词 拟南芥；PLC4；花粉
Effects of PLC4 Overexpression on Pollen Development in Arabidopsis thaliana
LÜ Li-Min, SUN Chun-Li, WANG Dong-Mei, PAN Yan-Yun*
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071000, China
Abstract A PLC4 gene mutant was obtained from Salk Institute Genomic Analysis Laboratory. Insertion site of
T-DNA differed about 235 bp from that of Salk Laboratory by PCR, T-DNA inserted 3 UTR. This insertion site
resulted in PLC4 overexpression. Mutant pollen appeared morphologically unnormal compared with wide-type.
So we presumed that PLC4 overexpression affected pollen development.
Key words Arabidopsis thaliana; PLC4; pollen
收稿 2006-04-11 修定 　2006-08-21
资助 国家自然科学基金(30570993)。
*通讯作者(E-mail: panyanyun@263.net, Tel: 0312-
7528275)。
肌醇磷脂特异的磷脂酶C (phosphoinositide-
specific phospholipase C，PI-PLC，简称PLC)是
肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶。自1995年第
1个编码有功能的植物PLC 的 cDNA 在拟南芥中被
克隆(Yamamoto 等 1995)后，人们又在大豆、马
铃薯、烟草、水稻、番茄、豌豆和百合以及苔
藓植物等多个物种中克隆到 P L C 基因( S h i 等
1995；林芳等 2001；Mikami 等 2004；Pan 等
2005)。此种基因在植物对外界刺激如渗透胁迫、
A B A 、光、重力、病原侵染、授粉以及缺氧等
的应答反应和生理活动中起作用(Legendre 等
1993；Munnik等 1998；Perera等 1999；Staxén 等
1999；Stevenson 等 2000；Reggiani 和 Laoreti
2000；Kim 和 Huang 2004)。
PLC 在动植物细胞中都是以多基因家族的形
式存在。Lin等(2004)的实验表明，拟南芥基因组
中 PLC 和 PLC 基因亚型有 17 种，他们用基因芯
片的方法对各种亚型作了高通量分析的结果表
明，多数 PLC 亚型在叶中呈高水平表达，还有
些亚型分别在花、茎等组织中表达量占优势，一
些亚型在不同激素处理和逆境条件下表达量有明显
变化。说明不同亚型的 PLC 可能参与不同的生理
过程。Hunt等(2004)用转基因的方法检测4种PLC
亚型的组织水平表达特征，也证实不同亚型的组
织特异性表达各具特点。但究竟是哪些亚型参与
花粉的发育及其萌发生长的生理过程，仍属未
知。
花粉发育及其萌发和生长是植物有性生殖发
育的重要事件之一。从 1987 年开始，有关 PLC
可能参与调节花粉管萌发和生长的报道时有出现，
从而为 PLC 可能参与花粉萌发和伸长生长的生理
过程提供了药物学和初步的分子生物学证据，但
这些证据依然不能断定 PLC 中哪个或哪些亚型在
起作用，所以也难以深入研究 PLC 参与调节花粉
萌发的分子机制和信号转导途径。我们以拟南芥
基因突变体为材料，用反向遗传学的方法，试图
确定与花粉发育及生长相关的 PLC 亚型，以期能
为 PLC 参与这一生理过程的功能提供活体证据。
材料与方法
野生型和突变体拟南芥(Arabidopsis thaliana)
均为Columbia生态型，PLC4突变体来自Salk In-
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stitute Genomic Analysis Laboratory。小量胶回收
试剂盒、小量 RNA 提取试剂盒购自上海华舜生物
公司，Taq DNA 酶购自天为时代生物公司，相
关限制酶为宝生物工程(大连)有限公司产品。
拟南芥种子经深层(10%次氯酸钠浸泡5 min，
无菌水洗 3 次)消毒后，播种在固体 MS 培养基上
(3% 蔗糖、0.8% 琼脂粉，pH 5.8)上，置 4℃低
温暗中培养3 d后，转到光照培养箱(22℃，每天
光照16 h，光照强度为130 mmol·m-2·s-1)中培养。
10~14 d 后幼苗长出 2~4 片真叶时，移栽到浸透
Hoagland营养液的蛭石中，于前述相同温度和光
照条件下继续培养，每周浇灌1次 Hoagland营养
液。
基因组DNA小量提取参照的方法(Edwards等
1991)有改动。
引物设计用http://signal.salk.edu/网站上提供
的插入位点(图1)相邻的旁侧序列，然后用Omiga
软件与该基因比对找到突变基因的 T-DNA 插入位
点，分别在插入位点上下游设计引物 1、2 及引
物LBb1，用 PCR 的方法鉴定突变体。引物 1: 5
CCCGAGTAAATTCCTCCAAC 3；引物 2: 5
G TG A AA C CG C AT G AG A AG T G 3；LBb 1: 5
AGT TGCA GCAAG CGGT CCAC GC 3 。经过 PCR
鉴定发现网上提供的插入位点有误，找出 T-DNA
的正确插入位点后设计引物3 (图3)，引物3: 5
TGCATCAAAACTTCTTTTAGAGG 3，并用它与
上述引物 1 及引物 LBb 1 重新鉴定突变纯合体。
PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃
45 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 10 min。
确定 PLC4 基因 T-DNA 插入位点时以LBb1 为
测序引物，将 LBb1 和引物 1 通过 PCR 扩增出的
条带进行序列测定，测得的序列用 Omiga 软件与
PLC4 基因序列比对，从而找出正确的插入位点。
RN A 提取用上海生工的小量 RN A 提取试剂
盒；RT-PCR 采用 Invitrogen 公司产品。RT-PCR
反应用引物4、5。引物 4: 5 GCTCTAGAATGGG-
GAGTTACAAAATGGG 3 ；引物 5: 5 CGGGAT-
CCCAAGAAAGTGAAACCGCATG 3，预计扩增
片段为1.7 kb。
观察 PLC4 基因突变体花粉表型，取当天盛
开的花约50 朵放入 1.5 mL 离心管，加入700 mL
BK 萌发液，漩涡震荡、离心收集花粉，用 25 mL
培养液悬浮花粉粒(Fan 等 2001)。光学显微镜
(Nikon)观察。
结果与讨论
1 PLC4 突变体 T-DNA 为 3 非翻译区(3 UTR)单
拷贝插入
Salk Institute Genomic Analysis Laboratory提
供的 PLC4基因 T-DNA插入位点是在第8外显子上
(图 1)。根据这个位置设计引物1、2进行 PCR 扩
增，引物 1、2 扩增片段预期为 800 bp，与实际
扩增的条带分子量相符(图2，1号泳道); 而LBb1
和引物 1扩增的片段预期为780 bp，实际却扩出
1 000 bp左右的条带(图2，2号泳道)。这一结果
表明，实际的插入位点比预期约有 200 bp 的偏
差。电泳条带回收后测序，用 Omiga 生物学分析
软件与 PLC4 基因序列进行比对的结果显示，T-
DNA 插入位点在 PLC4 基因的 3 UTR (图 3)。根
据该位点重新设计引物3，结合引物1和 LBb1 进
行 PCR 鉴定的结果表明，若 2 条染色体链的目的
图1 拟南芥PLC4基因突变体中T-DNA插入的位置
Fig.1 Location of T-DNA insertion in AtPLC4 mutant
根据http://signal.salk.edu/ 提供信息绘制。
图2 按照网上的插入位点设计引物
进行 PCR 扩增后的电泳图谱
Fig.2 T-DNA insertion site detection by
PCR with the primers
　　1 ：引物 1 、2 扩增的条带；2 ：引物 1 、L B b 1 扩增的
条带；3 ：D N A 分子量标记。
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基因都有T-DNA 的插入(即突变纯合体)，则只有
引物1和 LBb1可扩增出1个条带，预计分子量为
1 015 bp，引物 1、3 不能扩增出条带；若只有
1 条链上有 T-DNA 插入，即杂合体植株，那么引
物 1、3 也会有条带扩出，预计分子量为 1 11 9
bp。野生型植株因为没有 T-DNA 插入，所以只
有引物 1、3 能够扩出条带。鉴定结果分别得到
了 3 种类型的植株，如图 4 所示。
将鉴定好的纯合体、杂合体和野生型的种子
分别挑放在MS (Kan+)的平板上，见到的纯合体均
为抗 Kan 的绿色苗，野生型均为黄色苗，而杂合
体的平板上绿苗数为 362 株、黄苗为 119 株，二
者的比例为 3:1，说明该突变株为单拷贝插入。
2 PLC4 突变体为PLC4 基因超表达体
PLC4为花粉特异表达的基因(Hunt等 2004)。
我们用RT-PCR的方法分别检测野生型和突变体花
粉中该基因表达的结果显示，野生型拟南芥的花
粉中，该基因的表达量非常低，而突变体中表达
量明显高于野生型(图 5)。说明 T-DNA 的插入影
响了PLC4 突变体的基因表达，它在 3 UTR 的插
入，不仅没有破坏目的基因的表达，反而使得这
个基因表达水平增强。动物细胞中研究3 UTR的
结果表明，该区域的 AU 富含单元(A、U 含量高
达72%)对基因有负调控的作用(戴冰冰等2003) 。
另有研究表明，AU 富含单元能够调节 mRNA 的稳
定性及控制其正确定位(Julie等2000); Veyrune 等
(1996)也报道AUUUA序列是存在于3 UTR内的关
键定位信号。PLC4 基因的 3 UTR 也存在 AU富含
单元，全区域 A、U 含量达 74%。因此推测，该
PLC4 基因亚型也可能存在 3 UTR 的负调控，而
T-DNA 的插入则破坏了这种负调控，所以该基因
的表达水平提高。
3 PLC4突变体中部分花粉呈现败育状态
以野生型为对照，分别观察 PLC4 突变体和
图3 拟南芥PLC4基因突变体中T-DNA
插入的位置(在3 UTR处)
Fig.3 Location of T-DNA insertion in AtPLC4 mutant
图4 PLC4基因突变纯合体鉴定的电泳图谱
Fig.4 Identification of PLC4 gene T-DNA
insertion mutant by PCR
　　1 ：杂合体；2 、4 、5 ：突变纯合体；3 ：筛出的野
生型；6 ：野生型对照；M ：D N A 分子量标记。泳道 a ：
引物 1、3 扩增的条带；泳道 b：引物 1 与 LBb1 扩增的条带。
图5 突变体花粉和野生型花粉中PLC4
基因的 RT-PCR 检测
Fig.5 Identification of PLC4 gene transcript in homozygous
mutant and WT plants by RT-PCR
　　1：野生型花粉；2：突变体花粉；3：野生型的 ac t i n
对照；4 ：突变体的 a c t i n 对照；M ：D N A 分子量标记。
图6 显微镜下花粉形态
Fig.6 Morphology of mature pollen
　　a ：野生型花粉粒；b ：突变体花粉粒。箭头所指为变
形的花粉。
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野生型花粉粒状态的结果显示，野生型成熟花粉
饱满，而突变体的花粉粒中有一部分干瘪和变形
(图 6)。变形的花粉占 10%，说明该基因表达水
平有变化，这一变化会影响花粉的正常发育过
程。至于它影响花粉发育的作用机制和信号途
径，还有待进一步探讨。
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