全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 891
麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析
秦小波, 邵彩霞, 徐莺 *, 陈放
四川大学生命科学学院, 成都 610064
提要: 目前, 麻疯树核糖体失活蛋白已发现2种: 种子中的毒蛋白curcin和叶片中的逆境诱导蛋白curcin-L, 其基因的表达模
式均呈现出器官特异性。mRNA和蛋白质水平分析显示, curcin只在种子的胚乳中积累, 且表达开始于心型胚时期, 成熟时
达到最高; 而 curcin-L在正常生理条件下并不表达, 但受脱落酸、水杨酸、干旱、高低温等胁迫诱导时仅在叶片中表达。
关键词: 麻疯树; 核糖体失活蛋白; 胁迫; 表达模式
Analysis on the Expression Patterns of Two Ribosome Inactivating Proteins
from Jatropha curcas L.
QIN Xiao-Bo, SHAO Cai-Xia, XU Ying*, CHEN Fang
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
Abstract: So far, two types of ribosome inactivating proteins (RIPs) have been found in Jatropha curcas, one
is curcin in seeds, and the other is curcin-L in leaves. The results showed that the character of their genes’
expression pattern was organ-specific. Analysis on the levels of mRNAs and proteins showed that, curcin only
expressed and accumulated in endosperm of Jatropha curcas from heart-shape embryo period to mature embryo
period. Curcin-L didn’t express under common physiological conditions. However, it could be induced in leaves
by abscisic acid, salicylic acid, drought, high or low temperature and so on.
Key word: Jatropha curcas; ribosome inactivating protein; stress; expression pattern
收稿 2008-05-29 修定 2008-08-06
资助 国家自然科学基金(30 6 70 2 0 4)、国际科学技术合作项
目(2004DFB00300、2006DFB63400)和教育部科技重
点项目(1 0 4 1 5 1 )。
* 通讯作者(E-ma il : qxb_ 2 0 0 3 @1 6 3 .com; T el: 0 2 8 -
8 5 4 1 7 2 8 1 )。
大多数核糖体失活蛋白(RIPs)在不同时期内积
累。例如: 蓖麻毒蛋白(ricin)及其基因转录物在种
子成熟晚期外种皮形成时积累(Chamberland等
1992); 苜蓿素(tricin)和大麦RIP的基因转录物在种
子发育的后 III期积累(Leah等 1991; Massiah和
Hartley 1995)。在上述基因的上游, 对控制器官特
异性表达的假定元件已有描述, 但其调控机制在分
子基础上的细节仍然未知。
某些物种中, RIPs的表达和积累会受到生物和
非生物胁迫以及信号分子的影响。比如: 在沙盒树
(Hura crepitans)及美洲商陆(Phytolacca americana)
叶片中, 经热处理和渗透压胁迫后, RIPs的活性增
强到原来的 15倍(Stirpe等 1996); 在分离的幼嫩
大麦叶片中, 植物信号分子茉莉酮酸甲酯介导
JIP60 (一种 III型 RIP)的合成, 并与抑制因子脱落
酸协同作用(C ha udhr y等 1 99 4) ; 在盐生冰草
(Mesembranthamum crystallinum)中, 盐分也介导了 I
型 RIP 的表达。
在麻疯树中, 已发现的RIPs有 2种: 一种是种
子中的毒蛋白 curcin; 一种是叶片中的逆境诱导蛋
白 curcin-L。curcin是在麻疯树中最早发现的核糖
体失活蛋白, 发现之初是一种粗蛋白, 纯化后可得
到几种分离峰产物, 其中有活性的产物被命名为
curcin1 (Stirpe等 1976), 现在所指的 curcin即等同
于以前的 curcin1。curcin-L原名 JFIP, 是本实验
室魏琴等人用真菌诱导麻疯树叶片时发现的。根
据魏琴(2004)的研究, curcin-L cDNA和 curcin
cDNA有 92%同源性, 编码氨基酸 87%相同, 5%
相似, 其ORF范围有 40个氨基酸不同, 且 curcin-
L比 curcin多 16个氨基酸。
基于上述核糖体失活蛋白表达和积累的特点,
本文选取不同时期的麻疯树种子胚乳和6种胁迫条
件诱导的麻疯树植株, 研究麻疯树核糖体失活蛋白
curcin和 curcin-L的表达模式, 揭示其在麻疯树生
长发育中的作用。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月892
材料与方法
麻疯树(Jatropha curcas L.)心型胚、半子叶
胚和成熟胚等不同时期的种子采自四川省攀枝花地
区。植株由成熟种子于温室(33 ℃)萌发、生长 2
月后得来。
植株在设计好的 6种条件下进行诱导。用 15
mmol·L-1脱落酸(ABA)、1.0 mmol·L-1水杨酸(SA)、
30%聚乙二醇6000 (PEG6000)分别浇灌植株, 使其
根部保持在相应浓度溶液下 48 h。此外, 将植株
分别置于 4 ℃和 45 ℃下 48 h或 250 W紫外灯照
射下 36 h。
将诱导后的各植株分别取其根、茎和叶, 在
液氮中研磨成粉末状物质, 用 QIA GEN公司的
RNA提取试剂盒提取各组织的RNA。将从原产地
用液氮冷冻带回的不同时期的种子或子房也按相同
方法提取 RNA。RNA浓缩: 加入 1/10体积NaAc
(pH 5.6), 摇匀后置于-20 ℃下3 h或更长时间以沉
淀RNA; 2 ℃, 12 000×g离心10 min, 70%乙醇洗涤
沉淀2次, 晾干除去乙醇; 沉淀溶解于适量的DEPC
水中于 -20 ℃中保存。
根据实验室提交的 curcin的 DNA全长序列
(AF469003), 设计其特异引物P1: 5 -GCC AAA GTC
ATA AAT GTA GCG AAT T-3 和P2: 5 -CAA CAA
GAC TCC CAT GAC ACC TGC-3 。同时, 根据
curcin-L的 cDNA序列(AY435214), 设计其特异引
物P3: 5 -GGA TCC ATG GCT GGT TCC ACT CCA
ACT TT-3 和P4: 5 -GAG CTC ATA CAT TGG AAA
GAT GAG GA-3 。利用DIG PCR探针合成试剂
盒合成 curcin与 curcin-L的特异性DIG杂交探针。
RNA变性反应体系: RNA (多达20 µg) 2 µL, 10×MOPS
缓冲液[0.2 mol·L-1 MOPS (pH 7.0), 20 mmol·L-1乙酸
钠, 10 mmol·L-1 EDTA, pH 8.0] 2 µL, 甲醛 4 µL, 甲
酰胺 10 µL, 溴化乙锭(200 mg·µL-1) 1 µL。置于一
离心管中盖紧, 于 55 ℃温育 RNA液体 60 min, 在
冰水中冷却样品 10 min, 然后离心 5 s使得管内所
有液体集中于离心管底部。将变性RNA样品上样
于 1.5%的甲醛变性胶(以 100 mL标准, 将 1.5 g琼
脂糖加入 72 mL无菌水中 100 ℃溶解, 降温至 55 ℃
时加入10 mL 10×MOPS和18 mL去离子甲醛)上, 4~5
V·cm-1电压下电泳分离, 再转移到尼龙膜上固定
(Sambrook和Russell 2001)。采用地高辛标记和检测
试剂盒进行杂交和显色处理, 按照操作说明操作。
总蛋白提取参照谷瑞升等(1999)文中改良的丙
酮沉降提取法。总蛋白沉淀加250 µL上样缓冲液,
样品沸水浴 5 min后, 取 35 µL上样于 12%的变性
聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳胶, 按Laemmli (1970)
方法进行电泳和分子量计算。按 Bradford (1970)
的方法测样品的蛋白质总浓度。
抗原(curcin)参照林娟等(2002)文中的方法纯
化。用 5 mmol·L-1 PBS (含 0.5 mol·L-1 NaCl, pH 7.2)
从种子中提取粗蛋白质溶液。经分子筛 Sephadex
G-75 (φ 6 cm×90 cm)层析柱分离纯化, 12%的SDS-
PAGE分离得纯蛋白。2 mg的纯蛋白进行第 1次
皮下免疫注射。4周后, 1 mg的纯蛋白进行第 2次
加强免疫注射。6周后, 1 mg的纯蛋白进行第 3次
加强免疫注射。第 7周, 收集抗血清。抗血清按
修改的 ELISA法(Ansubel 1998)检测滴度。10
mg·L-1的毒蛋白溶解在 50 mmol·L-1 Na2CO3和
NaHCO3缓冲液(pH 9.6)中, 室温温育 24 h。用TTBS
(0.1% Tween 20, 0.9% NaCl, 100 mmol·L-1 Tris-HCl,
3% BSA)冲洗, 不同稀释度(1:400~1:51 200)的抗血
清用 TTBS缓冲液稀释, 山羊抗兔 IgG-AP (Sino-
American)用 TTBS以 1:1 000稀释。底物溶液为
3 mmol·L-1 NPP, 50 mmol·L-1 Na2CO3, 50 µmol·L-1
MgCl2。用 1 mol·L-1 NaOH终止反应。测定 405
nm的吸光值。测定结果取 4 次重复的平均值。
(待测血清 A405- 空白对照 A405)/(阴性对照 A405- 空
白对照A405)≥2.1判定为阳性反应, 反之为阴性反
应。
经胁迫诱导处理的根、茎、叶、相应的蛋
白质成分、种子的粗蛋白液及未处理对照在 12%
的 SDS-PAGE上分离, 按 Towbin法(Ansubel 1998)
进行抗体结合和酶显色反应。一抗为 curcin的抗
血清, 工作浓度为1:1 000; 二抗为碱性磷酸酯酶(AP)
偶联的山羊抗兔 IgG, 工作浓度为1:1 000, AP的反
应底物为氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-
吲哚磷酸甲苯胺蓝(BCIP)。
结果与讨论
1 麻疯树RNA的提取与纯度检测
从麻疯树组织中提取的RNA溶于DEPC处理
水中, 经测定其含量可达到500 ng·µL-1, OD260/OD280
比值为1.97。通过琼脂糖凝胶电泳分析, 所得RNA
符合实验要求(图 1)。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 893
2 种子不同发育时期 curcin和 curcin-L的表达情况
种子的形成过程伴随着细胞的分裂和分化, 涉
及到很多与发育时期相关的信号调控及各种基因的
开关, 因此有必要研究不同发育时期对 curcin和
curcin-L的表达造成的影响。
分别将curcin和curcin-L的特异性探针与不同
时期的种子或子房中的RNA进行杂交后, 发现只有
curcin的特异性探针与 RNA产生了杂交反应。如
图 2所示, 杂交条带在心型胚时期开始出现, 条带
强度逐渐加强, 在成熟胚时期最显著。这表明
curcin从心型胚时期开始表达, 其表达量随着时间
推移不断增加, 在成熟胚时期达到最高值。从图 2
右侧的柱状图还可以看出, 以 18S rRNA的表达量
作为参照, curcin的表达量明显低于 18S rRNA。
上述结果中, curcin-L不能在种子中表达, 但
curcin可以在种子中表达, 且受种子不同发育时期
的影响。这说明两种蛋白在麻疯树中可能具有不
同的作用。种子胚乳是提供营养的组织, curcin在
胚乳中的表达可能作为储存蛋白为种子提供营养。
同时, 作为一种有毒性的蛋白, 它还可能具有防止
种子被动物吞食的功能。要进一步分析 curcin在
种子发育中的作用以及更深入地研究发育时期对其
诱导的影响, 需要扩大时间范围、采集更多时期的
种子。同时, 还可以增加不同花期的材料进行研
究。但对于花等器官组织, 要取其各时期的样本,
目前还存在取材上的困难。
3 不同胁迫诱导下 curcin和 curcin-L的表达情况
许多研究表明, 植物胁迫诱导表达的蛋白, 如
蛋白激酶、转录因子、磷脂酶等, 是通过参与到
植物胁迫信号转导途径, 或通过调节其他效应分子
的表达和活性而起作用的(Shinozaki和Yamaguchi-
shinozaki 1997)。因此我们设计了 6种不同的胁迫
和诱导处理, 从激素诱导、干旱胁迫、低高温胁
迫和紫外损伤几方面研究麻疯树核糖体失活蛋白在
体内的表达情况。在ABA、SA和 PEG的浓度上
参考了以前的相应的浓度梯度实验和相关研究(崔
婧 2007; 万正林和罗庆熙 2007; 魏琴 2004)。在处
理时间上, 由于有研究表明较短的UV-B辐射可以
促进某些蛋白的合成(Cambell等1998), 因此在其他
条件均处理 48 h的情况下, 紫外线照射仅使用 36
h。总体上, 本实验所设计的条件弥补了之前研究
中条件设计的空白。
图 2 Northern杂交分析种子不同时期 curcin基因的表达
Fig.2 Northern blot analysis of the curcin gene expression in endosperm
每个泳道上样 20 µg总 RNA, 最下面用各样品中的 18S rRNA作表达量参照。1: 上样 RNA提取于心型胚期的子房; 2: 上样 RNA
提取于半子叶胚期的种子胚乳; 3: 上样 RNA提取于成熟胚期的种子胚乳。
图 1 麻疯树RNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 The electropherogram of total mRNAs from
Jatropha curcas
1: RNA提取于麻疯树根; 2: RNA提取于麻疯树茎; 3: RNA
提取于麻疯树叶。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月894
对处理后的植株, 仍然用 curcin和 curcin-L的
特异性探针对根、茎、叶组织中的 RNA进行检
测, 并用 18S rRNA作为参照。我们发现, curcin
的特异性探针与所检测的各组织中的RNA均未产
生杂交反应, 而 curcin-L的特异性探针与被诱导的
麻疯树苗叶片中的 RNA产生了杂交反应。如图 3
所示, 经过 30% PEG6000诱导的麻疯树苗, 其叶片
中mRNA杂交得到的条带最明显; 而经过紫外线照
射的麻疯树苗, 其叶片中mRNA杂交得到的条带最
弱; 其余4种条件处理的麻疯树苗, 其叶片中mRNA
杂交得到的条带弱于 30% PEG6000, 强于紫外线
照射, 且清晰可见。
图 3 不同诱导下 curcin-L基因表达的Northern杂交分析
Fig.3 Northern blot analysis of the curcin-L gene expression under different stress
每个泳道上样 20 µg总 RNA, 最下面用各样品中的 18S rRNA作表达量参照。1: 上样 RNA提取于经 15 mmol·L-1 ABA诱导的麻
疯树苗各组织; 2: 上样 RNA提取于经 1.0 mmol·L-1 SA诱导的麻疯树苗各组织; 3: 上样 RNA提取于经 30% PEG6000诱导的麻疯树苗
各组织; 4: 上样 RNA提取于经 4 ℃低温诱导的麻疯树苗各组织; 5: 上样 RNA提取于经 45 ℃高温诱导的麻疯树苗各组织; 6: 上样 RNA
提取于经紫外线诱导的麻疯树苗各组织; 7 : 上样 RNA提取于未经诱导的麻疯树苗各组织。
上述结果中, curcin-L对PEG干旱胁迫最敏感,
可能与其生长在干热环境有关。它对ABA和SA的
反应可能与其作为病程相关蛋白(PRs)有关(Lo等
1999), 有报道指出ABA在生物体内最主要的功能
是其作为胁迫激素参与了植物对外界胁迫条件的适
应。而外源 SA可诱发烟草、黄瓜、马铃薯、菜
豆、豇豆、水稻和拟南芥等多种植物积累病程相
关蛋白(PRs), 并产生对真菌、细菌、病毒等多种
病原物的抗性(Malamy等 1990)。curcin-L对高、
低温诱导的反应表明它可能是一种抗逆蛋白。有
研究显示对拟南芥、油菜和菠菜等植物, 低温能使
其基因表达发生改变并合成新的蛋白质(刘祖棋和
王洪春 1989), 而高温引起其体内信号分子浓度变
化从而诱导蛋白的产生(王利军和黄卫东 2000)。
curcin-L对紫外线辐射的反应虽然很弱, 诱导的表
达水平很低, 但对于麻疯树, 首次引入紫外线辐射
作为胁迫因子(Zhang等 2005)进行诱导, 为研究疯
树核糖体失活蛋白的抗逆机制提供了新的内容, 但
其作用机理有待进一步研究。
4 不同胁迫诱导下麻疯树RIPs在蛋白水平的表达
蛋白质分析发现, 根、茎中的总蛋白样品没
有发生免疫杂交反应, 而叶片、种子中均有免疫杂
交反应。如图4蛋白质电泳和Western杂交分析所
示, 经激素和 PEG诱导后的植株, 其叶片蛋白中都
显示出两条蛋白杂交带, 分子量分别约为32 kDa和
65 kDa。而高、低温和紫外辐射诱导后的植株,
其叶片蛋白中仅显示出一条蛋白杂交带, 分子量约
为32 kDa。种子蛋白中也仅显示出一条杂交带, 分
子量约为 29 kDa。从分子量大小分析, 32 kDa与
curcin-L的分子量相近, 29 kDa与 curcin的分子量
相近。这就揭示了 curcin-L是叶片专一性的, 且需
要诱导信号的诱导才能表达, 而 curcin是胚乳专一
性的。对于 65 kDa大小的条带, 可能的一种解释
是形成了二聚体。
结果表明, 两种核糖体失活蛋白的表达在组织
上是分隔的 , 且在诱导的信号上也是不同的。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 895
curcin是在种子中表达的, 且受种子不同发育时期
的信号诱导, 反映了它在麻疯树中的作用很可能与
种子的养料和保护相关。而 curcin-L是在叶片中
表达的, 但需要诱导条件的作用, 例如本实验中所
设计的6种诱导条件, 则反映了它可能与麻疯树的
抗逆性有关, 可能是植物防御反应的一种表现(Lo
等 1999)。
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图 4 麻疯树核糖体失活蛋白在蛋白水平的表达分析
Fig.4 The expression analysis of the RIPs on protein level from Jatropha curcas
a: SDS-PAGE电泳图; b: Western杂交。蛋白样品提取于 1: 经 15 mmol·L-1 ABA诱导的麻疯树苗叶片; 2: 经 1.0 mmol·L-1 SA诱
导的麻疯树苗叶片; 3: 经 30% PEG6000诱导的麻疯树苗叶片; 4: 经 4 ℃低温诱导的麻疯树苗叶片; 5: 经 45 ℃高温诱导的麻疯树苗叶
片; 6 : 经紫外线诱导的麻疯树苗叶片; 7 : 麻疯树成熟种子; 8 : 未经诱导的麻疯树苗叶片。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月896
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