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愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进



全 文 :植物生理学通讯 第 44卷 第 2期,2008年 4月 323
愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进
李忠光 *,龚明
云南师范大学生命科学学院,昆明 650092
收稿 2007-12-26 修定 2008-02-13
资助 云南师范大学综合性、设计性实验研究项目。
* E -ma i l:z h on g g u a n g _ l i @1 6 3 . co m;T e l:0 8 7 1 -
5517394
“过氧化物酶活性的测定”是植物生理学呼
吸作用一章中必做的实验内容,其目的是让学生
掌握愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的原理和
方法,了解过氧化物酶在植物生长发育和抵抗不
良环境中的作用。但是,在教学中,我们发现
按照几种植物生理学实验指导书中的方法(白宝璋
和汤学军 1993;高俊风 2006;王学奎 2006)测定
的植物过氧化物酶活性明显偏低。因此我们进行
了如下的探讨和改进,与广大同行共切磋。
1 酸对过氧化物酶酶促反应的终止效应
一般的植物生理学实验指导书中的过氧化物
酶活性测定常用三氯乙酸(TCA)或偏磷酸(HPO3)n
终止酶促反应(白宝璋和汤学军 1 9 9 3;高俊风
2006;王学奎 2006),我们发现这两种酸终止的
光密度 A470都显著降低(表 1)。为了寻找合适的可
用于终止反应的酸,在反应启动后 3.5 min (即向
反应体系加入酶液 3.5 min后),除立即用 TCA或
(HPO3)n以外,我们还用H2SO4、HCl和H3PO4终
止反应,与加酸前的对照(即反应 3.5 min时的A470
值)相比,其 A470值有不同程度的降低(表 1),加
酸后由于稀释的原因 A470的影响已经作了折算。
说明在植物过氧化物酶活性的测定中,用酸终止
反应是不适合的,否则测得的值即明显偏低,其
原因可能是反应产物 4-邻甲氧基苯酚在酸性环境
中不稳定造成。这些结果表明一些实验指导书中
用 TCA或(HPO3)n,以及H2SO4、HCl和H3PO4终
止反应值得商榷。
2 过氧化物酶酶促动力学
由于以酸终止酶促反应实验结果明显偏低,
为了更准确地测定植物过氧化物酶活性,我们以
愈创木酚为底物,反应体系中加入酶液后,每 30
s测定A470的增加值(即产物4-邻甲氧基苯酚形成的
量)代表植物过氧化物酶活性的大小,以时间对
∆A470 作图,得到过氧化物酶酶促动力学曲线(图
1)。显示,在 0~3.5 min内,随着酶促反应时间
的增加,A470也随之增加,表现出较好的线性关
系,符合比耳定律(A=KLC)的条件。但是,当反
应时间超过 3.5 min后,反应速度明显降低,不
符合比耳定律。所以在过氧化物酶活性的测定
中,如果反应超过 3.5 min,必然导致实验结果
不同程度的偏低,说服力不强。因此,我们认
为应该以反应 3 min计算酶活性。
表 1 不同酸终止酶促反应对光密度的影响
加入的酸 A470
对照 0.625±0.016
TCA 0.369±0.010
(HPO3)n 0.387±0.012
H2SO4 0.344±0.011
HCl 0.350±0.014
H3PO4 0.381±0.013
  表中数据为至少 3 次重复的平均值 ± 标准误。
图 1 过氧化物酶反应动力学曲线
3 两种测定植物过氧化物酶活性方法的比较
为了检验“反应动力学法”测定植物过氧化
物酶活性的有效性和可行性,我们以实验指导书
中所用的实验材料马铃薯块茎和小麦根系为材料,
与实验指导书中的“酸终止法”比较两种方法的
结果(表 2)表明,按照实验指导书中“酸终止法”
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测出的过氧化物酶活性明显低于“反应动力学
法”。
综上所述,我们认为,在植物过氧化物酶活
性的测定中,不能用TCA或(HPO3)n,以及H2SO4、
HCl和H3PO4终止反应,否则其结果即会偏低;用
“反应动力学法”,其反应时间 0.5~3.5 min的 A470
值计算酶活性,这样的结果会更加准确。
参考文献
白宝璋, 汤学军(1993). 植物生理学测试技术. 北京: 科学技术出
版社, 148~149
高俊风(2 00 6) . 植物生理学实验指导. 北京: 高等教育出版社,
217~218
王学奎(2006). 植物生理生化实验原理和技术. 第 2版. 北京: 高
等教育出版社, 167~168
表 2 两种测定植物过氧化物酶活性方法的比较
  
实验材料
过氧化物酶活性 /U·g-1 (FW)  
酸终止法             
反应动力学法
                  TCA              (HPO3)n
马铃薯块茎 491.28±12.23 514.56±15.43 831.67±18.30
小麦根系 531.45±16.45 553.60± 9.50 894.23±21.62
  表中数据为至少 3 次重复的平均值 ± 标准误。