全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 285
聚乙二醇模拟水分胁迫筛选拟南芥突变体的新方法
张依章1,2 王幼宁1 张文胜1 李科学 1 刘孟雨1 李霞1,*
1 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，石家庄 050021；2 中国科学院研究生院，北京 100039
New Methods for Selection of Arabidopsis Mutants under Polyethylene Glycol
Simulated Water Stress
ZHANG Yi-Zhang1,2, WANG You-Ning1, ZHANG Wen-Sheng1, LI Ke-Xue1, LIU Meng-Yu1, LI Xia1,*
1Research Center of Agricultural Resources, Institute of Genetic and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,
Shijiazhuang 050021, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China
提要 在以聚乙二醇(PEG)模拟水分胁迫的条件下，分别在拟南芥种子萌发期和幼苗期以 25% 和 30% 为选择浓度，根据
种子是否萌发和幼苗能否存活为指标，筛选拟南芥抗水分胁迫突变体。此法操作简单，方便快捷，特别适合实验室进行
大规模筛选。我们用这种方法筛选了 T-DNA 插入的拟南芥突变体库，得到 78 株可能是拟南芥抗水分胁迫的突变体。
关键词 聚乙二醇；拟南芥；突变体；筛选；水分胁迫
收稿 2005-07-18 修定　 2005-11-21
资助 中国科学院“百人计划”基金和中国欧盟合作项目
(ICA4-CT-2002-10004)。
*通讯作者(E-mail: xli@genetics.ac.cn，Tel: 0311-85871744)。
植物在生长发育过程中，经常会遇到渗透胁
迫，例如水分胁迫、高盐胁迫。水分胁迫是一
种最普遍的影响作物生产力的环境胁迫，长期以
来，人们一直想通过揭示水分胁迫的伤害机理，
寻找提高植物抗胁迫能力的途径(张立军等2004；
王伟1998)。植物对水分胁迫的反应在许多物种上
都有研究，但对其中的分子机制了解较少，利用
模式植物拟南芥进行研究直到近几年才开始(Van
der Weele等 2000；Zhu 2002)。发现和克隆与水
分胁迫信号转导相关的组分是探索其分子机制的首
要条件。因此筛选与水分胁迫相关的拟南芥突变
体并对其进行研究无疑是重要的。目前，针对这
方面的研究较少，其中一个重要原因就是缺少简
单、快捷、适合实验室大规模筛选的方法。Van
der Weele等(2000)报道聚乙二醇(polyethylene glycol,
PEG)达到一定浓度后，便不能与琼脂凝固，所以
采用 PEG 渗透营养培养基以降低水势。此法主要
是将PEG溶液倒在凝固的MS培养基上，平衡24 h，
倾去剩余的 P E G 溶液。采用这种方法，苗期转
苗和倒去的剩余 P E G 溶液这两步都容易造成污
染，而且操作也比较繁琐，难以用于大批量的实
验室筛选。Verslues和Bray (2004)报道了两步筛
选法：先将来自番茄受ABA和胁迫诱导的le25启
动子以及受它调控的ADH 编码区，转化到adh- 的
拟南芥生态型bensheim上。在-1.2 MPa的低水势
下，le25:ADH植株对1.2 mol·L-1的烯丙基乙醇相
当敏感，ADH 代谢烯丙基乙醇会产生致死性的植
物毒素化合物丙烯醛；然后，对存活的植株再根
据脯氨酸含量变化进行二次筛选。此法需要经过
特殊设计的启动子和编码序列，这就限制了这一
方法应用以及能筛选到突变体的广泛性；另外，
它也涉及到两次转苗过程而容易污染的问题，且
不便操作。针对 PEG 模拟水分胁迫筛选拟南芥突
变体存在的问题，我们综合了前人报道中的优
点，建立了一种适应大规模筛选的方法。此法简
单快捷，易于操作，可降低污染率，重复性好，
可能对用于实验室内的大规模筛选有所帮助。
材料与方法
1 植物材料
材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Col
(Columbia)。种子萌发期筛时用滤纸，按培养皿
直径裁剪, 滤纸直径比其略小，每皿放 2 张；苗
期筛选用纱布，用大培养皿(培养皿底直径 12.0
c m ) ，将纱布按照培养皿底裁剪，比其直径略
小。裁剪好的滤纸和纱布平铺到培养皿中，连同
镊子、小量筒一起用高温蒸气灭菌(121℃，30
min)。PEG 为 PEG-8000 (日本进口分装，北京鼎
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国公司出品)，其浓度根据不同筛选时期进行选
择。实验的种子用 50% 漂白水表面消毒 5 min，
再用无菌水漂洗 4~5 次。萌发期筛选时，种子直
接播种到滤纸上；苗期筛选则将种子直接播种到
铺有纱布的MS (Sigma)培养基(MS+2%蔗糖 +1.0%
琼脂，pH 5.70)上。播种后于暗下以 4℃低温处
理48 h，放入培养室[(21±2)℃，日光灯光强50
µE·m-2·s-1，14 h光照 /10 h黑暗，相对湿度70%]
中培养。
2 试验方法
2.1 种子萌发期条件的确定 在超净台上，将经过
高温消毒后的 0 % 、5 % 、1 0 % 、1 5 % 、2 0 % 、
25% PEG 水溶液，用量筒各取 7 mL，充分浸润
2 层滤纸，再将经消毒过的拟南芥种子点播在滤
纸上，封口，于暗中以 4℃低温处理 2 d，然后
放到培养室生长 5 d，观察萌发及其他表型，统
计相关数据。
2.2 苗期条件的确定 将消毒后尚未凝固的MS培
养液 24 mL 直接倒入铺有纱布的培养皿中，凝固
后播种。于低温下放置 2 d，再放入培养室生长
7 d，用镊子轻轻夹起纱布一侧，将 12 mL 0%、
10%、20%、30% 的 PEG 溶液沿培养皿边缘缓缓
倒入培养皿中，放下纱布并转动培养皿，以使
PEG 溶液均匀分布，封口后放入培养室中，每天
观察，确定这一时期用于突变体筛选的指标。
一般来说，筛选突变体均以在一定的筛选条
件下，突变体植株与正常型植株在某一性状上呈
现明显差异时，确定其为已突变的突变体(何金环
等2004)。本文筛选的是与水分胁迫有关的拟南芥
突变体，确定其是否为突变体的标准为：在确定
的试验条件下，施加相应浓度的 P E G 后，根据
拟南芥植株对 PEG 的敏感程度不同而表现出的表
型差异确定。本文所用的插入突变体库由美国普
渡大学 Bressan 博士提供。其遗传背景为 gl1、
sos3-1。
实验结果
1 萌发期筛选条件的确立
我们在首先对PEG处理的拟南芥Col种子萌发
状况进行了观察，发现拟南芥 Col 播种在经水浸
润的滤纸上，4 d 后萌发率为100%，随着 PEG 浓
度的升高，萌发率逐渐降低。PEG 的浓度为 20%
时，萌发率降至 7.3%；PEG 浓度升高到 25% 时，
萌发率为零。可见，PEG 对 Col 种子萌发的抑制
对剂量是依赖的。因此，我们遂以 2 5 % 的 P E G
下种子以是否萌发为指标，进行筛选(图 1和 2)。
另外，我们还观察到，经 PEG 处理 5 d 的
拟南芥幼苗主根伸长受抑制。由图 2 可见，拟南
芥幼苗主根的伸长生长在5% PEG溶液中极显著地
被抑制，10% 以上 PEG 中主根伸长生长则完全受
抑制。据此，我们即以在此种浓度下主根是否伸
长为筛选指标，并筛选到一部分在 5% PEG 下主
根明显能生长的拟南芥突变体。
2 苗期筛选条件的确立
将拟南芥生态型Col种子播种到铺有纱布的培
养皿中，在正常的MS培养基上生长7 d后施加不
同浓度的 P E G 溶液，定时观察拟南芥苗的存活
率，确定选用的浓度和时间。结果，在 30% PEG
中处理 4 d后的拟南芥生态型Col苗变白、萎蔫，
其存活率为 0。据此，我们即用 30% PEG 作为
筛选浓度(图 3、4)。
采用此方法我们试筛了几个T-DNA插入的拟
南芥Col突变体库，并筛选到78株对水分胁迫不
敏感的突变体(图5)。我们测定了这些植株的可溶
性糖和脯氨酸含量以及离体叶片失水速率等生理指
标，发现有 8 株突变体的可溶性糖和脯氨酸含量
比对照升高，离体叶片失水速率明显减慢。对其
基因克隆和基因功能的研究正在进行中。
讨　　论
筛选拟南芥突变体能否成功，合适有效的筛
选方法和筛选指标非常关键(赵淑清2001)。与水
图1 不同浓度PEG对拟南芥野生型
Col种子萌发率的影响
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图2 不同浓度PEG下萌发4 d的Col幼苗生长
图3 施加不同浓度PEG后生态型Col的存活率
图4 施加PEG前后生态型Col幼苗生长状态的比较
分胁迫有关的生理生化、外观性状等指标很多，
如萎蔫程度、叶失水率等，但这些指标在具体操
作中难以把握，尤其不适合实验室进行大规模筛
选，所以寻找一个好的筛选指标非常重要。
本文介绍的方法经初步证实是适用的。拟南
芥种子萌发期，我们以在特定的选择压力下观察
其能否萌发作为筛选指标。本文结果表明，5 %
P E G 下的野生型拟南芥主根伸长生长明显受抑
制，在此种浓度的 P E G 下，可以筛选主根明显
伸长的突变体。另外，当 PEG 浓度达到 30% 时，
拟南芥苗会因失水过度而死亡，但发生变异的拟
南芥苗则可以生存下来，我们采用此法已筛选到
苗期拟南芥突变株，操作简单而且指标直观。
参考文献
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筛选方法建立. 河南农业科学, (6): 30~34
王伟(1998). 植物对水分亏缺的某些生化反应. 植物生理学通
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张立军, 樊金娟, 阮燕晔, 关义新(2004). 聚乙二醇在植物渗透胁
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赵淑清(2001). 一种筛选拟南芥突变体的有效方法. 遗传, 23 (3):
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Zhu JK (2002). Salt and drought stress signal transduction in plants.
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图 5 施加 PEG前后 T-DNA插入的拟南芥Col突变体的生长状态