全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月536
一种观察藻胆体移动的光漂白后荧光恢复技术
马为民 1,*，米华玲 2，沈允钢 2
1上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海 200032
A Method for Observing the Movement of Phycobilisomes by Florescence Re-
covery after Photobleaching
MA Wei-Min1, *, MI Hua-Ling2, SHEN Yun-Gang2
1College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2Institute of Plant Physiology
and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
提要：文章从样品制备、测定方法、数据分析方面就如何应用光漂白后的荧光恢复(FRAP)技术观测蓝藻藻胆体在类囊体
膜上的移动进行介绍，得到的结果表明FRAP技术可以直接而有效地观测蓝藻藻胆体在类囊体膜上的移动情况。
关键词：光漂白后的荧光恢复(FRAP) ；藻胆体移动；蓝藻
收稿 2008-01-04 修定 2008-04-31
资助 国家自然科学基金(30 7 70 1 7 5)、上海市科委自然科学
基金(07 ZR1 40 8 6)、上海市教育委员会科研创新重点
项目(08ZZ67)和上海师范大学博士启动基金(PL709)。
致谢 中国科学院化学研究所夏安东先生、中国科学院上海
生命科学研究院植物生理生态研究所高孝舒和王凌健先
生曾给予指导和帮助。上海师范大学魏兰珍和王全喜
先生曾提出意见。
* E - m a i l：c y a n o m a @ h o t m a i l . c o m；T e l：0 2 1 -
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蓝藻是一类能进行放氧光合作用的原核生
物，也是研究光合作用的模式生物之一。藻胆体
(phycobilisome，PBS)是蓝藻的主要捕光天线，它
们在类囊体膜上的移动能够调节激发能在两个光系
统间的分配，从而优化光能在光合作用中的利
用。能量传递研究表明，PBS能直接与光系统 II
(photosystem II，PS II)或光系统 I (photosystem
I，PS I)相连(Zhao等 1992；Glazer 等 1994；
Mullineaux 1994；Ashby和Mullineaux 1999；
Rakhimberdieva等 2001)，据此人们推测 PBS可通
过其在类囊体膜上的移动达到优化光能利用的目
的。1997年，Mullineaux等采用激光共聚焦显微
镜和光漂白后的荧光恢复(fluorescence recovery
after photobleaching，FRAP)技术，首次在蓝藻细
胞类囊体膜上观测到 PBS 的快速移动过程。随
后，这一技术得到广泛应用和发展，现已成为人
们研究蓝藻 P B S移动最为直接和有效的技术
(Sarcina等 2001；Aspinwall等 2004；Joshua和
Mullineaux 2004；Joshua等 2005；Ma等 2007)。
但迄今国内采用这一技术研究 PBS移动的报道尚
不多见。为此，结合我们的研究工作，本文从
样品制备、测定方法和数据分析等方面就如何应
用FRAP技术观测PBS在类囊体膜上的移动进行介
绍。
材料与方法
1 材料
聚球藻(Synechococcus sp. strain PCC 7942)细
胞用BG-11培养基(含 5 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.0，
Allen 1968)，在 30 ℃、连续光照(40 µE·m-2·s-1)
下通气(2% CO2的空气)培养。
2 方法
2.1 样品制备 5 000×g离心 5 min收集处于对数生
长期的聚球藻细胞(A730= 0.4~0.6)，用新鲜 BG-11
培养基洗涤 2次，最后将细胞重悬于新鲜 BG-11
培养基中，并调整叶绿素浓度至 5 µg·mL-1。同时
在细胞悬浮液中加入1 mol·L-1甜菜碱(glycinebetaine，
GB)，将聚球藻细胞的 PBS固定在类囊体膜上，
以抑制其在膜表面的快速移动(Li等 2001；Ma等
2007)。样品制备按如下步骤：(1)将经GB处理和
未处理的聚球藻细胞分别加入到 1.5%的低溶点琼
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 537
脂糖(用新鲜 BG-11培养基配制)中；(2)放在载玻
片上固定细胞，细胞应尽量分散；(3)用激光共聚
焦显微镜进行FRAP测定。另外，高温会影响PBS
的移动，温度应低于 35 ℃，这样才能将细胞加
入到低溶点琼脂糖中。
2.2 FRAP测定 以 633 nm的光激发蓝藻细胞时，
产生的荧光主要来自 PBS的核心体(Mullineaux等
1997)，所以用 FRAP技术观测 PBS在类囊体膜上
的移动，必须在激光共聚焦显微镜上配备 633 nm
的氦 -氖激光器。实验按如下步骤进行：(1)用 2%
的激光强度扫描并记录蓝藻细胞的图像；(2)在记
录的图像中选定一个长方形区域(宽约为 0.5 µm；
图 2中的虚线框)，然后用 100%的激光强度对选
定区域进行彻底的荧光漂白；(3)再用 2%的激光
强度监测被光漂白区域内的荧光恢复情况，并每
隔 1或 3 s记录荧光恢复数据或图像。另外，实
验过程中用于扫描的激光强度应选择不会对样品产
生重大光漂白的激光强度。
2.3 FRAP数据分析 FRAP实验数据分析有：(1)
对荧光恢复数据进行标准化处理。标准化处理的
公式(Goodwin和 Kenworthy 2005) ：I(t) norm=100×
[I(t)ROI-Ib]/[I(t)cell-Ib]×(II cell-Ib)/(II ROI-Ib)，其中，
I(t) norm为标准化的荧光恢复数据；I(t) ROI为光漂白
区域内随时间变化的荧光强度(region of intensity，
ROI) ；II ROI为光漂白区域内漂白前的荧光强度；
I(t) cell为光漂白区域外随时间变化的荧光强度；II cell
为光漂白区域外漂白前的荧光强度；Ib为背景荧
光强度的变化。(2)分析标准化的荧光恢复曲线(图
1-a)，用移动公式求出 PBS中向光漂白区域内移
动的百分比。移动的公式(Goodwin和Kenworthy
2005) ：Mf=100×(IE-Io)/(II-Io)，其中，Mf为 PBS
移动的百分比；IE为恢复完全时的荧光强度；I o
为光漂白后的荧光强度；I I为光漂白前的荧光强
度。(3)用一元移动经验方程对标准化的 FRAP荧
光恢复数据进行拟合(图 1-b)，求出 PBS在类囊体
膜上的移动速率。一元移动经验方程(Ellenberg等
1997): I(t)=IE[1-w2×(w2+4πDt)-1]1/2，其中，I(t)为
随时间变化的荧光强度；IE为恢复完全时的荧光
强度；w为长方形的宽；D为 PBS的移动速率；
t的零值为光漂白时间的一半。
结果与讨论
FRAP技术一直认为是研究真核细胞膜组份横
向移动的手段(Zha ng等 1993)；直至 199 7 年
Mullineaux等应用这一技术观测到蓝藻细胞 PBS
在类囊体膜上的快速移动现象，嗣后这一技术就
成为研究蓝藻 PBS移动最为直接、有效的手段。
GB是一种小分子化合物，它能将蓝藻 PBS固定
在类囊体膜上，从而抑制其在膜表面的快速移动
(Li等 2001；Ma 等 2007)，因此，我们遂以经
GB处理与否的聚球藻细胞为材料，采用FRAP技
术观测光漂白后细胞中 P BS 荧光的恢复过程，
直接观察聚球藻中 PBS在类囊体膜上的移动情
况。
图 1 标准化的 FRAP荧光恢复曲线(a)和用一元
移动经验方程对其进行拟合的曲线(b)
PBS移动数低于 45%的，则不适合用一元移动经验方程进
行拟合。
图 2 经GB处理的聚球藻细胞光漂白前后的 FRAP检测
标尺为 2 µm。
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1 定性分析
在采用 633 nm的光激发聚球藻细胞的前提
下，首先用 2%的激光强度扫描并记录细胞的图
像(图 2中的PB)，然后用 100%的激光强度对选定
的长方形区域(图2中的虚线框)进行彻底的荧光漂
白(图 2中的 0 s)，随后用 2%的激光强度监测光
漂白区域内的荧光恢复情况(图2中的6、12和18 s)。
从图 2可见，在光漂白区内，未经 GB处理的细
胞(对照)中PBS荧光可以有效恢复，而经GB处理
的细胞中的 PBS荧光则不恢复。这表明，PBS可
在类囊体膜上进行快速移动，因而光漂白区中的
PBS荧光也得以恢复；而GB对 PBS移动有抑制
作用，所以 PBS荧光恢复过程明显减慢甚至不能
恢复。
2 定量分析
为减少由于背景荧光的变化和光漂白过程中
的荧光损失等原因造成的误差，定量分析之前，
必须首先对荧光恢复曲线进行标准化处理(图 1-
a)，然后对标准化的荧光恢复曲线进行分析和计
算(图 1-b)，可以得到对照和GB处理细胞中 PBS
向光漂白区域内移动的百分比(表 1)，在对照细胞
中，80%以上的 PBS能够移动到光漂白区内，而
在GB处理的细胞中，只有不足 16%的 PBS能够
扩散到光漂白区内，这就进一步证实 PBS能够在
类囊体膜上进行快速移动；此外，还可以测得
PBS在类囊体膜上的移动速率，平均移动速率为
(2.2±0.3)×10-10 cm2·s-1 (表 1)。
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表 1 GB处理与否的聚球藻细胞中PBS移动的百分比和速率
处理 PBS移动数 /% 移动速率 /10-10 cm2·s-1
对照 80.1±7.9 2.2±0.3
GB处理 15.9±4.1 —
总之，上述定性、定量分析 FRAP荧光恢复
数据的结果不仅证实GB对PBS移动有抑制作用，
而且还说明FRAP技术可以直接而有效地观测PBS
在类囊体膜上的移动情况。因此认为，FRAP技
术在观测蓝藻 PBS移动这一领域中有一定的应用
前景。
参考文献
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