全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 483
云南元江普通野生稻中 Pi-ta和 Pib同源基因的克隆和分析
杨明挚 1，程在全 2，陈善娜 1，钱君 2，尹梅 1，吴成军 2，黄兴奇 2,*
1云南大学生命科学学院，昆明 650091；2云南省农业科学院生物技术研究所，昆明 650223
提要：用高保真PCR技术从云南元江普通野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi-ta同源基因的编码区及Pib 基因的部分同源序列。
Pi-ta同源基因的编码区序列与报道的栽培稻有99.7%的同源性。根据前人的结果，从元江普通野生稻的Pi-ta基因推导的
氨基酸序列中918位点为丝氨酸，属于Pi-ta_等位基因，不能对含有AVRPita基因的稻瘟病菌产生抗性。与Pi-ta基因相比，
元江普通野生稻中的Pib同源基因第一外显子与栽培稻的相应序列间存在较大差异，其中有一段87 bp的DNA序列缺失，
而且不能按正常的Pib基因序列的阅读框进行翻译。因此认为，元江普通野生稻不具有基于Pi-ta和Pib基因的抗稻瘟病遗
传基础。
关键词：元江普通野生稻；Pi-ta基因；Pib基因；同源序列
Cloning and Analysis of Pi-ta and Pib Gene Homologues from Yunnan Yuanjiang
Type of Common Wild Rice (Oryza rufipogon Griff)
YANG Ming-Zhi1, CHENG Zai-Quan2, CHEN Shan-Na1, QIAN Jun2, YIN Mei1, WU Cheng-Jun2, HUANG Xing-Qi2,*
1School of Life Science, Yunnan University, Kunming 650091, China; 2Biotechnology Institute, Yunnan Academy of Agricultural
Science, Kunming 650223, China
Abstract: The coding region of Pi-ta gene and Pib gene homologues from Yunnan Yuanjing type of common
wild rice (Oryza rufipogon) had cloned and sequenced by high fidelity PCR. The cloned DNA sequence of Pi-
ta gene from Yuanjiang type of common wild rice has 99.7% identity with that of cultivated rice (Oryza sativa).
There was serine at the position 918 within the deduced PITA amino acid sequence. So, according to the
previous study, Yuanjing type of common wild rice may contain a Pi-ta– allele that can not cause disease
resistance response with rice blast pathogens in which contain AVRPita gene. Contrary to the Pi-ta gene, the
cloned Pib gene exon I DNA sequence from Yuanjiang type of common wild rice has only 93.9% identity with
that of the reported O. sativa. There was 87 bp DNA sequence deletion within the cloned Pib gene exon I from
Yuanjiang type of common wild rice, compared to that of the cultivated rice. And the cloned Pib gene sequence
cannot be translated into the corresponding PIB amino acid sequence. So, Yuanjiang type of common wild rice
may lack the Pi-ta and Pib gene based rice blast resistance abilities.
Key words: Yuanjiang type of common wild rice (Oryza rufipogon); Pi-ta gene; Pib gene; gene homologues
收稿 2007-01-16 修定 　2007-04-16
资助 国家自然科学基金(3 00 69 00 3)和云南省自然科学基金
(2006C00007Q 和 2004C0010Z)。
* 通讯作者(E-mail：huangxq02@163.com；Tel：0871-
5 1 3 0 6 8 1 )。
云南元江普通野生稻是我国迄今发现分布海
拔最高(750 m)的普通野生稻，因气候及生态环境
独特，其生境周围不种植栽培稻，因此认为是原
始性最好而且较纯的普通野生稻类群，也因而在
我国栽培稻演化研究中占有重要地位(袁平荣等
1995)。云南元江普通野生稻，与江西东乡普通
野生稻以及广西桂林普通野生稻被认为是普通野生
稻原始祖先型的代表(高立志和洪德元1999；王象
坤等 1998)。野生稻由于生长环境相对恶劣，在
长期进化过程中形成了许多栽培稻所没有的优异性
状(庞汉华 1 9 9 8；徐玲玲等 2 0 0 6；杨善益等
2006)，因而成为栽培稻育种的重要遗传资源库。
研究野生稻的生理、生化、遗传和分子生物学是
发掘和利用野生稻有用遗传资源的前提。此外，
作为水稻最严重的病害之一的稻瘟病，目前定位
的抗稻瘟病 R (resistance)基因至少有 30个(Iwata
1996)，而克隆的只有 2个，即 Pi-ta基因(Bryan
等 2000)和 Pib基因(Wang等 1999)。前者以基因
对基因的方式介导对产生无毒基因 AVRPita的稻
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瘟病菌(Magnaporthe grisea)的抗性。单拷贝的Pi-
ta基因有 2个外显子组成，抗性和敏感性的水稻
品种中均有少量的组成型表达。敏感性水稻品种
中的Pi-ta_等位基因与抗性水稻品种中的Pi-ta+等
位基因仅有1个氨基酸残基的差别，即在第918位
点处，抗性品种是丙氨酸而敏感性品种则是丝氨
酸。Bryan等(2000)的转基因实验也证实 Pi-ta+与
AVRPita能引起抗病性反应，而 Pi-ta_与 AVRPita
之间则不能发生抗性反应。Pib基因有 3个外显子
组成，其中第一外显子约 1 kb。此种基因对日本
的一些稻瘟病菌生理小种有专一抗性并受多种因素
诱导表达(如病菌、受伤和环境条件的改变等)
(Wang等 1999)。Pi-ta和Pib基因在栽培稻中的结
构和功能已有较多报道，而这些基因在野生稻中
的表现尚未见报道。梁斌等(1999)鉴定云南野生
稻对稻瘟病抗性的结果表明，元江普通野生稻对
自然发生的稻瘟病菌高度敏感。这种对稻瘟病高
感特性是否与上述基因的功能差异有关? 为此，
本文采用高保真 PCR技术从云南元江普通野生稻
中克隆了 Pi-ta基因的完整开放阅读框以及 Pib基
因第一外显子的同源序列，并对所克隆的序列及
其相应基因进行了分析。
材料与方法
云南元江普通野生稻(Oryza rufipogon Griff)
采自云南省元江县野生稻保护基地。实验中所用
的 PCR扩增试剂 Pfu Taq DNA聚合酶购自华美生
物工程公司，PCR产物回收试剂盒及质粒抽提试
剂盒购自上海华瞬生物工程公司。克隆载体
pGEM-T购自 Promega公司。
DNA的提取采用SDS法，按文献的方法进行
(Murray和 Thompson 1980)。提取的 DNA，经
0.8%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测后，
稀释至 50 ng·µL-1，于 −20 ℃冰箱中保存备用。
根据报道的 P i - t a 基因 ( 基因登录号为
AF207842)和Pib基因(基因登录号为AB026839)序
列，委托上海生物工程公司合成 3对引物：Pta1，
5 TCTGATCTTCAGCTAGCGC 3，Pta2，5 GA-
TTCATGGCTCGATCGA 3，克隆 Pi-ta基因含外
显子 I的片段；Pta3，5 ACGAAGTACTAAATG-
TTC 3，Pta4，5 CCTCTACTCTGAAGACG 3，
克隆 Pi-ta基因含外显子 II的片段；Pb1，5 AT-
GGAGGCGACGGCGCTGAG 3，Pb2，5 CTT-
GTCGTAGAATGCGTA 3，扩增Pib基因第一外显
子片段。从元江普通野生稻基因组DNA中PCR扩
增Pi-ta和Pib同源基因的反应液组成为：在25 µL
的体系中加入 2.5 µL 10×缓冲液、各 5 pmol引
物、约 25 ng的基因组DNA、2.5 mmol·L-1 MgCl2、
0.2 mmol·L-1 dNTP、2.5 U Pfu Taq DNA聚合酶。
扩增条件为：95 ℃预变性 2 min；94 ℃ 变性 30
s，55 ℃复性 30 s (Pib基因扩增的复性温度为
60 ℃)，72 ℃延伸 1.5 min，35循环；72 ℃延伸
7 min。
PCR 产物的克隆和测序时，切下含有目的
DNA片段的琼脂糖凝胶块，用胶回收试剂盒，按
操作说明回收纯化目的DNA片段。纯化的DNA
片段连接到 p G E M - T 载体，转化大肠杆菌
(DH5α)，在含 100 µg·mL-1氨苄青霉素、2 mmol·
L-1异丙基硫代 -B-D-半乳糖苷(IPTG)、0.01% 5-
溴 -4-氯 -3-吲哚 -B-D-半乳糖苷(X-gal)的LB平板
上进行重组子筛选，含重组质粒的DNA由上海生
物工程公司测序。为确保序列测定结果的准确性
以及可能扩增到基因的其他家族成员，每次连接
产物分别挑选 3个独立的重组子进行测序。序列
比较、翻译等分析以 DNASIS等软件完成。
实验结果
1 云南元江普通野生稻中Pi-ta同源基因的克隆和
分析
以引物Pta1和Pta2从元江普通野生稻扩增获
得约 1 100 bp的特异性DNA片段(图 1-a)，而以
引物 Pta3的 Pta4可以从元江普通野生稻中扩增获
得约 2 000 bp的特异性DNA片段(图 1-b)，扩增
的 2个DNA片段包含了Pi-ta基因完整的编码区。
元江普通野生稻Pi-ta同源基因DNA和推导的氨基
酸序列与报道的栽培稻中Pi-ta+等位基因相应序列
之间有极高的同源性(核苷酸序列间的同源性为
99.7%；氨基酸序列间的同源性为 99.3%)。其中
有6个核苷酸的差异并导致5个氨基酸残基的改变
(3次独立测序结果)。元江普通野生稻 Pi-ta基因
与水稻Pi-ta+等位基因推导的氨基酸序列中氨基酸
残基及其理化性质有差异(表 1)。
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2 元江普通野生稻中 Pi-ta同源基因与栽培稻 Pi-
ta+等位基因推导的氨基酸序列二级结构的差异分
析
元江普通野生稻和栽培稻(AF207842) Pi-ta氨
基酸序列以DNASIS软件预测的二级结构的结果
表明，由于序列高度同源性，元江普通野生稻与
栽培稻该蛋白质的大部分区域均有相同的二级结
构，而在末端富亮氨酸结构域( l e u c i n e - r i c h
domain，LRD)内，由于 1个氨基酸残基的差异(表
1，918位点)导致了二者二级结构的较大差异。元
江普通野生稻比栽培稻多一个转折(TURN)结构(图
未列出)。
3 元江普通野生稻中 Pib同源基因的克隆与分析
用引物Pb1和Pb2从元江普通野生稻中可扩增
到约 1 000 bp较特异的DNA片段，扩增产物经克
隆后分别挑取 3个独立的重组克隆进行测序。结
果表明 3个克隆都为同一序列(在GenBank中的登
录号为DQ298750)。所克隆的 Pib同源DNA序列
与报道的栽培稻相应序列(基因登录号AB026839)
之间有较大差异，有 93.9%的同源性。元江普通
野生稻 Pib基因第一外显子的同源序列中有一段
87 bp的DNA序列缺失。部分DNA序列比较结果
如图2。用DNASIS软件对来源于元江普通野生稻
的 Pib同源基因序列进行翻译预测结果表明，虽
然缺失序列的碱基数为 3的倍数，但由于差异位
点较多(有 6.1%的差异)，此序列不能按栽培稻中
此种基因序列的阅读框翻译成相应的氨基酸序列。
表 1 元江普通野生稻与栽培稻 Pi-ta基因推导的氨基酸
序列中差异的氨基酸残基及其理化性质差异
Table 1 Comparison on the different amino acids between
Yuanjiang type of O. rufipogon and O. sativa within
Pi-ta gene deduced amino acid sequences
氨基酸 差异氨基酸 差异氨基酸
差异位点 残基所在 残基间的
栽培稻 元江普通 结构域 理化性质
野生稻
106 甘氨酸 丝氨酸 未知 相似
549 赖氨酸 精氨酸 未知 相似
629 苯丙氨酸 丝氨酸 未知 差异
796 谷氨酰胺 谷氨酸 未知 相似
918 丙氨酸 丝氨酸 LRD* 差异
*L R D：富亮氨酸结构域，属于非典型的富亮氨酸重复
(LR R)结构域。
图 1 元江普通野生稻基因组DNA PCR扩增
Pi-ta基因的琼脂糖电泳图谱
Fig.1 PCR results of Pi-ta homolog gene exon I and exon II
from Yunnan Yuanjiang type of O. rufipogon genomic DNA
1：Pi- ta 基因外显子 I 扩增结果；2：Pi- ta 基因外显子 I I
扩增结果；M：λD NA Ec oRI /H in dII I 标准分子量。
图 2 元江普通野生稻中 Pib同源基因的部分DNA序列与栽培稻中此种基因相应序列的比较
Fig.2 Comparison of the partial cloned Pib gene homologue from Yuanjiang type of
common wild rice and the corresponding cultivated rice
O. rufipogon (YJ)为克隆的 Pib同源基因序列，在 GenBank中的登录号为 DQ298750；O. sativa为来源于栽培稻的 Pib基因
相应序列，基因登录号为 A B 0 2 6 8 3 9。框内为差异核苷酸。
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讨 论
元江普通野生稻对稻瘟病的敏感性(梁斌等
1999)极有可能与其含有 Pi- ta –等位基因有关。
PITA蛋白质二级结构预测结果也表明，在此蛋白
的 LRD内，元江普通野生稻与栽培稻 Pi-ta+基因
推导的氨基酸序列虽然仅仅只有 1个氨基酸的差
别，但由于 2 个氨基酸间的理化特性差异较大，
以致二者的二级结构有差异。根据基因对基因理
论(Flor 1971)，病原菌的无毒基因(AVRPita)与植
物的抗病基因(Pi-ta)之间的相互识别是以基因产物
的空间结构为基础的( J on es 和 J on es 1 9 9 6；
Hammond-Kosack和 Jones 1997)。LRD为非典型
的富亮氨酸重复结构域( leucine- r i ch r epea t，
LRR)，LRR结构域在抗病基因产物与病原菌无毒
基因产物之间相互识别特异性中起主要作用。
LRD空间结构的改变将影响无毒基因与抗病基因
产物间的相互识别。虽然Pi-ta–基因与AVRPita之
间不能发生抗病性反应，但该等位基因的组成型
表达特性，暗示该基因可能还行使其他尚不知道
的生理功能。由于在栽培稻品系中同时存在有Pi-
ta+和 Pi-ta–等位基因(Bryan等 2000），在其他类
型的野生稻中是否也存在 Pi-ta+等位基因，这从
研究该基因进化以及发掘野生稻中的抗稻瘟病资源
来说是有意义的。
栽培稻中，Pi-ta基因为单拷贝基因(Bryan等
2000)，而 Pib基因属于一个成员数未知的家族成
员(Wang等 1999)。元江普通野生稻中的 Pib部分
同源序列与报道的栽培稻中相应该序列之间有较大
的差异，并有序列缺失(图 2)。如果本文中获得
的Pib基因序列并非其他的家族成员[3次独立测序
结果均未发现其他类型的 Pib同源序列，而与栽
培稻中克隆的Pib家族基因PibH8 (Wang等 1999，
2001)只有 52.2%的同源性]，这在一定程度上暗
示了在进化中 Pi-ta基因比 Pib基因承受了更大的
选择压力。对克隆的 Pib DNA序列翻译分析的结
果表明，所克隆的元江普通野生稻中的 Pib基因
可能不具有栽培稻中 Pib基因的抗稻瘟病功能。
云南元江普通野生稻中既不含有抗病的Pi-ta+等位
基因，可能也不具有抗稻瘟病功能的 Pib基因，
因此可以认为，该类型普通野生稻不具备基于Pi-
ta和 Pib基因的抗稻瘟病遗传基础。但作为普通
野生稻原始祖先类型的元江普通野生稻来说，Pi-
ta和Pib同源序列给我们提供了一条研究这些基因
进化的分子线索。
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