全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 235
亚麻品种‘双亚 5 号’的胚性愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生
葛春辉，计巧灵 *，郭景霞，姜丽，王雪华，朱国丽，贾红丽，张丕鸿
新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046
提要：亚麻品种‘双亚 5号’的种子在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖培养基上可诱导出愈伤组织。将其转入MS+
0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA培养基上培养 10周后诱导出大量胚性愈伤组织，结构较致密，浅黄色，表面有成团的紧密
粘附在一起的小颗粒形态。但其继代周期不宜太长，继代次数不宜多，否则易回到非胚性化状态。胚性愈伤组织转入MS+
1.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 2,4-D分化培养基上培养40 d后可获得大量的球形胚状体。少量球形体胚可萌发形成正常的子叶
胚初期形态，较多的球形体胚形成次生体胚或仅有单极性的畸形胚状体。组织解剖学观察表明，诱导出的是亚麻胚性愈
伤组织和胚状体。
关键词：‘双亚 5号’亚麻；胚性愈伤组织；胚状体；体胚萌芽；组织解剖学
Induction of Embryonic Callus and Regeneration of Somatic Embryogenesis in
Linum usitatissimum L. ‘Shuangya No.5’
GE Chun-Hui, JI Qiao-Ling*, GUO Jing-Xia, JIANG Li, WANG Xue-Hua, ZHU Guo-Li, JIA Hong-Li, ZHANG Pi-Hong
College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China
Abstract: Callus was initiated from seed explants of Linum usitatissimum ‘Shuangya No.5’ on MS medium
supplemented with 1.0 mg·L-1 2,4-D and 30 g·L-1 sucrose. A lot of embryonic calli emerged after transferred the
callus to MS medium with combination of 0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA for 10 weeks, fine and close in
texture, pale yellow, granular in shape adhered closely together. But it’s no good prolonging time in subculture
period and many times of subculture, otherwise it was easily returned to the non-embryonic status. A great deal
of globular somatic embryos came out onto embryonic calli which were inoculated on MS differentiation me-
dium supplemented with 1.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 2,4-D for 40 d. A small amount of globular-stage embryos
could geminate and form cotyledon-stage embryos. More secondary somatic embryos and abnormal somatic
embryos with single pole derived from globular-shape embryos. Histological anatomy proved that the embry-
onic callus and embryoid of flax were obtained after induction.
Key words: Linum usitatissimum ‘Shuangya No.5’; embryonic calli; embryoid; somatic embryo germination;
histological anatomy
收稿 2007-12-06 修定 2008-02-13
资助 国家自然科学基金(30660095)和新疆教育厅重点科研项
目(XJEDU200 6I08 )。
* 通讯作者( E -ma i l：wji1 1 1 8 @ya hoo.com.cn；T el：
09 91 -8 14 37 43 )。
我国目前栽培的纤维亚麻品种主要是从原苏
联引进的‘火炬’、‘乐 - 1 1 2 0’等品种经人工
诱变、种间有性杂交和回交得来(王殿奎 1997)，
由于现有的亚麻品种遗传基础狭窄，已有的野
生、多胚、不育等特异资源的有利目标基因利用
率偏低，致使纤维亚麻育种工作进展缓慢(康庆华
等 2006；粟建光等 2004)。因此，选择生态差
异较大、亲缘关系较远、主要性状的优缺点可以
互补的资源为亲本，通过细胞工程(或基因工程)
手段与传统方法相结合，创造纤维亚麻新类型已
势在必行(王殿奎 1997；粟建光等 2004)。而现代
育种手段的成功需要建立良好的纤维亚麻高效离体
再生体系，特别是通过体细胞胚的再生体系。亚
麻体胚再生体系研究较多，Cunha和 Fernandes-
Ferreira (1996，1999)研究了亚麻体胚发生过程；
Tejavathi等(2000)研究的 3个亚麻品种(‘Jeevan’、
‘R552’、‘Gaurav’)的体细胞胚主要是次生胚；
Dedičová等(2000)也发现了类似情况；Salaj等
(2005)根据组织学方法得到结果，认为这些类胚
结构没有正常体胚特征，不能正常发育。基于这
些认识，本文以新疆地区主栽亚麻品种‘双亚 5
号’为实验材料，进行了体外诱导培养，经过
近 2年的努力，得到了大量的体细胞胚胎，从而
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为进一步探究亚麻体胚发育过程以及建立体胚再生
体系，探索亚麻的远缘杂交或遗传转化育种建立
了基础。
材料与方法
亚麻(Linum usitatissimum L.)品种‘双亚 5
号’由黑龙江省亚麻原料工业研究所培育，其种
子由新疆农业科学院经济作物研究所提供。
亚麻种子放在 0.1%升汞溶液(在溶液中加入
1~2滴吐温)中灭菌 5~6 min，用无菌水漂洗 5~6次
后，放在无菌滤纸上吸干表面水分，接入MS+
1.0 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖培养基上，在(23±
2) ℃的培养室中暗培养 40 d后，将诱导出的愈伤
组织转入同种培养基上扩增，之后转入诱导培养
基(表 1)上，20~30 d继代一次，挑选长势较好的
组织小块传代，待出现胚性愈伤组织后统计其诱
导率，并将所有愈伤组织转入新配制的胚性愈伤
组织诱导培养基上。经过 5~7次继代培养后，挑
选浅黄色、致密的小颗粒状的胚性愈伤组织转入
系列分化培养基(表 2)，诱导亚麻体细胞胚。将
分化培养 40 d后的部分组织小团块投入纳瓦兴 II
固定液中固定，用石蜡包埋，按常规方法制备石
蜡切片。切片厚 5~7 µm，经番红 - 固绿染色，
中性树胶封片，于Motic数码显微系统下观察并
拍照。大部分组织小团块继续培养 1个月后，取
出球形体胚转入系列萌发培养基(表 3)上，诱使其
萌发。除了特殊说明外，培养基均附加 0.7%琼
脂和 3%蔗糖，pH (5.8±0.5)，培养温度为(23±
2) ℃，光照强度为 30~50 µmol·m-2·s-1，光照时
间 14 h·d-1。
结果与讨论
1 亚麻种子愈伤组织的诱导
无菌亚麻种子在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1
蔗糖培养基上暗培养 12 d后，个别种子在胚根部
脱分化，出现愈伤组织；20 d后，约有 50%的种
子出现愈伤组织；40 d后，大部分种子均形成愈
伤组织。这种愈伤组织转瓶培养，很容易扩增。
2 亚麻胚性愈伤组织的诱导
不同种类和浓度的植物生长调节剂对亚麻胚
性愈伤组织的诱导效应不同(表 1)。实验中，IBA
和 6-BA的组合对亚麻胚性愈伤组织的诱导均无
效，而KT和NAA组合的诱导效果较好，其中 6
号培养基(MS+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA)的诱
导效果最好，胚性愈伤组织的诱导率达 83.3%。
形态学观察表明，6号培养基上的愈伤组织较致
密，易碎，呈小颗粒状(图 1-a)，石蜡切片显示
其结构中有小细胞团，这些细胞呈球形，细胞质
浓。此种胚性愈伤组织不是由均一的细胞组成，
其细胞团常为非胚性和体积较大的薄壁细胞包裹而
表 1 胚性愈伤组织的诱导
Table 1 Induction of embryonic callus
编号 生长调节剂浓度 /mg·L-1 胚性愈伤组织块数 诱导率 /% 愈伤组织状态
1 KT 0.1+NAA 0.1 1 4.1 黄绿色，表面干燥，少许颗粒结构
2 KT 0.1+NAA 0.5 0 0 黄绿色，表面湿润，无瘤状突起，成块
3 KT 0.1+NAA 1.0 0 0 淡绿色，表面湿润，无瘤状突起，成块
4 KT 0.1+NAA 2.0 0 0 翠绿色，表面湿润，无瘤状突起，成块
5 KT 0.5+NAA 0.1 6 25.0 淡黄色，表面湿润，部分瘤状突起
6 KT 0.5+NAA 0.5 2 0 83.3 淡黄色，颗粒结构明显，较为致密
7 KT 0.5+NAA 1.0 1 2 50.0 浅绿色，表面较湿润，部分颗粒结构
8 KT 0.5+NAA 2.0 9 37.5 翠绿色，表面干燥，瘤状突起
9 IBA 0.1+6-BA 0.1 0 0 黄绿色，表面湿润，部分颗粒结构
1 0 IBA 0.1+6-BA 0.5 0 0 黄绿色，表面湿润，成块，无颗粒结构
1 1 IBA 0.1+6-BA 1.0 0 0 黄绿色，表面湿润，成块
1 2 IBA 0.1+6-BA 2.0 0 0 黄褐色，表面干燥，成块
1 3 IBA 0.5+6-BA 0.1 5 20.8 部分呈绿色，部分黄绿色，瘤状突起
1 4 IBA 0.5+6-BA 0.5 6 25.0 浅黄色，表面湿润，颗粒结构，质地较软
1 5 IBA 0.5+6-BA 1.0 5 20.8 黄绿色，表面干燥，有瘤状突起，质地硬
1 6 IBA 0.5+6-BA 2.0 3 12.5 浅绿色，表面干燥，有瘤状突起，结构密
基本培养基为 M S。每种培养基上接入的愈伤组织均为 2 4 块。
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表 2 胚性愈伤组织的分化和体细胞胚的发生
Table 2 Differentiation of embryonic calli and formation of somatic embryos
编号 生长调节剂浓度 /mg·L-1 最多的体胚数 /块 体细胞胚的形态和色泽
F1 2,4-D 1.0+KT 2.0 8 浅黄色，粒状
F2 2,4-D 1.0+KT 1.5 3 2 浅黄色或乳白色，粒状
F3 2,4-D 1.0+KT 1.0 6 乳白色，粒状
F4 2,4-D 1.0+KT 0 6 乳白色，粒状
F5 2,4-D 0+KT 1.0 0
F6 2,4-D 0+KT 0.5 0
F7 2,4-D 0.1+ZT 0.4 0
F8 2,4-D 0.2+ZT 1.6 0
F9 2,4-D 0.4+ZT 1.6 0
F10 6-BA 0.3+NAA 0.3 3 黄色，粒状
F11 6-BA 0.3+NAA 0.5 0
F12 6-BA 0.5+NAA 0.1 0
F13 6-BA 0.5+NAA 0.3 0
F14 6-BA 0.5+NAA 0.5 0
F15 6-BA 0.7+NAA 0.1 0
F16 6-BA 0.7+NAA 0.3 2 黄色，粒状
F17 6-BA 0.7+NAA 0.5 0
F18 6-BA 0.9+NAA 0.1 0
F19 6-BA 0.9+NAA 0.3 0
F20 6-BA 0.9+NAA 0.5 0
基本培养基为 M S。
表 3 体细胞胚在萌发培养基上的萌发
Table 3 Germination of somatic embryos on media
编号 培养基 最多的体胚萌发数 /瓶 体细胞胚的形态和色泽
M1 MS 2 8 多鱼雷形、香蕉形、子叶形，少量畸形胚，乳白色
M2 1/2MS 1 1 球形多，鱼雷形、香蕉形、子叶形少，少量畸形，乳白色
M3 M S + G A 3 0.1 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M4 MS+GA3 0.5 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M5 MS+GA3 1.0 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M6 MS+GA3 2.0 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M7 MS+ABA 0.1 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M8 MS+ABA 0.5 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M9 MS+ABA 1.0 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
M10 MS+ABA 2.0 mg·L-1 0 土黄色，逐渐死亡
培养基中加入Gln 200 mg·L-1和 CH 500 mg·L-1。
嵌合在一起(图 1-b)。
此外，结果还表明，亚麻胚性愈伤组织的诱
导需要较短的继代周期及较少的继代次数。在诱
导亚麻胚性愈伤组织初期，20~25 d继代一次有利
于愈伤组织的形态变化。3次继代后，在 4~7号
培养基上，亚麻愈伤组织结构较致密，浅黄色，
表面有紧密粘附在一起的小颗粒团出现，但颗粒
表面不光滑。从整瓶结果来看，尽管培养条件一
致，但不是每块愈伤组织都发生形态变化。随着
继代周期的延长(30 d左右)，这些培养基上的胚
性愈伤组织结构有由较致密型向较疏松型转变的趋
势，转瓶 10 d左右后，愈伤组织块生长迅速，体
积膨大，呈大块片状，已退化为非胚性组织。继
代 5次后，胚性愈伤组织的形态也逐渐变差，并
有小块褐变组织出现在其中。这些现象均说明亚
麻胚性愈伤组织正逐渐衰老，这种现象一经出现
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图 1 亚麻品种‘双亚 5号’的胚性愈伤组织和体细胞胚
Fig.1 Embryonic calli and somatic embryos of L. usitatissimum ‘Shuangya No.5’
a .亚麻胚性愈伤组织。结构较致密，易碎，呈小颗粒状，浅黄色。b .亚麻胚性愈伤组织石蜡切片。示薄壁细胞内的分生
细胞团，呈鸟巢状结构。c .亚麻胚状体石蜡切片。示内起源的球形胚，被大的薄壁细胞包裹着。d .亚麻胚状体石蜡切片。示
带有明显胚柄、正在发育的球形胚。e .亚麻胚状体石蜡切片。示从球形的初级体胚内部产生的次生球形体胚。f .亚麻胚状体石
蜡切片。示鱼雷胚。g .亚麻球形胚、鱼雷胚、香蕉胚和子叶胚。h .亚麻畸形胚。仅具有芽端极性，芽明显伸长，但无根伸
长。 i .亚麻畸形胚。仅具有根端极性，根明显伸长，但无芽伸长。
就很难逆转。
3 亚麻体细胞胚的发生
不同分化培养基上亚麻胚性愈伤组织发生体
细胞胚的结果(表 2)表明，胚性愈伤组织在分化培
养基上诱导 25 d后，F2号培养基上可以看到球形
胚，呈浅黄色或乳白色，表面光滑，容易从愈
伤组织块上剥离下来。35 d后，F1~F4号培养基
上均出现球形胚，F2号培养基上出现得最多，肉
眼可见到很多结构紧密的球形或近球形小颗粒，
整块组织块变得很松脆，用镊子夹时很容易散
开。同一瓶材料的石蜡切片观察显示，有的愈伤
组织团内部呈现鸟巢状(图 1-b)结构，是分生细胞
团，属胚性愈伤组织；有的内部已发育成球形
胚，由大小基本一致、核大、核仁明显的细胞
组成(图 1-c)，体积较小，但仍被大的薄壁细胞
紧紧包裹着；有些球形胚已突破薄壁细胞的束缚
而游离出来，体积较大，表面不光滑；少数体
积较大的球形胚带有明显的胚柄(图 1-d)，正在进
一步分化，少量鱼雷胚已经出现(图 1-f)，这说明
在相同培养条件下，体细胞胚发生是不同步的。
此外，在体细胞胚发生过程中，除了正常的各形
态体胚外，还常见到从球形胚状体内部又产生次
生胚的现象(图 1-e)。
一般认为，生长素是体胚发生所必需的生长
调节剂(Dedičová等 2000；杨汉民等 1992；郝建
平等 1995)，这已在多种植物体胚诱导中得到验
证。本文结果表明，只有 1.0 mg·L-1 2,4-D的培
养条件下才能产生胚状体，但胚状体一经出现往
往会很快脱分化；仅加 KT的培养条件下未出现
胚状体；而 1.0 mg·L-1 2,4-D+1.5 mg·L-1 KT的培
养基上则大量形成球形胚。这说明 1.0 mg·L- 1
2,4-D是诱导亚麻胚状体发生所必需的，但需要适
当浓度的KT协同作用，才能完成体胚发生过程，
这与苜蓿的体胚发生情况类似(黄学林等 1998)。
总之，亚麻的胚状体以内起源为主。实验中除了
得到大量正常的胚状体外，还有次生体胚出现，
次生球形体胚多是从球形的初级体胚内部产生，
或从其表层产生的，它与初生体胚很难分离，剥
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离后胚体即受损，在培养过程中容易死亡，不剥
离也不能正常生长，这与 Tejavathi等(2000)的结
果相似。无论怎样，亚麻次生体胚产生的原因还
有待深入研究。
4 亚麻体细胞胚的萌发
将亚麻球形、鱼雷形胚状体转接到系列萌发
的培养基上诱导 20 d后，在含有GA3或ABA培养
基上的体胚不但没有萌发，而且逐渐变成浅土黄
色，40 d后逐渐死亡(表 3)。而在M1、M2号培
养基上的部分球形胚已萌发，并形成香蕉胚或子
叶胚形态(图 1-g)。但一部分亚麻体胚呈畸形，有
些仅具有芽端极性，茎伸长明显，具有较完整的
子叶原基，但不形成正常的子叶，也不发育出正
常的根系(图 1-h) ；有的仅具有根端极性，可以
发育出正常的长根，但芽端极性不明显，未见到
芽端有明显发育(图 1-i)。这与Cunha和Fernandes-
Ferreira (1996)认为赤霉素能促进亚麻体胚发育和
不定芽再生的结果不同，与 Tejavathi等(2000)认
为脱落酸不能防止亚麻次生体胚发生和促进体胚成
熟的观点一致。‘双亚 5 号’亚麻胚状体在萌发
阶段所用的最适生长调节物质的组合、剂量、处
理时间等问题还需进一步探讨。
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