全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月516
脲酶Km 值简易测定方法的改进
李帮秀* 胡奎 刘大军 徐鹏芬
西南农业大学农学与生命科学学院，重庆400716
Improvement for A Simplified Way to Assay Urease Km
LI Bang-Xiu*, HU Kui, LIU Da-Jun, XU Peng-Fen
College of Agronomy and Life Sciences, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China
提要 对脲酶 Km 值简易测定方法中存在的问题和(NH4)2SO4 标准溶液浓度、尿素浓度、脲酶终止剂、缓冲液系统以及脲
酶用量等因素对 Km 值的影响，进行了多组对比测定。将该方法测定条件优化为：(NH4)2SO4 标准溶液浓度 0.001 mol·L-1，
尿素浓度 1/250、1/200、1/150、1/100、1/50 mol·L-1，终止剂 10% 硫酸锌，缓冲液 1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4 (pH 7.0)，脲酶
用量 0.50 mL。
关键词 脲酶 Km 值；简易测定方法；改进
收稿 2005-01-17 修定 　2005-06-28
资助 重庆市精品课程项目和西南农业大学实验教学改革项目。
*E-mail: libangxiu@163.com, Tel: 023-68250794
脲酶 Km 值(米氏常数)简易测定方法[1]是高等
农业院校生物化学和应用酶学等课程常开设的实验
项目之一。由于反应溶液随着尿素浓度的增加，
显色液出现由黄色逐渐变为棕红色两种颜色，且
由透明变为浑浊，吸光值变化不定，实验计算出
的 Km 值与实验特定底物——脲酶 Km 值(即文献报
道值25 mmol，下同)[2]相差甚远或Km 值为负，实
验结果欠佳(不可靠)。为此，我们对此项实验条
件进行了探讨和改进。
材料与方法
1 实验材料
实验材料为我校农学与生命科学学院大豆研
究室提供的西豆4号(Glycine max L. var. Xidou No.
4 )。脲酶的提取与文献 1 相同。
2 实验仪器和试剂
实验所用仪器与文献1 中的相同。
标准曲线所用(NH4)2SO4 溶液浓度为 3 个组
合：(1)原方法的0.005 mol·L-1，(2)0.001 mol·L-1，
( 3 ) 0 . 0 0 2 m o l · L - 1；溶液浓度原方法为
1/50、1/40、1/30、1/20 mol·L-1，本文设 3个
组合进行对比：(1)1/250、1/200、1/150、1/100、
1/50 mol·L-1，(2)1/100、1/80、1/60、1/40、1/20
mol·L-1，(3)1/60、1/50、1/40、1/30、1/20 mol·L-1；
终止剂用10% ZnSO4溶液与0.2 mol·L-1的HCl[3]溶
液进行对比；缓冲溶液用1/15 mol·L-1磷酸缓冲液
(pH 7.0)与1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4缓冲液(pH 7.0)[4]
进行对比；脲酶用量以0.25、0.50、0.75 mL 进
行对比；实验的其它条件与原方法相同。
3 操作程序
按原方法的程序测定(NH4)2SO4 标准溶液3种
浓度、不同体积的吸光值，回归分析得出回归方
程，然后，对各尿素组合浓度中的每一浓度进行
3 次平行测定，取每一种浓度吸光值的平均值，
并根据各组合浓度所得的吸光值范围，按对应的
标准溶液的吸光值的回归方程计算 Km 值。
实验结果
1 (NH4)2SO4标准溶液浓度对吸光值的影响
从表 1 可知，当(NH4)2SO4 标准溶液浓度为
0.001、0.002和 0.005 mol·L-1 时，(NH4)2SO4 摩尔
数与吸光值的相关系数(R2)分别为0.9955、0.9992
和 0.9719。随着(NH4)2SO4 摩尔数的增加，比色
液由黄色变为红棕色，由透明变为浑浊；当
(NH4)2SO4 标准溶液摩尔数为8×10-7 时，吸光值迅
速增加，无法准确记录。
2 不同浓度尿素溶液和终止剂对Km值的影响
从表 2 可知，尿素溶液浓度相同时，用 0.2
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 517
mol·L-1 盐酸作终止剂所得的吸光值比10% 硫酸锌
的大。用0.2 mol·L-1 盐酸作终止剂时，Km值随着
尿素浓度的增加而增加；用10% 硫酸锌作终止剂
时，K m 值随着尿素浓度的增加呈现无规律的变
化。用10% 硫酸锌和尿素浓度较低[组合(1)]时，
Km 值与文献报道值接近，相关系数为0.9484；其
余两组合的 Km 都只有几个 mmol，与文献报道值
相差较大。但当尿素增加到1/100 mol·L-1 时，不
管用0.2 mol·L-1盐酸或10% 硫酸锌作终止剂，比
色液都会出现与制作标准曲线相同的现象：颜色
变红，出现浑浊。
3 不同浓度尿素和缓冲液对Km值的影响
从表3可知，当尿素浓度为 1/250、1/200、
1/150、1/60、1/50、1/40、 1/30 mol·L-1 时，1/15
mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)比1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4
缓冲液(pH 7.0)所得到的比色液吸光值小；当尿素
浓度为1/100、1/80 mol·L-1 时，上述2种缓冲液
所得到的比色液吸光值相等或接近；当尿素浓度
为 1/20 mol·L-1时，1/15 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)
比1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4缓冲液(pH 7.0)所得到的
比色液吸光值大。用1/15 mol·L-1 磷酸缓冲液(pH
7.0)，组合 1、2、3 的 Km 值差异较大，分别为
22.98、3.90、7.17 mmol；用1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4
缓冲液(pH 7.0)，相应的Km值分别为3.48、3.74、
4.04 mmol，差异较小。
当尿素浓度增加到1/80 mol·L-1时，不管是用
1/50 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)还是用1/15 mol·L-1
表1 不同浓度(NH4)2SO4溶液对吸光值的影响
(NH4)2SO4 摩尔数 吸光值 回归方程 相关系数
浓度/mol·L-1 (×10-7)
0.001 1 0.058 y=432000x+0.0096 R2=0.9955
2 0.089
3 0.140
4 0.181
5 0.228
0.002 2 0.089 y=520500x-0.0203 R2=0.9992
4 0.181
6 0.293
8 0.394
10 0.503
0.005 5 0.228 y=775200x-0.2406 R2=0.9719
10 0.503
15 0.872
20 1.181
25 1.827
表2 不同浓度尿素和终止剂对Km值的影响
　　　　　　　　　　　　　　　　　终止剂
尿素浓 尿素浓度/ 0.2 mol·L-1 盐酸 10% 硫酸锌
度组合 mol·L-1
吸光值 回归方程 双倒数方程 Km值/ 吸光值 回归方程 双倒数方程　 Km值/
mmol　 mmol
(1) 1/250 0.239 y=520500x-0.0203 y=10500x+5E+06 2.10 0.129 y=520500x-0.0203 y=20737x+902200 22.98
1/200 0.256 R2=0.9641 0.203 R2=0.9484
1/150 0.307 0.278 　
1/100 0.423 0.362
1/50 0.647 0.585
(2) 1/100 0.423 y=775200x-0.2406 y=13520x+4E+06 3.38 0.362 y=775200x-0.2406 y=15584x+4E+06 3.90
1/80 0.472 R2=0.9388 0.427 R2=0.9569
1/60 0.533 0.488
1/40 0.784 0.741
1/20 1.243 1.204
(3) 1/60 0.533 y=775200x-0.2406 y=19928x+3E+06 6.64 0.488 y=775200x-0.2406 y=21522x+3E+06 7.17
1/50 0.647 R2=0.9996 0.585 R2=0.9937
1/40 0.784 0.741
1/30 0.977 0.863
1/20 1.243 1.204
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月518
Tris-H2SO4 缓冲液(pH 7.0)，比色液的颜色也转
红，溶液浑浊。
4 不同浓度尿素溶液和脲酶用量对Km值的影响
从表4 可知，在尿素溶液浓度相同时，脲酶
用量增加，吸光值也增加，但不成倍数增加。酶
量为0.25 mL对尿素浓度较低的组合(1)，无法确
定Km 值；酶量为0.25 mL对尿素浓度较高的组合
(2)、(3)，酶量为0.50 mL对尿素浓度为较高的组
合(3)，酶量为 0.75 mL 对尿素浓度较高的组合
(3)，三者的 Km 值比较接近，为 13.21~17.84
mmol；0.50 mL 酶量对尿素浓度较低的组合(1)，
其 Km 值为 29.47 mmol，与已有文献报道的脲酶
值仅差 3.53 mmol，其相关系数为0.9814；酶量
为 0.50 mL 对尿素浓度较高的组合(2)和酶量为
0.75 mL 对尿素浓度组合(1)、(2)，Km 值均较低，
只有几个 mmol，与已有报道的相差较大。酶量
为0.50或 0.75 mL时，随着尿素浓度的增加，比
色液的颜色同样变红，溶液不透明。
讨 论
通过上述实验结果，可以得出以下几点结论：
(1)(NH 4) 2SO 4 标准溶液、尿素浓度和终止
剂、尿素浓度和缓冲液、尿素浓度和脲酶量 4 个
因素，比色液均随着浓度的增大而逐渐由黄色变
为红棕色，由透明变为浑浊，当(NH4)2SO 4 的摩
尔数大于或等于8×10-7，即吸光值大于0.4时，吸
光值迅速增加，无法准确记录。此现象的发生与
NH4+ 浓度有关，而与反应的其他条件无关。由于
奈氏试剂是一种碘化钾、碘化汞复合体的碱性溶
液，能与NH4+ 作用生成棕黄色的碘化双汞铵胶体
溶液，颜色深浅与溶液中氨量成正比，所以本文
的方法只适用于铵盐的稀溶液[5]。奈氏试剂与铵
盐反应生成红棕色沉淀，若铵盐浓度很低时，则
生成黄色或棕色溶液[6]。所以，测定Km 值时，应
采用低浓度的标准液和尿素液，吸光值应控制在
0.4 以下。
(2)尿素浓度相同时，用0.2 mol·L-1盐酸终止
剂比10% 硫酸锌得到的吸光值大，这可能是0.2
mol·L-1 盐酸不能完全终止脲酶活性的结果。为了
避免上述颜色变红、溶液浑浊现象发生，准确测
定 K m 值，终止剂以 1 0 % 硫酸锌为佳。
(3)1/15 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)的Km值随
表3 不同浓度尿素和缓冲液对Km值的影响
缓冲液
尿素浓 尿素浓度/ 1/15 mol·L-1 Tris-H2SO4 缓冲液(pH 7.0) 1/15 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)
度组合 mol·L-1
吸光值 回归方程 双倒数方程 Km值/ 吸光值 回归方程 双倒数方程　 Km值/
mmol mmol
(1) 1/250 0.171 y=520500x-0.0203 y=13926x+4E+06 3.48 0.129 y=520500x-0.0203 y=20737x+902200 22.98
1/200 0.287 R2=0.882 0.203 R2=0.9484
1/150 0.337 0.278
1/100 0.368 0.362
1/50 0.623 0.585
(2) 1/100 0.368 y=775200x-0.2406 y=14974x+4E+06 3.74 0.362 y=775200x-0.2406 y=15584x+4E+06 3.90
1/80 0.427 R2=0.9926 0.427 R2=0.9569
1/60 0.576 0.488
1/40 0.786 0.741
1/20 1.100 1.204
(3) 1/60 0.576 y=775200x-0.2406 y=16170x+4E+06 4.04 0.488 y=775200x-0.2406 y=21522x+3E+06 7.17
1/50 0.623 R2=0.9857 0.585 R2=0.9938
1/40 0.786 0.741
1/30 0.915 0.863
1/20 1.100 1.204
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 519
表4 不同浓度尿素和脲酶量对Km值的影响
尿素浓 尿素浓度/ 脲酶量 0.25 mL
度组合 mol·L
-1
吸光值 回归方程 双倒数方程 Km值/mmol
(1) 1/250 0.030 y=432000x+0.0096 y=15733x-2E+06 R2=0.979 　—
1/200 0.037
1/150 0.042
1/100 0.085
1/50 0.176
(2) 1/100 0.085 y=520500x-0.0203 y=7627x+534974 R2=0.9916 14.26
1/80 0.099
1/60 0.134
1/40 0.201
1/20 0.359
(3) 1/60 0.134 y=520500x-0.0203 y=7807.1x+469988 R2=0.9801 16.61
1/50 0.176
1/40 0.201
1/30 0.244
1/20 0.359
尿素浓 尿素浓度/ 脲酶量 0.50 mL
度组合 mol·L
-1
吸光值 回归方程 双倒数方程 Km值/mmol
(1) 1/250 0.069 y=432000x+0.0096 y=4579.1x+155390 R2=0.9814 29.47
1/200 0.093
1/150 0.105
1/100 0.163
1/50 0.282
(2) 1/100 0.163 y=775200x-0.2406 y=2342.1x+627140 R2=0.8905 3.73
1/80 0.204
1/60 0.235
1/40 0.338
1/20 0.840
(3) 1/60 0.235 y=775200x-0.2406 y=3892.2x+294583 R2=0.9654 13.21
1/50 0.282
1/40 0.338
1/30 0.556
1/20 0.840
尿素浓 尿素浓度/ 脲酶量 0.75 mL
度组合 mol·L
-1
吸光值 回归方程 双倒数方程 Km值/mmol
(1) 1/250 0.072 y=520500x-0.0203 y=3200.5x+622146 R2=0.9699 5.14
1/200 0.109
1/150 0.122
1/100 0.174
1/50 0.324
(2) 1/100 0.174 y=775200x-0.2406 y=2618.7x+402707 R2=0.9594 6.50
1/80 0.211
1/60 0.303
1/40 0.454
1/20 1.054
(3) 1/60 0.303 y=775200x-0.2406 y=3625.5x+203117 R2=0.9655 17.84
1/50 0.324
1/40 0.454
1/30 0.669
1/20 1.054
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着尿素浓度的增加而波动较大，1/15 mol·L-1 Tris-
H2SO4缓冲液(pH 7.0)的Km值随着尿素浓度的增加
较为稳定。所以，缓冲液以 1/15 mol·L-1 Tris-
H2SO4 (pH 7.0)为佳。
(4)尿素浓度相同时，脲酶用量增加吸光值增
加，但不成倍数。从我们的实验结果来看，以
0.50 mL酶量和组合(1)的尿素浓度所得到的Km值
与文献报道值接近。所以测定时酶量以 0.50 mL
为佳。
综上所述，我们认为，在脲酶 K m 值简易测
定方法中，各种条件的确定建议为：用 0 . 0 0 1
mol·L-1 (NH4)2SO4 为标准溶液，尿素浓度用组合
(1)，以10% 硫酸锌作终止剂，1/15 mol·L-1 Tris-
H2SO4 (pH 7.0)为缓冲液，酶量用0.50 mL。
参考文献
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