全 文 ：植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月 729
一———————————————————————————————————————————————————————————一
一种简单高效的克隆水稻端粒相关序列的方法
房迈莼1李美茹2李洪清1’+
-华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州51063l；2中国科学院华南植物研究所，
广州510650
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提要采用盒式P(R扩增水稻端粒相关序列，将扩增产物与T载体连接，转化大肠杆菌，再通过PCR对获得的转化子进
行鉴定。应用此方法成功地从水稻中克隆到多个端粒相关序列。
关键词端粒相关序列；盒式PCR；水稻
端粒(telomefe)位于真核细胞线性染色体的末
端，典型的端粒是由富含GT的串连重复序列组
成，其保守序列可表示为[(T／A)。4GⅢ】。。一个基
因组内的所有端粒都是由相同的重复序列组成，
但不同物种的端粒重复序列是不同的。与端粒相
邻的区域主要由几种不同的重复序列组成，称之
为亚端粒序列(subtelomericsequence)，也称为端
粒的相关序列(telomereassociatedsequence，
TAS)。端粒相关序列的克隆可采用盒式PCR，以
端粒序列和人工接头序列设计引物进行扩增，但
扩增的产物电泳时呈弥散形分布，难以得到单一
的条带。本文通过回收相应区域的片段，克隆进
T载体，结合PCR鉴定，从水稻中克隆到多个端
粒相关序列。
材料与方法
1材料
水稻(D，yz口s口ffv口ssp．-『印Dnfc口)品种“紫稻”
由中国科学院华南植物研究所提供。
2方法
2．1总DNA的提取采用CTAB方法。取约300mg
新鲜幼嫩的紫稻叶片，于液氮中迅速研磨成粉末
后，再迅速转入离心管中，加入1InL1．5×CTAB
(1．5％CTAB、75mmol·L．1的pH8．OTris—HCl、1
mol·L。NaCl、15mm01．LJEDTA)，于65℃中放
置30min；再加入等体积的氯仿／异戊醇(24：1)，
室温下放置15min后以9300×譬离心3min，取
上清液，加入600“L的异丙醇，室温下放置15
min后以9300×暑离心5min；收集沉淀，用70％
乙醇充分洗涤，最后加入50“LH：O溶解沉淀，
置于一20℃下储存备用。
2．2获取端粒相关序列模板取约100“g总DNA，
用M6DI进行酶切，酶切产物经过0．8％琼脂糖
凝胶电泳检测后，用TAKARA试剂盒回收3镅kb
的DNA片段，定容为20UL。
2．3端粒相关序列的盒式PCR扩增制作人工接头
(1inker)，序列为：5’CTGACTGATCTAGAGGTA—
CCGGATCC3’和5’GATCGGATCCGGTACC．
TCTAGA3。。将3UL人工接头和10UL3墙kb的
紫稻DNA片段放在4℃中进行连接反应，过夜。
以连接后的3—8kbDNA片段为模板，以人工接
头序列(5’CTGACTGATCTAGAGGTACCG(“邺C
3。)和端粒重复序列(5’AACCCTAAACCCTAAA—
CCCTAAACCC3’)为引物进行热启动PCR。反应
条件为：94℃10min；94℃30s，67℃1min，
72℃lmin，30个循环；72℃10min。
2．4PCR产物的克隆PCR产物经过0．8％琼脂糖
收稿 2004．03．0l修定 2004．05—31
资助 教育部优秀青年教师资助计划。
+
通讯作者(E—mail：hqli@scnu．edu．c口，1’e】：D2D一
85211375-85141。
万方数据
730 植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月
凝胶电泳检测后，用TAKARA试剂盒回收
100400bD的片段。将回收片段和TA克隆载体
DUCmT进行连接反应，转化大肠杆菌。挑选部
分克隆进行PCR检测，引物同上。PCR反应条
件为：94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃
1 min，30个循环；72℃10min。
2．5序列分析重组克隆子利用M13正向引物进行
测序。
结果与讨论
用M易DI酶切后，取2“L点样检测(图1)。
端粒和端粒相关序列包含的酶切位点很少，而以
M6DI酶切后，端粒和端粒相关序列主要位于大
分子量的酶切片段中，切取3。8kb片段回收，将
3~8kb的DNA片段和人工接头进行连接，连接好
的片段作为模板进行盒式PCR扩增。如图2所示，
PCR的产物不成带。用肘的I酶解基因组DNA可
能产生的片段大小约为300bp，我们预测PCR扩
增的端粒片段约在100一400bp之间。切下
100400bp之间的PCR产物回收，连接pUCmT
载体，转化大肠杆菌：挑取30个重组子进行PCR
检测，得到7个含有端粒相关序列插入片段的重
组子(图3)；再将有端粒相关序列插入片段的重组子
进行序列分析，最后得到5个水稻的端粒相关序
列(AY572962、AY572963、AY572964、
AY573970，另一个与AY367l33的同源性为
100％)。在基因库中比较的结果显示，所得水稻
图1胁口I酶切结果
1．梯度分子量标准(8、7、6、5、4、3、2、1．6、1kb)；
2．水稻基因组酶切结果。
2
图2端粒相关序列的盒式PcR扩增结果
1．梯度分子量标准(8、7、6、5、4、3、2、1．6、1、0．5、
O．4、O．2kbl2．以3—8kbDNA片段为模板进行PCR扩增的
结果。
的端粒相关序列与拟南芥、小麦、玉米、烟草
等物种的端粒相关序列具有很高的同源性。这些
序列使我们进一步了解了水稻染色体端粒区域的结
构，它们还可以为水稻染色体末端的遗传图谱提
供标记探针。本文中的方法是在Ashikawa等⋯方
法的基础上发展来的，具有操作过程简单且高效
的特点，可以用于不同物种中端粒相关序列的克
隆。
图3克隆产物的PCR检测结果
1．梯级分子量标准(2、l、0．75、0．5、0．25、0．1kbl．
2．无端粒相关序列插入片段的重组子：3。9．有端粒相关序列插
入片段的重组子。
参考文献
l AshikawaI，KurataN，NagamuraYeta1．Cloningandmap-
pingoftelomere—associatedequencesfromrice．DNARes，
1994，l(2)：67～76
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