全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 815
用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞检测拟南芥rd29A基因启动子活性的方法
张俊莲1 王蒂2,* 张金文2 陈正华3
甘肃农业大学1 园艺系，2 农学院，兰州 730070；3 甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站，北京 100101
Determination of Promoter Activity of rd29A Gene of Arabidopsis thaliana
Using Green Fluorescent Protein and Onion Epidermal Cell
ZHANG Jun-Lian1, WANG Di2,*, ZHANG Jin-Wen2, CHEN Zheng-Hua3
1Department of Horticulture, 2College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3Postdoctor Work-
station of Yasheng Industrial Ltd., Beijing 100101, China
摘要 将 rd29A 基因的启动子与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合在一起，构建成植物表达载体，并以 CaMV35S 启动子驱动
的 GFP 基因的植物表达载体为对照，用基因枪介导法转化置于 4 种类型培养基上的洋葱表皮细胞。对其进行不同温度下
的培养，16 h 后观察 GFP 基因瞬时表达水平的结果表明，rd29A 启动子对高盐和脱水逆境的响应较温度显著，特别是在
含 PEG6000 的培养基上，细胞无破损，绿色荧光强烈，适合于 GFP 的瞬时表达。而高盐由于易导致细胞出现离子毒害，
不宜作为 GFP 瞬时表达的培养基。
关键词 rd29A 启动子；CaMV35S 启动子；绿色荧光蛋白(GFP) ；洋葱表皮细胞；拟南芥
收稿 2004-12-06 修定 　 2005-04-20
资助　 甘肃省科技攻关项目(2GS054-A41-005-01)和国家高技
术研究与发展计划(“863”计划)项目(2004AA241132)。
*通讯作者(E-mail: wangd@gsau.edu.cn, Tel: 0931-7631140)。
启动子是调控基因表达的关键元件之一。它
有 3 种类型，即组成型启动子、组织特异性启动
子和诱导型启动子[1]。组成型启动子 CaMV35S 是
目前植物基因工程中使用最多的启动子[2,3]，它可
使所驱动的目的基因高效且非特异性表达。但这
种非特异性表达模式不仅造成植物能量上的过度消
耗，而且还可能诱发转基因的沉默现象[ 4 ]，因
此，许多研究者改用组织特异性启动子或诱导型
启动子来解决这一问题。拟南芥(Arabidopsis
thaliana) rd29A基因的启动子是逆境诱导型启动
子，含有干旱、高盐、低温和 A B A 诱导表达相
关的顺式作用元件[5]，逆境胁迫可在早期瞬时诱
导这些顺式作用元件，从而激活靶基因的表达，
增强转基因植物的抗逆性。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，
GFP)是水母(Aequorea victoria)体内的天然蛋白，
自1994年Chalfie等[6]揭示了该蛋白作为报告蛋白
的潜在应用价值以来，它已作为报告蛋白成功地
在多种植物、动物和微生物中获得表达。由于
GFP 作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物
等其他成分，也不影响宿主细胞，因而可以鉴
定、跟踪、分选表达 G F P 的细胞；又由于它可
以在活细胞中进行图象分析，在固定细胞中进行
检测，因此，GFP 已成为近年来广泛使用的一种
报告基因。利用 GFP 基因检测启动子功能的方法
多采用将其通过农杆菌或基因枪介导法转入植物愈
伤组织和叶片等受体细胞或组织中，荧光显微镜
下观察 GFP 蛋白的表达。但该方法需对转化细胞
进行抗性的初步筛选及PCR和 Southern杂交的再
筛选，才能进一步对GFP蛋白的表达进行检测[7]，
故工作量大，费时耗财，且不利于快速进行下步
实验。洋葱(Allium cepa)表皮细胞结构清晰，取
材方便，是观察细胞部分功能、外源基因瞬时表
达的好材料。对其进行 G F P 基因的转化后，可
在1~2 d内检测出启动子的活性[8]。利用该试材进
行不同逆境培养基和培养条件下逆境诱导型启动子
(如 rd29A 启动子)的活性检测，尚未见报道。
本文将已获得的拟南芥rd29A基因上游的946
bp 的启动子序列[8]与 GFP 基因[9]进行融合，构建
成 rd29A 启动子驱动的 GFP 基因植物表达载体，
采用基因枪介导法，使转化的洋葱表皮细胞在不
同逆境培养基和培养条件下诱导 GFP 基因进行瞬
时表达，检测启动子活性，为进一步构建该启动
子驱动的目的靶基因奠定基础。
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材料与方法
1 试剂
各种限制性内切酶为TaKaRa公司或NEB公司
产品，DNA 回收试剂盒为上海开瑞公司产品，抗
生素为 Sigma 产品，其他为国产分析纯试剂。
2 rd29A启动子和GFP基因
rd29A 启动子和 GFP 基因由亚盛博士后科研
工作站北京分站提供。rd29A 启动子序列见参考
文献 8 ，G F P 基因序列见参考文献 9 ，载体为
pBI121。rd29A替换了pBI121上的35S启动子(记
pBI29A)，GFP 基因替换了pBI121 上的 GUS 基因
(记 pBI35S∷ GFP)。抗性标记为Kanr，宿主菌为
大肠杆菌 D H 5 a。
3 GFP表达载体的构建
根据pBI35S ∷ GFP 和 pBI29A 载体的酶切位
点，对 pBI35S ∷ GFP 和 pBI29A 分别进行 XmaI
和 SacI 双酶切，回收 pBI35S ∷ GFP 的小片段和
pBI29A 的大片段，利用T4 连接酶进行粘端连接，
连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞。转化
细胞在LB固体平板上进行50 mg·mL-1的 Kan筛选
后，再进行PCR 和酶切鉴定，获得pBI29A ∷ GFP
植物表达载体。同时以 CaMV35S 启动子驱动的
GFP 为对照(图 1)。GFP 基因扩增特异性引物序
列为：p 1，5 C G C C C G G G A T G A G T A A A G G -
AGAAGAAC 3；p2，5 CGGAGCTCTTATTATT-
TGTATAGTTCATCC 3。PCR 扩增条件为：94℃
预变性2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90
s，30 个循环；72℃延伸 10 min。rd29A 启动子
扩增特异性引物序列为：p3，5 CGAAGCTTAA-
CGCATGATTTGATGGAGGA 3；p4，5 GCGG-
ATCCCTTTCCAATAGAAGTAATCAAACC 3。 PCR
扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃ 40 s，55℃
45 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸10 min。
图1 pBI29A∷ GFP (A)和 pBI35S∷ GFP (B)的 T-DNA区域示意
4 洋葱表皮细胞培养
切取约2 cm×2 cm的洋葱表皮组织置固体平
板培养基上，28℃弱光下预培养 4~6 h，然后利
用基因枪进行目的基因的转化。固体平板培养基
为 4 类：(1)MS 培养基；(2)MS 培养基附加 0.2
mol·L-1山梨醇和0.2 mol·L-1甘露醇；(3)MS培养基
附加250 和 500 mmol·L-1 NaCl；(4)MS 培养基附
加 15% 和 30% 的 PEG6000。每种处理 2 皿，重
复 3 次。
5 基因枪转化
基因枪转化方法见参考文献10。取钨粉(F 1.2
nm)悬液(60 mg·mL-1) 50 mL，依次加入5 mL质粒
DNA、50 mL 2.5 mol·L-1 CaCl2、20 mL 0.1 mol·L-1
亚精胺，充分混匀后静置10 min，18 000×g离心
5 s，弃上清。加入250 mL无水乙醇振荡3 min，
静置 5 min，18 000×g 离心 5 s，弃上清。加入
60 mL 无水乙醇并悬浮沉淀，每枪取 12 mL 混合
悬液。采用BiolisticÒ PDS-1000/He基因枪进行轰
击，可裂膜片压力为1.1×103 Pa，每皿轰击2次。
转化后材料置 28℃弱光下培养 8 h，然后将培养
基(2)中的 pBI29A∷ GFP和 pBI35S∷ GFP材料各
2皿转至4和37℃下培养8 h，其余继续在28℃弱
光下培养 8 h，然后制片，荧光显微镜下观察。
6 GFP绿色荧光观察
在OLYPUS BX51/BX52 型荧光显微镜下，用
蓝光激发以观察所发出的绿色荧光，利用计算机
拍摄和存贮图象。
实验结果
1 rd29A启动子驱动的GFP植物表达载体的构建
根据pBI35S ∷ GFP 和 pBI29A 载体的酶切位
点，对pBI35S∷ GFP和 pBI29A分别进行XmaI和
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SacI 双酶切，分别回收 pBI29A 载体的 DNA 大片
段(约13 kp)和pBI35S∷GFP目的基因的小片段(约
750 bp)，然后进行载体片段和目的基因片段的重
组连接，替换pBI29A中的GUS基因。pBI29A∷ GFP
重组子分别经XmaI+SacI和HindIII+BamHI双酶切
后，可分别切下约750 bp 的 GFP 片段(图 2)和约
946 bp的rd29A启动子片段(图3)，结合PCR鉴定
结果(图 4、5)，说明 rd29A 启动子驱动的GFP 基
因植物表达载体构建成功。
们使用的 rd29A 启动子与 CaMV35S 启动子一样，
具有启动子的各种作用元件，能够驱动它所调控
的目的基因——GFP基因的表达。而且在山梨醇+
甘露醇、高盐及 PEG6000 培养基上，rd29A 启动
子驱动的GFP 基因的表达量均高于 CaMV35S 启动
子驱动的 G F P 基因的表达量(图 7 )，特别是在
PEG6 0 0 0 培养基上，细胞无破损，绿色荧光强
烈，而在高盐尤其是500 mmol·L-1 的 NaCl培养基
上，尽管细胞中有一定量的荧光蛋白表达，但由
于受到高浓度的钠离子毒害，细胞破损严重(图
8)。上述实验结果表明，该启动子具有高盐和脱
水调控元件，在逆境环境下，可早期瞬时诱导这
些顺式作用元件，从而激活靶基因快速表达，积
累较多的 GFP 蛋白，并且脱水培养基特别是 30%
的 PEG6000 培养基对在洋葱表皮细胞中进行逆境
诱导型启动子的功能检测是十分有效的，但高盐
特别是含500 mmol·L-1 NaCl的培养基则不适宜洋
葱表皮细胞的瞬时表达。
图2 pBI29A∷GFP表达载体的酶切鉴定
M：DN A 分子量标记 V；1：pB I 2 9 A ∷ G F P / X m a I + S a c I。
图3 pBI29A∷GFP表达载体的酶切鉴定
M：DNA 分子量标记 V；1：pBI29A ∷ GFP/Hind Ⅲ +BamHI。
图 4 pBI29A∷ GFP表达载体启动子的PCR鉴定
　　M：DNA 分子量标记 V；1：pBI29A(正对照); 2：pBI121
(负对照); 3~4：pBI29A ∷ GFP 的 PCR 扩增产物；5：水(空
白对照)。
图 5 pBI29A ∷ GFP 表达载体GFP的 PCR 鉴定
　　M：DNA 分子量标记 V；1：pBI35S ∷ GFP(正对照); 2：
pBI121(负对照); 3~6：pBI29A ∷ GFP 的 PCR 扩增产物。
2 不同培养基中rd29A启动子活性的检测
洋葱表皮细胞经基因枪转化rd29A 启动子和
CaMV35S 启动子驱动的 GFP 基因后，在 28℃下
经过16 h 的培养，4种类型培养基中的GFP 基因
均获得表达，即在荧光显微镜下观察到细胞中
GFP基因表达后所产生的绿色荧光(图6)，说明我
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3 不同培养温度下rd29A启动子活性的检测
将培养基MS+0.2 mol·L-1山梨醇+0.2 mol·L-1
甘露醇上的转化材料在28℃下培养8 h 后，再转
入低温(4℃)或高温(37℃)环境下继续培养8 h，然
后观察 G F P 基因的表达情况。结果发现，两种
启动子诱导的 G F P 基因的表达量差异不明显，
rd29A 启动子并未明显促进 GFP 基因的表达，甚
至在有些细胞中，CaMV35S 启动子驱动的 GFP 基
因的表达量高于 rd29A 启动子驱动的 GFP 基因的
表达量(图9)。说明rd29A启动子驱动的靶基因的
瞬时表达受温度影响较小，但其稳定表达是否也
受温度影响较小，尚需进一步研究。
图6 洋葱表皮细胞中的GFP基因在MS培养基上的表达
A：pB I 3 5 S ∷ G F P；b：pB I 2 9 A ∷ G F P。
图7 洋葱表皮细胞中的GFP基因在
不同逆境培养基上的表达
　　a：pBI35S∷GFP在培养基MS+0.2 mol·L-1 甘露醇+0.2 mol·L-1
山梨醇上；b：pBI29A ∷ GFP 在培养基MS+0.2 mol·L-1 甘露醇+
0.2 mol·L-1山梨醇上；c：pBI35S∷GFP在培养基MS+30% PEG6000
上；d：pBI29A ∷ GFP 在培养基MS+30% PEG6000 上；e：pBI35S
∷GFP在培养基MS+250 mmol·L-1 NaCl上；f：pBI29A∷ GFP 在
培养基MS+250 mmol·L-1 NaCl上。
图8 洋葱表皮细胞中的GFP基因在高盐培养基上的表达
图9 洋葱表皮细胞中的GFP基因在不同温度下的表达
　　A：pBI35S ∷ GFP 在 37℃下；b：pBI29A ∷ GFP 在 37℃
下；c：pBI35S ∷ GFP 在 4℃下；d：pBI29A ∷ GFP 在
4℃下。
讨　　论
选择合适的启动子来驱动目的靶基因在转基
因植物中表达已成为植物基因工程研究的热点问题
之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启
动子，从而使靶基因在特定组织或条件下表达，
以利转基因植物的正常生长发育[11~13 ]。拟南芥
rd29A 基因的启动子被认为是干旱、低温和高盐
诱导型启动子[5]，具有低温、高盐和脱水响应元
件(TACCG ACA T)及 ABA 作用元件(保守序列为
ACGT ) [14]，在逆境环境下可促进靶基因大量表
达，从而提高转基因植物的抗逆性，因此，它
已成为抗逆基因工程中首选的启动子。
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将GFP 基因置于含有顺式作用元件的多种序
列或启动子序列的控制下转化细胞，通过分析其
荧光表达的强度，即可判断该顺式作用元件的不
同功能区作用或启动子的强弱和启动方式(组成
型、组织特异型或诱导型等)[15]。我们将 GFP 基
因置于rd29A 基因启动子和CaMV35S 启动子的调
控下，转化洋葱表皮细胞后发现，尽管 rd29A 基
因的启动子具有低温、高盐和脱水响应元件，但
对高盐、脱水和低温逆境的响应程度却有差异。
脱水和高盐环境下，特别是在 30% 的 PEG6000 条
件下，该启动子能强烈诱导目的靶基因 ——GFP
基因的瞬时高效表达，形成大量的绿色荧光蛋
白，但它却对温度环境的响应比较弱。因此，采
用脱水和高盐培养基，特别是 30% 的 PEG6000 培
养基，可以进行逆境诱导型启动子活性的检测。
但使用高盐培养基时，盐浓度不宜过高，因为在
500 mmol·L-1 NaCl 环境下，由于钠离子的毒害，
细胞损伤严重，影响实验结果的观察。
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